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Transplantation Dans le tapis de souris ovarien Fat

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DOI :

10.3791/54444

⸱

7 septembre 2016

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1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un essai de transplantation de pad à la mode ovarienne appropriée pour les études de épithéliums normales et transformées de l'appareil reproducteur féminin. Le coussinet adipeux de la souris permet la transplantation de grands fragments de tissus, est facilement accessible pour la chirurgie et l'imagerie, et fournit l'environnement natif le plus favorable pour les tissus d'origine Müllerian.

Résumé

Les tests de transplantation orthotopique chez la souris sont inestimables pour les études de régénération cellulaire et de transformation néoplasique. Les approches courantes pour la transplantation orthotopique de la surface ovarienne et de l’épithélium tubaire comprennent l’administration intrapéritonéale et intrabursive de cellules. Les limites respectives de ces méthodes comprennent l’emplacement mal défini des cellules injectées et le volume d’espace limité. De plus, ils sont mal adaptés à la préservation structurelle à long terme des organes transplantés. Pour relever ces défis, nous avons développé une approche alternative, basée sur l’introduction de cellules et de fragments de tissu dans le coussinet adipeux de la souris. Le coussinet adipeux ovarien de souris est situé à proximité immédiate de l’ovaire et de la trompe utérine (alias oviducte, trompe de Fallope) et fournit un microenvironnement familier pour les cellules et les tissus de ces organes. Dans notre approche, des cellules de souris et humaines marquées par fluorescence et des fragments du tube utérin sont greffés en utilisant une chirurgie d’incision dorsale peu traumatique. Les cellules transplantées et leurs excroissances sont facilement localisées dans le coussinet adipeux ovarien pendant plus de 40 jours. La transplantation à long terme de l’ensemble de la trompe utérine permet de préserver correctement tous les principaux composants tissulaires et n’entraîne pas d’effets secondaires indésirables, tels que la fibrose et l’inflammation. Notre approche devrait être particulièrement applicable pour répondre à d’importantes questions biologiques telles que la différenciation, le potentiel régénératif et néoplasique de populations cellulaires spécifiques. De plus, il devrait convenir à l’étude des facteurs microenvironnementaux dans le développement normal et le cancer.

Introduction

essais de transplantation, qui impliquent l'introduction de cellules et de tissus dans des sites spécifiques du corps chez la souris, représentent une approche essentielle pour les études de la régénération des tissus et la carcinogenèse. orthotopiques transplantations de cellules, qui est, leur placement dans un milieu autochtone, sont particulièrement importantes pour la caractérisation des cellules souches adultes. L'existence de cellules souches mammaires premier a été suggéré par la transplantation de fragments des glandes mammaires épithéliales mammaires en coussinets adipeux libre glande-de souris 1. PRISE DE GREFFE essais à la graisse souris humanisée pad 2 ont été utilisés pour récapituler le développement potentiel et normal de régénération des cellules épithéliales mammaires humaines primaires. En outre, les transplantations de dilution en série et la limitation des types de cellules phénotypiquement distinctes dans le coussinet adipeux mammaire dégagé étaient cruciales pour tester la capacité d' auto-renouvellement et la différenciation multilignée des cellules souches mammaires 3-5. essais de transplantation dans combination avec lignée génétique traçage a fourni des preuves de la cellule d'origine dans la carcinogenèse mammaire 5. Les transplantations rénales de capsule sont couramment utilisés pour tester les propriétés de cellules souches de la prostate 6 putatif. Transplantation orthotopique de souris normales et néoplasiques et organites pancréatiques humaines a révélé gènes et les voies modifiées dans la progression du cancer 7. L'importance de l'environnement natif a également été soutenu par la démonstration de la régénération après diverse engraftments des glandes sudoripares dans des endroits différents, tels que des tampons mammaires de graisse, épaulettes de graisse et la peau arrière 8.

La cavité péritonéale et la bourse ovarienne sont généralement utilisés comme lieux de transplantation orthotopique de cellules épithéliales du tractus génital féminin 9-12. Ces deux méthodes ont un certain nombre de limitations. L'injection intrapéritonéale de cellules conduit à leurs implantations dans différents domaines de la cavité péritonéale, ce qui complicating surveillance de la croissance cellulaire. En outre, les variations dans le micro-environnement, tels que l'étendue de la vascularisation, l'innervation et la représentation des cellules immunitaires, peuvent être très importantes dans les différentes zones de la cavité péritonéale. La bourse séreuse ovarienne a un volume très limité, ce qui permet l'injection d'au plus 10 pi de liquide. Cela limite considérablement la quantité de cellules qui peuvent être administrées. De plus, les injections dans la bourse ovarienne peut être assez difficile techniquement et la procédure nécessite une quantité importante de temps.

Pour répondre à ces limitations, nous avons tiré profit des propriétés de coussinet adipeux de l'ovaire. L'ovaire coussinet adipeux de la souris a une grande taille, est adjacente à l'ovaire et de la trompe utérine, et est facilement accessible par la chirurgie. Il a été rapporté que trophoblaste équine peut être transplanté dans le tapis de souris de graisse 13 de l' ovaire. Cependant, les détails de cette méthode ne sont pas décrits. Il a également été rapporté pas si cela methode peut être appliqué à des cellules et des tissus adultes. Ici, nous décrivons une méthode fiable pour la transplantation de souris et des cellules humaines du tractus génital féminin et montrent que cette méthode est également applicable à une transplantation d'organe à long terme.

Protocole

Tout le travail in vivo décrit est approuvé par le Comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux de l'Université Cornell.

1. Exemples de préparation pour l'ovaire Fat Pad Assays

  1. Isolement et culture de primaire Tubal épithélium (TE) Cellules
    1. Euthanasier donneur de 6 à 8 semaines d'âge vierge β-actine-Enhanced Green Fluorescent Protein (EFGP) ou Red Fluorescent Protein (DsRed) souris β actine-Discosoma par CO 2 l' administration suivie par dislocation cervicale. Vérifier l'euthanasie réussie par un pincement de l'orteil.
    2. Placez une souris individuelle sur un drap absorbant, ventrale vers le haut, puis essuyez l'abdomen avec 70% d'éthanol. Ouvrir la peau par une incision latérale au niveau de la ligne médiane du corps et du bout des doigts tirer la peau au-dessus et au-dessous de l'incision en direction de la tête et la queue de la souris.
    3. Tenir le péritoine en utilisant une pince contondants et faire une coupe avec des ciseaux fins pour ouvrir la cavité du corps. Poussez doucement la bobine de l'intestine de côté et localiser les organes reproducteurs.
    4. Avec une pince fine ramasser une corne utérine et couper 0,5 cm au-dessus du point où les cornes utérines séparent. Tout en maintenant la corne utérine, disséquer le tissu conjonctif attaché à la corne de l'utérus, trompe utérine, coussinet adipeux de l'ovaire et de l'ovaire. Placer l'appareil reproducteur disséquée dans un plat avec 6 ml stérile saline tamponnée au phosphate (PBS). Procéder à la deuxième appareil reproducteur.
    5. Transférer le plat à une armoire de biosécurité et laver les tissus 3 fois dans 6 ml de PBS stérile. Poursuivre le travail sous un microscope de dissection situé dans l'armoire de biosécurité. Prenez la corne de l'utérus avec une pince fine et déconnecter la corne utérine de la trompe utérine en coupant à la jonction utéro-tubaire. Découpez la bourse ovarienne entourant l'ovaire à l'aide d'une aiguille 25 G.
      Remarque: Après la bourse ovarienne a été supprimé, la dissection est terminée et le tube individuel de l'utérus reste dans la solution PBS.
    6. Transférer un single tube de l'utérus dans une goutte de 50 pi de PBS à un plat de 3,5 cm et émincer en morceaux de 0,1 mm en utilisant 28 aiguilles de calibre. Transfert à 200 pi de tampon de digestion 1 (Modified Medium (DMEM) F12 de Eagle de Dulbecco () du milieu de Ham additionné de 300 unités ml - 1 collagénase et de 100 unités ml - 1 hyaluronidase) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
    7. Après l'incubation, ajouter 1 ml de 0,25% trypsine-Ethylenediaminetetraacetic acide (EDTA) et de suspendre la solution à l'aide d'une pointe de pipette 1 ml (aka pointe bleue) 20 fois pendant 3 minutes. Ajouter 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 de milieu (Ham) contenant 2% de sérum de foetus de bovin.
    8. Collecter des tissus par centrifugation (600 fcr, 5 minutes, température ambiante (TA)) et ajouter un tampon de digestion de 1 ml 2 (DMEM F12 () du milieu de Ham additionné de 7 mg ml -1 dispase II et 10 pg ml - 1 de la désoxyribonucléase I ( désoxyribonucléase I)). Suspendre pastille de tissu 20 fois avec l'aide d'une pipette de 1 ml tip.
    9. Ajouter un milieu complet gratuit 5 ml de sérum de croissance souris épithélium tubaire (M-TE-GM, le tableau 1).
    10. Recueillir les cellules par centrifugation (600 rcf, 5 min, RT). Ajouter 1 ml M-TE-GM, suspendre et compter les cellules par hémocytomètre. Seed 1 x 10 5 cellules dans 1 ml par puits dans une plaque de fixation 24 puits à faible et incuber dans M-TE-GM à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 de 5% pendant 4 jours.
    11. Changer le milieu tous les jours.
    12. Préparer des suspensions de cellules uniques de cellules cultivées en suspension primaire TE à partir de souris ß-actine-EGFP ou β-actine DsRed.
      1. Recueillir des cultures en suspension TE de 24 puits de plaques de fixation faibles. Centrifugeuse (600 fcr, 5 min, RT) et suspendent les culots cellulaires avec 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA. Incuber pendant 10 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%.
      2. Arrêter l'activité de la trypsine en ajoutant 5 ml de DMEM / F12 de moyenne (Ham) contenant 5% de sérum bovin foetal. Recueillir les culots cellulaires par centrifugation (600 fcr, 5 min, RT).
    13. culots cellulaires Laver deux fois avec 4 ml de PBS froid (4 ° C), ajouter 1 ml de PBS par culot cellulaire, et suspendre. Compter les cellules par hémocytomètre et transférer 1,7 ml tubes de centrifugation. Travailler sur la glace, ajouter 1 x 10 5 cellules à 10 pi de PBS, puis ajouter 10 ul matrice de membrane basale. Suspendre et transporter sur de la glace à la salle des animaux.
      Remarque: Effectuer toutes dissection et tissus travaux de culture dans une armoire de biosécurité dans des conditions stériles.
  2. Préparation de Immortalisé Human Cell Line
    1. Cultiver séparément lentivirus EGFP et -mCherry marqué immortalisée surface de l' ovaire lineHIO118 de cellules de l' épithélium humain jusqu'à 80-90% de confluence sur les boîtes de 10 cm à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%.
    2. Laver la vaisselle à deux reprises avec 10 ml de PBS, ajouter 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA par boîte et on incube pendant 10 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Arrêter la réaction en ajoutant 10 ml de DMEM / F12 de moyenne (Ham) contenant 5% de sérum bovin foetal. Collecteculots cellulaires par centrifugation (600 RCF, 5 min, RT).
    3. culots cellulaires Laver deux fois avec 10 ml de PBS froid (4 ° C), ajouter 1 ml de PBS par culot cellulaire, et suspendre. Compter les cellules par hémocytomètre et transférer 1,7 ml tubes de centrifugation.
    4. Travailler sur la glace, ajouter 1,0 x 10 6 cellules Lenti-mCherry marqués + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP étiquetés cellules à 10 ul de PBS. Ajouter 10 ul de la matrice de membrane basale. Suspendre et transporter sur de la glace à la salle des animaux.
  3. Préparation de la trompe utérine
    1. Disséquer tubes utérins individuels de 6 à 8 semaines vieilles souris vierges β-actine-DsRed dans PBS comme décrit dans les étapes 1.1.1-1.1.5. Transférer les trompes utérines uniques dans une goutte 200 ul de PBS sous un microscope de dissection. dérouler doucement trompes utérines à l'aide d'une pince à épiler et 28 des aiguilles de calibre en retirant la mésosalpinx, une partie du ligament large qui supporte les segments de la trompe utérine. Placez trompes utérines spiralées simples dans une goutte de 2PBS 00 ul glacée jusqu'à ovarien coussinet adipeux du destinataire est exposée et prête à recevoir la greffe.

2. ovarien Fat Pad Transplantation

Note: Désinfecter instruments entre chaque chirurgie animale. Préparer et organiser tout le matériel à l'avance. transplantations dorsaux à droite coussinet adipeux de l'ovaire sont préférentiel car cela évite la rate. Cependant, les bénéficiaires peuvent avoir des greffes dans les deux coussinets adipeux ovariens.

  1. Utiliser des souris syngéniques ou déficit immunitaire combiné sévère (SCID / RNC) souris en tant que bénéficiaires de cellules primaires. Pour les cellules humaines, telles que HIO118 cellules / SCID / gamma souris utilisation Nod (NSG) ou des souris SCID.
  2. Anesthésier souris receveuse avec une seule injection intra-péritonéale de 2,2,2-tribromoéthanol à une dose de 0,15 ml / 10 poids corporel g. Placez l'animal sur un coussin chauffant, dans la hotte des animaux et confirmer anesthetization appropriée par la perte de la pédale réflexe (pincement de l'orteil). Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse alors que leanimal est sous anesthésie. Injecter la voie sous-cutanée de l'animal avec le kétoprofène analgésique à une dose de 4 mg / g de poids corporel pour traiter la douleur post-chirurgicale.
    Remarque: Comme alternative, utilisez isoflurane pour l'anesthésie. Placer l'animal dans la chambre d'admission et d'ajuster le débitmètre d'oxygène de 0,8 à 1,5 l / min et le vaporisateur isoflurane à 2-3%. Retirer l'animal anesthésié de la chambre, laissez-le respirer isoflurane à partir d'un masque et régler le débitmètre d'oxygène à 0,4-0,8 L / min et le vaporisateur isoflurane à 1,5%, puis commencer à la chirurgie.
  3. Rasez la zone chirurgicale avec # 40 coupe; enlever les poils d'une zone 2 fois la surface chirurgicale, préparer la peau rasée avec trois gommages antiseptiques de povidone-iode, suivie par 70% d'éthanol, et couvrir d'un drap stérile.
  4. Déplacer l'animal sous un microscope de dissection situé dans une armoire de biosécurité. Exposer l'appareil reproducteur par une incision dans la position dorso directement au-dessus du coussinet adipeux de l'ovaire.
    Remarque: Critétape ical: Precise incision cutanée facilite la cicatrisation des plaies, l'utilisation d'un scalpel est recommandé à l'étape 2.4.
  5. Utiliser une pince fine contondants tirer le coussinet adipeux ovarien soigneusement à travers l'incision vers la ligne médiane, minimisant les dommages aux nerfs et les vaisseaux sanguins principaux.
    Etape critique: En cas de saignement, arrêter la chirurgie et envisager la transplantation d'un animal hôte différent.
  6. Sous le contrôle du microscope de dissection avec l'aide d'une aiguille biseautée de calibre 28 faire un 2-4 mm incision profonde dans le coussinet adipeux de l'ovaire, 3-4 mm au-dessus de l'ovaire.
    étape critique: Assurez-vous que l'incision va seulement à travers la moitié du coussinet adipeux; poinçonnement tout le long de la face inférieure provoque des fuites. Soyez rapide et procéder sans délai après cette étape.
  7. Pour les greffes de cellules, remplir une seringue (aiguille de calibre 30) avec 10-20 ul de la cellule-membrane basale matrice du mélange et injecter dans le pad incision graisse. Pour trompe utérine transplantation, ramasser l'esprit du tube utérinh pince fine et dans 10 - 20 ul matrice de membrane basale conservés dans la glace. L'utilisation d'un pl 0,1-10 / 20 XL diplômé pointe de filtre (raccourci de 3 mm) ramasser le tissu et la membrane basale matrice suspension et la libération dans l'incision de coussinet adipeux.
  8. Attendre 5 minutes pour la matrice de la membrane basale de se solidifier et placer l'appareil reproducteur de retour dans le péritoine. Fermez les muscles avec 2 stiches de suture chirurgicale et la peau avec deux clips de petites plaies ou suture chirurgicale.
  9. Répétez les étapes 2,4-2,8 transplanter une membrane PBS-sol matrice-mélange dans le coussinet adipeux contre-latéral de l'animal qui servira de contrôle.
    étape critique: Après la chirurgie placer l'animal sur un coussin chauffant, parce que la perte de chaleur est rapide chez les souris anesthésiés.
  10. Laissez l'animal récupérer sur un coussin chauffant dans la cage native et d'observer l'animal jusqu'à complètement réveillé de l'anesthésie. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir sternal décubitus. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
  11. Placez une poignée de boulettes de nourriture pré-humides à l'intérieur de la cage, en plus de la nourriture sèche sur la cage après la chirurgie. Appliquer les analgésiques post-chirurgicales en cas de besoin pour les prochains jours et examiner la plaie quotidienne. Appliquer des antibiotiques selon le protocole animal approuvé si l'infection des plaies se produit. Retirer des agrafes 10 jours après la chirurgie lorsque la plaie est complètement fermée.

3. histologie et Image Acquisition

  1. Graft Collection et conservation
    1. Préparer une solution de paraformaldehyde à 4% en mélangeant 26 ml ddH 2 O avec 4 ml de PBS et 10 fois une solution de paraformaldehyde 10 ml de 16%.
    2. Disséquer dans un seul bloc, le tampon entée ovarien de graisse, de l'ovaire, trompe utérine, 0,5 cm utérus comme décrit dans les étapes 1.1.1-1.1.4. Placer immédiatement dans 2 ml 4% de paraformaldéhyde et fixer pendant 2 heures, à la température ambiante. À partir du même animal, disséquer le non grefféecontrolatéral système de coussinet adipeux ovariens transplantés avec le mélange de matrice de la membrane PBS-sous-sol comme un contrôle (voir étape 2.9). Fix et le processus de la même manière.
    3. Après lavage de fixation des tissus trois fois avec du PBS pendant 5 min et incuber pendant la nuit dans du PBS à 4 ° C.
    4. Pour l'ensemble de montage imagerie du coussinet adipeux ovarien passez à l'étape 3.2.1.
      Remarque: Une fois les tissus d'acquisition d'image peuvent être congelés (3.3.1) ou transformés pour l'inclusion en paraffine (3.3.2). incubation d'une nuit dans 30% de saccharose dans du PBS à 4 ° C améliore la qualité des tissus congelés.
  2. Acquisition d'image
    1. Placez l'ensemble du montage des systèmes de coussinet adipeux ovariens dans les plats et image à l'aide d'un microscope inversé PBS rempli équipées de fixation epi-fluorescence et haute définition caméra couleur, avec 4, 10x objectifs, et un stéréomicroscope équipé d'un accessoire de fluorescence, caméra couleur et plan Apo 1xWD70, objectifs plan d'ED 1.5xWD45.
  3. Histologie
    1. Suivanttoute-mount acquisition d'image (3.2.1) placer une goutte 200-500 pi de milieu d'inclusion pour les spécimens de tissus congelés sur un morceau de film de laboratoire et en utilisant une pince 2 x 1 cm, transférer le tissu à la baisse. Décrochez le film à un bord et transférer la chute de tissu-milieu à un ml flacon cryogénique 1.8. Fermez le flacon et plonger dans l'azote liquide. Stocker les tissus congelés à -80 ° C.
    2. Vous pouvez également procéder à l'enrobage de paraffine standard. Utilisez 20-40 volumes de volume de tissu pour chaque étape.
      1. Immergez tissus une fois dans 65% d'éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante.
      2. Immergez tissus une fois dans 70% d'éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. A ce stade, les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs mois à température ambiante.
      3. Immergez tissus une fois dans 90% d'éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante.
      4. Immergez tissus une fois dans 95% d'éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante.
      5. Immergez tissus à deux reprises dans l'éthanol absolu (200 preuve) pendant 30 min, en secouant doucement à la température ambiante.
      6. Immerger les tissus à deux reprises dans le chloroforme pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante.
      7. Immergez tissus une fois dans de la paraffine pendant 30 minutes, en agitant doucement à 58 ° C.
      8. Immergez tissus une fois dans de la paraffine pendant 12 heures, en secouant doucement à 58 ° C.
      9. Immergez tissus une fois dans de la paraffine pendant 3 heures, à 58 ° C.
      10. Placez les tissus dans des moules d'histologie métalliques et remplir les moules avec 58 ° C de la paraffine. Ajouter une cassette d'histologie plastique sur le dessus de la paraffine et refroidir la paraffine à +4 ° C. Extraire le bloc de paraffine tissus et conserver à la température ambiante.
        Note: la température de la paraffine ne doit pas dépasser 58 ° C pour une conservation optimale du tissu approprié pour la coloration immunohistochimique.
    3. Vous pouvez également préparer à la Embedding Paraffine avec Gel de traitement des échantillons.
      1. Aspirer le PBS et transférer les tissus entiers monture à 70% d'éthanol. Incuber à température ambiante pendant 2 h. Dans un bain d'eau, spécimen de préchauffage traitement gel à 60 ° C.
      2. Pipette 200 ul du gel de traitement des échantillons sur une boîte de Pétri laboratoire film doublé. Utilisation de fines pinces à dissection transférer l'ensemble de montage système de tissu à la chute de gel de traitement des échantillons.
      3. Laisser le bouchon de gel de traitement des échantillons se solidifier à la température ambiante, ou solidifier le bouchon pendant 10 min à 4 ° C.
      4. Placer le gel de traitement des échantillons de tissu incorporé dans des cassettes de tissus histologiques sandwich entre coussins en mousse de biopsie. Incluez dans de la paraffine comme dans les étapes 3.3.2-3.3.2.10.
        Remarque: Spécimen traitement plongement de gel empêche la perte et permet la conservation des petits échantillons de tissus fragiles.
        Note: Les tissus conservés par congélation ou de la paraffine plongement conviennent pour la coloration immunohistochimique 14,15.

Résultats

Les cellules et les tissus expérimentaux peuvent être transplantés avec précision dans le coussinet adipeux de l' ovaire sous un microscope de dissection (figure 1). Les exemples comprennent les souris primaires des cellules de l' épithélium des trompes dérivées de souris exprimant de façon ubiquitaire EGFP (figure 2A) ou DsRed (figure 2B) et les cellules humaines immortalisées de la surface de l' ovaire de l' épithélium HIO118 16,17 cellules marquées par mCherry et EGFP lentivirus (figure 2C - F). Cette approche est également applicable pour la transplantation à long terme des organes, tels que le tube de l' utérus de la souris (figure 3). Selon la coloration immunohistochimique, tant ciliées (FOXJ1 positif 14) et sécrétoires (PAX8 positif 15) , les cellules sont conservées dans l'épithélium tubaire des tissus transplantés (Figure 3D et E).

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Figure 1: ovarien Pad Fat Transplantation (A) Surface exposée de la transplantation (flèche).. (B) Une incision est faite par une aiguille 28 G (flèche). (C) UT / sous - sol de la matrice de membrane mélange greffe par pointe de la pipette (flèche). (D) UT entée (flèche, rouge vif, UT de souris-DsRed β-actine). FP, coussinet adipeux; Ov, de l'ovaire; UT, trompe utérine. Barre d' échelle = 2 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2:. Détection de transplanté souris primaires cellules Tubal épithélium et humaines immortalisées surface ovarien cellules épithéliales (A, B) Out croissances de souris primaire des cellules de l' épithélium des trompes (flèches) de souris β-actine-EGFP (A, vert) et la ß-actine DsRed (B, rouge) 8 jours après la transplantation dans une souris syngénique. (C, D) Engraftments de cellules mixtes HIO118 (flèches) marquées avec soit Lenti-EGFP (vert) ou Lenti-mCherry (rouge) 10 jours après la transplantation chez des souris NSG. (D) de la zone élargie de (C, flèche). (E, F) développée Graft 43 jours après la transplantation des mêmes cellules que dans C, D à la souris SCID (flèches). AD, F, fluorescence; E, champ lumineux, FP, coussinet adipeux; Ov, de l'ovaire; UT, trompe utérine. (A, B, DF) Barre d'échelle = 500 pm; (C) Barre d' échelle = 1.600 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3: Caractérisation de l' utérus Tube Transplant. (A) trompe utérine complète (flèche) de la β-actine-DsRed souris 6 jours après la transplantation dans le coussinet adipeux de l' ovaire (flèche, rouge vif). (B) extemporané fluorescente du coussinet adipeux avec la greffe montré dans (A). Rouge, DsRed; Bleu, 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), contre-coloration nucléaire. (C) greffé tube utérins (flèche) 40 jours après la transplantation dans la souris receveuse GSN (flèche). section Paraffine. Noter la bonne conservation de tous les composants principaux du tube de l'utérus, et l'absence de fibrose et de l'inflammation associée à une transplantation. Hématoxyline et éosine. (D, E) Détection des marqueurs de l' épithélium tubaire-box Couplé gène 8 (PAX8) et Forkhead boîte J1 (FOXJ1; couleur nucléaire brun, pointes de flèches) dans les cellules du greffon (flèches) figurant dans ( C). système immunoperoxydase. Effectuer une contre avec le vert de méthyle. FP, coussinet adipeux; Ov, de l'ovaire; UT, trompe utérine. (A) Barre d'échelle = 1000 pm; (B) Barre d'échelle = 200 um; (CE) Barre d' échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Composant 1x DMEM F12 (Ham)
L-Glutamine 2 mM
pruvate de sodium 1 mM
le facteur de croissance épidermique 10 ng ml - 1
Base de facteur 2 de croissance des fibroblastes 10 ng ml - 1
hydrocortisone 500 ng ml - 1
Insuline 5 pg ml - 1
Transferrin 5 pg ml - 1
Le sélénite de sodium 5 ng ml - 1
albumine bovine 0,10%
Pénicilline / Streptomycine 100 unités ml -1/100 ug ml - 1
Milieu de Eagle (MEM) acides aminés non essentiels minimales essentielles 0,1 mM
Le bêta-mercaptoéthanol 10 -4 M

Tableau 1:. Souris Tubal Epithelim croissance moyenne (M-TE-GM) Composants répertoriés dans la colonne de gauche sont dissous dans 1x DMEM F12 de moyenne (Ham) aux concentrations indiquées, la colonne de droite. La composition du milieu final est exempt de sérum.

Discussion

Nous avons établi un essai de transplantation de coussinet adipeux ovarien qui permet la livraison précise et la détection des cellules et des tissus épithéliaux. Le coussinet adipeux procédure test de transplantation ovarienne est techniquement moins difficile que l' injection intrabursale 10-12 et permet une plus uniforme et localisation précise des cellules transplantées par rapport à l' injection intrapéritonéale 9. Il est également bien adapté pour la transplantation à long terme d'un organe entier, tel que le tube de l'utérus.

Fait important, le coussinet adipeux de l'ovaire fournit un microenvironnement familier pour les épithéliums du système reproducteur féminin. Il devrait être particulièrement adapté à l'étude des propriétés moléculaires et cellulaires de l'ovaire humain et de souris et de cellules de l'épithélium tubaire pendant la régénération et la transformation maligne. Contrairement à d'autres organes, peu d'études se sont concentrées sur l'identification et la caractérisation de cellules souches dans l'épithélium de la femelle rtractus 18,19 procréation correspondent. De telles études sont d' une importance particulière parce que de nombreux cancers sont censés provenir de cellules souches adultes 20. Origines Pourtant cellulaires de cancers épithéliaux de l' ovaire restent très discutables 18. Cancers de l' ovaire épithéliales représentent la majorité des cancers de l' ovaire et est en 5e place parmi tous les décès liés au cancer des femmes aux États - Unis 21. Ainsi , le développement d'un test orthotopique avec plusieurs avantages par rapport aux techniques de transplantation existantes 9-12 devrait grandement faciliter les études dans ce domaine.

Compte tenu de l'emplacement superficiel du coussinet adipeux de l'ovaire, de petits systèmes d'imagerie animale peuvent être utilisés pour le suivi de engraftments marqué avec une forte fluorescent ou reporters bioluminescentes. Il devrait également être possible d'établir à haute résolution en direct des tests d'imagerie minimalement invasives, telles que la microscopie non-linéaire 22. Le coussinet adipeux de l'ovaire peut également être conservé dans des cultures d'organes, permettre ainsition de la culture tridimensionnelle de l'épithélium normal et néoplasique dans des conditions étroitement récapitulant l'organisation des cellules et la matrice extracellulaire. Les études futures devraient répondre à ces possibilités prometteuses.

Plusieurs étapes critiques doivent être considérées. Fournir un coussin chauffant et de garder les rongeurs au chaud pendant la chirurgie améliore considérablement le taux de survie. Stérilité des instruments de manipulation du coussinet adipeux assure que les systèmes greffées sont maintenus stériles. Dans notre expérience, les résultats de saignements importants en retard de greffes de croissance. Fait important, la graisse pad incision doit être faite précisément parce que déchirer le coussinet adipeux ou perforer par des causes de saignement. Coagulants doivent être utilisés pour arrêter le saignement si nécessaire. Si engraftments ne se développent pas, une concentration plus élevée de cellules injectées doit être envisagée. Les premières excroissances réussies peuvent être observées dès une semaine après la transplantation et le plus engraftments devrait être visible unemois après la procédure. Pour la transplantation, les aiguilles de plus grand diamètre (23-25 ​​G) peuvent être utilisés pour empêcher le cisaillement de grandes cellules (plus de 10 m de diamètre). Cependant, de telles aiguilles peuvent être plus traumatisante pour le coussinet adipeux et leur utilisation devrait être testé à l'avance. Pour nos expériences, nous avons utilisé des souris âgées donateurs et bénéficiaires 6 à 8 semaines. Pour les deux fins des souris plus jeunes ou plus âgés peuvent être utilisés. Cependant, le nombre de cellules injectées peut devoir être ajustée. La petite taille des coussinets adipeux de l'ovaire chez les donneurs plus jeunes devront également être pris en considération.

Comme avec toutes les méthodes, il y a certaines limites de la souris graisse ovarien test pad de transplantation. Bien que les souris immunocompétentes syngéniques peuvent être utilisés pour murins cellules / tissus primaires, notre technique nécessite GSN ou SCID pour la transplantation de matériel humain. Il est probable possible d'humaniser le coussinet adipeux pour soutenir la croissance des cellules épithéliales humaines. Cependant, nous avons pas encore testé cette approche. L'utilisation de moins de Feles hommes peuvent conduire à des coûts de reproduction inférieurs; Cependant, des souris femelles vierges matures (âgées de 8 à 10 semaines) ont un coussinet adipeux plus grande, ce qui permet la transplantation d'échantillons plus grands. Enfin, le personnel de laboratoire devraient être formés à la chirurgie des animaux pour assurer l'exécution réussie et opportune de la procédure.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center, pour fournir les cellules humaines HIO118. Ces études ont été soutenues par les subventions du Programme de cellules souches New York (NYSTEM; T028095) et les Instituts nationaux de la santé / Institut national de la santé de l'enfant et du développement humain (P50HD076210) à l'APN, et par les subventions de NYSTEM (C028125, C024174 et T028095), national Institutes of / Institut national de santé du cancer (CA182413) et le Fonds de l'ovaire Cancer Research (327516) à AYN.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille de calibre 25BD Becton Dickinson305122
aiguille de calibre 28 (seringue hypodermique avec aiguille attachée)Kendall30339Numéro de pièce : 8881500014
facteur de croissance des fibroblastes de base-2Sigma-AldrichF9786
(Geltrex)InvitrogenA1413202
&beta ;-actin-DsSourisLe laboratoire Jackson6051B6. souris Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J
&beta ;-actin-EGFPThe Jackson Laboratory3291C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J
&beta ;-mercaptoéthanolSigma-AldrichM7522
albumine bovineSigma-AldrichA3311
chloroformeVWREM-CX1058-1
collagénase/hyaluronidaseCellule souche Technologies7912
flacons cryogéniquesThermo Scientific Nunc377267
dispase IIWorthingtonNPRO2
DMEM F12 (HAM’s)Corning10-092-CV
DNaseI (Deoxyribonuclease I)Stem Cell Technologies7900
milieu d’enrobage pour échantillons de tissus congelés (O. C. T.)Sakura Finetek  ;4583
facteur de croissance épidermiqueSigma-AldrichE4127
éthanol 200 proofKoptecV1001pour préparer 70 %  ;
sérum fœtal bovinSigmaF4135
pointe filtrante 0.1-10/20 µ ; l XL  ;USA Scientific1120-3810
Anticorps FOXJ1eBioscienceE10109-1632utilisé à une concentration de 1:1 000 (sans démasquage)
hydrocortisoneSigmaH0135
KetoprofenZoetis4396H
film de laboratoire (Parafilm M)American National CanPM-999
L-GlutamineCorning25-005-Cl
insuline-transferine-sélénite sodiqueSigma-AldrichI884
isoflurane, 250 mlSanta Cruz Santé animalesc-363629Rx
plaque d’attache basse 24-puitsCostar3473
MEM acides aminés non essentielsCorning25-025-Cl
moules d’histologie des métauxMicroscopie électronique SciencesMicroscope 62527-22
, microscope inverséNikonEclipse TS 100
, souris stéréoNikonSMZ800
Nod/SCID/gamma (NSG)The Jackson Laboratory05557NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ
solution de paraformaldéhyde à 16 %Microscopie électronique Sciences15710
paraffine (Paraplast, X-TRA)Fisher Thermo Scientific23-021-401
Anticorps PAX8Proteintech10336-1-APutilisé à une concentration de 1:1 000 (sans démasquage)
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)Corning  ; 21-030-CV
pénicilline streptomycineCorning30-002-Cl
immunodéficience combinée sévère (SCID/NCr) souris, contexte BALB/C)NCI-Frederick Animal Production Program01S11
pyruvate de sodiumCorning25-000-Cl
gel de traitement d’échantillons (HISTOGEL)Richard-Allan ScientificHG-4000-012
saccharoseSigma-AldrichS0389
Trypsine-EDTA, 25 %Corning25-053-Cl
Matrice de membrane basale rouges

Références

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