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Article de méthode

Péritonite aiguë du côlon chez le rat - un modèle animal simple et réalisable pour induire une insuffisance rénale aiguë septique

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DOI :

10.3791/54448

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15 février 2022

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1Department of General, Visceral, Transplantation, Vascular and Paediatric Surgery, Department of Surgery I, University of Würzburg, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Medical Center-University of Freiburg, 3Faculty of Medicine, University of Freiburg, 4Department of Internal Medicine I, Division of Nephrology, University of Würzburg, 5Department of Physiology and Pharmacology, West Virginia University School of Medicine, Robert C. Byrd Health Science Center, 6Department of Anesthesiology and Intensive Care Medicine, Robert-Bosch-Krankenhaus

Dans cet article

Résumé

L’insuffisance rénale aiguë (IRA) est une complication grave chez les patients gravement malades et est liée à une mortalité accrue. Ici, nous présentons un modèle in vivo fiable et reproductible pour imiter l’IRA dans des conditions inflammatoires qui pourrait contribuer à comprendre la pathogenèse de l’IRA septique.

Résumé

L’IRA chez les patients septiques est associée à une mortalité accrue et à de mauvais pronostics, malgré des efforts majeurs pour affiner la compréhension de sa physiopathologie. Ici, un modèle in vivo est présenté qui combine un foyer septique standardisé pour induire une IRA et une configuration de soins intensifs (USI) pour fournir une surveillance hémodynamique avancée et un traitement comparable à celui du sepsis humain. La septicémie est induite par une péritonite standardisée du colon ascendant (sCASP). L’IRA est étudiée fonctionnellement par la mesure d’échantillons de sang et d’urine ainsi que sur l’histologie par l’évaluation des scores histopathologiques. De plus, la surveillance hémodynamique avancée et la possibilité d’un prélèvement répétitif des gaz du sang permettent une analyse différenciée de la gravité du sepsis induit.

La méthode sCASP est une méthode standardisée, fiable et reproductible pour induire l’IRA septique. La configuration des soins intensifs, la surveillance hémodynamique et des échanges gazeux en continu, le faible taux de mortalité ainsi que la possibilité d’analyses détaillées de la fonction rénale et des déficiences sont des avantages de cette configuration. Par conséquent, la méthode décrite peut servir de nouvelle norme pour les investigations expérimentales de l’IRA septique.

Introduction

La septicémie reste la principale cause de décès dans les unités de soins intensifs non cardiaques (USI), avec des taux de mortalité de ≈ 30 à 50 %1,2,3. Une caractéristique de la septicémie sévère et du choc septique est l’insuffisance rénale aiguë qui entraîne une augmentation supplémentaire du taux de mortalité lorsqu’elle est associée à un dysfonctionnement d’organes distants tel que l’insuffisance cardiaque et respiratoire 4,5,6. L’incidence globale de l’IRA chez les patients en soins intensifs varie de 20 à 50 %7. Malgré le rôle central de l’IRA dans l’issue et la mortalité dans le sepsis, le mécanisme pathologique sous-jacent est encore mal compris.

Dans l’ensemble, il y a les 3 composants principaux : l’inflammation, les lésions toxiques et les changements hémodynamiques qui contribuent au développement de l’IRA7. Les modifications hémodynamiques englobent la réduction du débit sanguin rénal (RBF) et l’ischémie rénale globale ou régionale. Ici, il faut tenir compte du fait que le sepsis peut également entraîner une altération de la microcirculation rénale due à une hypotension systémique et/ou à une perturbation de la barrière endothéliale8. Par conséquent, l’étude de l’IRA septique doit toujours inclure une surveillance hémodynamique. Des études in vivo récentes sur l’IRA ont utilisé principalement des modèles animaux tels que l’ischémie-reperfusion rénale, les lésions ou la néphrectomie bilatérale. Ces études ont généralement montré un manque de surveillance hémodynamique et de soins intensifs.

L’étude de nouveaux mécanismes pathologiques et de thérapies potentielles de l’IRA septique nécessite un modèle in vivo avec un foyer septique défini, une configuration de soins intensifs, un résultat prévisible et une lésion d’organe 9,10,11,12. Nous décrivons ici un modèle innovant de rongeur pour l’IRA septique qui répond aux exigences mentionnées ci-dessus. L’IRA septique est induite par une péritonite standardisée du colon ascendant (sCASP). Le modèle sCASP utilisé provoque une septicémie abdominale par une fuite fécale intestinale conduisant à une invasion bactérienne et à une défaillance multiviscérale13. Il a été démontré que les changements physiopathologiques après le CASP sont similaires à ceux du sepsis humain et représentent donc un modèle cliniquement pertinent dans la recherche sur le sepsis11,14.

De plus, une configuration de soins intensifs (USI) comprenant une surveillance hémodynamique avancée et une thérapie en soins intensifs est établie dans le protocole expérimental. La configuration de l’unité de soins intensifs permet la réanimation liquidienne, l’application d’analgésie par voie intraveineuse et l’analyse répétitive des gaz du sang. La fonction rénale est évaluée par la mesure de valeurs standard telles que la créatinine et par la clairance de l’inuline et de l’acide p-aminohippurique (HAP). Des informations supplémentaires sont fournies par les scores pathohistologiques des tissus et des organes prélevés à la fin de l’expérience. Le modèle sCASP pour induire l’IRA septique est déjà évalué et a révélé de nouvelles connaissances en pathologie rénale15. Une application plus poussée de ce protocole présenté ci-dessous pourrait aider à affiner la compréhension de l’IRA septique.

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Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de laboratoire du district d’Unterfranken, en Allemagne, et exécutées conformément à la Déclaration d’Helsinki.

1. Préparation chirurgicale et mise en place d’une surveillance invasive et d’une médication continue

  1. Anesthésier des rats Sprague-Dawley à l’aide d’isoflurane administré par un vaporisateur de précision à une concentration et à un débit approuvés par l’organisme de surveillance de la recherche animale de l’établissement local et/ou l’équipe vétérinaire. Confirmez la profondeur adéquate de l’anesthésie en observant le rythme respiratoire, qui devient plus lent et plus profond, et vérifiez l’absence de réponse après un pincement de la queue ou des orteils. Rasez la gorge et le ventre avec un rasoir.
    Note: Une réduction massive de la fréquence respiratoire peut être un indicateur d’une surdose d’anesthésie et entraîner une bradypnée, une hypotension et finalement la mort.
  2. Placez le rat en position couchée sur un coussin chauffant. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour éviter que les yeux ne se dessèchent. Maintenir la profondeur appropriée de l’anesthésique à l’aide de la concentration et du débit d’isoflurane en fonction de la surveillance peropératoire du rat et/ou des recommandations de l’organisme de surveillance de la recherche animale et/ou de l’équipe vétérinaire de l’établissement local. Placez le rat en position couchée sur un coussin chauffant automatisé.
    Remarque : L’hypothermie et les lésions thermiques influencent les paramètres macro et microhémodynamiques et doivent être évitées pour obtenir un résultat fiable. Il est recommandé d’utiliser un coussin chauffant avec un mécanisme de contrôle relié au rat par une sonde rectale flexible pour maintenir la température corporelle dans la plage physiologique.
  3. Après avoir désinfecté le cou et la gorge avec la solution désinfectante appropriée, incisez la peau de la gorge médiale avec un scalpel et faites une incision d’environ 2 cm. Retournez le rat et effectuez une incision d’environ 1 cm avec des ciseaux chirurgicaux sur le cou à environ 1 cm distal de l’occiput.
  4. Remettez le rat en position couchée. Disséquez doucement la veine jugulaire droite et l’artère carotide gauche à l’aide des ciseaux et des cotons-tiges. Disséquez les récipients des structures voisines. Évitez trop de traînée et préparez-vous davantage avec des mouvements d’étalement soigneux.
    Note: Gardez les récipients toujours humides par l’application d’une solution saline stérile préchauffée.
  5. Disséquez doucement et avec des mouvements sous-cutanés des vaisseaux vers le cou pour obtenir une connexion entre les deux incisions. Insérez les pinces dans chaque tunnel formé.
  6. Rincez l’émerillon et les cathéters, provenant de l’appareil pivotant, avec 0,9 % de NaCl. Insérez les cathéters dans un ressort en acier inoxydable.
    Note: Les cathéters doivent être rincés avec du chlorure de sodium avant d’être insérés, car une application minimale d’air peut entraîner une mort subite due à une embolie gazeuse.
  7. Tournez le rat et clampez les cathéters à l’aide des pinces insérées. Faites glisser les cathéters du cou vers la gorge. Fixez le ressort à l’aide d’une sangle à bouton en plastique à environ 1 cm distal de l’occiput avec 6 sutures singulières (par exemple 4/0) sur le cou.
  8. Replacez le rat en position couchée. Posez des fils de coton d’environ 4 cm distaux et proximaux à chaque récipient préparé. Coupez l’artère proximale à l’aide d’un micro-clip, généralement utilisé pour couper les anévrismes sous-arachnoïdiens. Vous pouvez également laisser le clip et arrêter le flux sanguin artériel en serrant l’un des fils.
  9. Incisez l’artère avec des micro-ciseaux chirurgicaux, maintenez l’incision ouverte avec un crochet dans une main et insérez le cathéter artériel dans le vaisseau à l’aide d’une pince avec l’autre main. Ouvrez le clip ou le fil tiré, poussez le cathéter d’environ 1 cm vers l’avant dans le vaisseau vers le cœur et fixez-le avec des nœuds chirurgicaux à l’aide des fils de coton posés.
  10. Répétez l’étape 1.8 sur la veine jugulaire et laissez le clip, car la veine n’est pas aussi solide que l’artère.
  11. Après avoir fixé les deux cathéters en ligne droite dans les vaisseaux, fermez la plaie sur la gorge avec des sutures.

2. Procédure sCASP

  1. Gardez le rat en position couchée, rasez l’abdomen et désinfectez la région abdominale avec les solutions de désinfection appropriées.
    Note: Utilisez toujours une technique aseptique.
  2. Effectuez une incision abdominale médiane de la peau d’environ 2 cm de long avec des ciseaux chirurgicaux, puis à nouveau le long de la ligne blanche pour ouvrir la caverne péritonéale.
  3. Identifiez le pôle cæcal et retirez-le doucement à l’aide de cotons-tiges.
  4. Percez le côlon ascendant à environ 2 cm distal de la valve iléo-caïcale avec une suture (6/0) [suture 1] du côté anti-mésentérique et fixez-le avec deux nœuds chirurgicaux. Évitez les lésions des vaisseaux du côlon.
  5. Coupez l’extrémité distale - environ 1,5 cm - d’un cathéter d’aspiration 10 FR. Coupez ce morceau du cathéter avec les ciseaux pour former un rabat rectangulaire d’une longueur d’environ 0,5 cm. Préparez le lambeau avec une suture (6/0) [suture 2] au milieu du lambeau.
  6. Placez le lambeau sur une aiguille 14G et percez le côlon ascendant avec l’aiguille où la suture 1 était fixée15.
  7. Insérez le tube en plastique préparé dans le côlon au-dessus de l’aiguille. Retirez simultanément l’aiguille doucement. Positionnez le tube de manière à ce que le rabat se trouve à l’extérieur du côlon et le reste du tube à l’intérieur du côlon.
    1. Après le positionnement exact du tube en plastique, fixez le lambeau avec la suture 2 déjà existante en cousant la paroi colique et les nœuds chirurgicaux. Evitez à nouveau toute lésion des vaisseaux du côlon. Placez les extrémités libres de la suture 1 autour du reste du tube en plastique qui mène à l’extérieur du côlon et effectuez 2 nœuds chirurgicaux.
  8. Trayez les selles du cæcum vers le stent colique à l’aide de cotons-tiges jusqu’à ce que les selles apparaissent à la sortie du stent.
  9. Remettez l’intestin grêle et le côlon dans la caverne abdominale. Ainsi, le tube en plastique avec les selles doit être en contact avec le péritoine. Rincer l’endoprothèse avec 2 mL de NaCl à 0,9 % pour répartir les matières fécales dans la caverne péritonéale.
  10. Fermez la cavité abdominale avec une suture continue (4/0) du péritoine et ensuite avec une suture continue (4/0) de la peau.

3. Procédure postopératoire

  1. Arrêtez l’inhalation d’isoflurane et remettez le rat dans sa cage.
  2. Commencer l’analgésie intraveineuse par voie veineuse à l’aide de fentanyl (2,0 μg/100 g de poids corporel/h).

4. Préparation des mesures le deuxième jour

  1. 24 h après l’intervention sCASP, appliquer 0,5 à 1,0 mg de midazolam par voie intraveineuse. Maintenir la profondeur appropriée de l’anesthésique à l’aide de la concentration et du débit d’isoflurane en fonction de la surveillance peropératoire du rat et/ou des recommandations de l’organisme de surveillance de la recherche animale et/ou de l’équipe vétérinaire de l’établissement local.
  2. Après avoir désinfecté à nouveau avec de l’alcool et de la solution, effectuez une trachéotomie avec le tube en plastique d’une canule veineuse de 14 G pour fournir une oxygénation et une ventilation suffisantes.
    1. Par conséquent, ouvrez la suture de la gorge avec des ciseaux chirurgicaux et ouvrez-la doucement de la ligne médiane à la trachée. Incisez la trachée verticalement entre deux cartilages d’une longueur d’environ 2 mm avec des ciseaux chirurgicaux - juste assez pour insérer des ciseaux chirurgicaux. Élargissez brusquement l’incision à environ la moitié du diamètre de la trachée avec les ciseaux. Insérez 1 cm d’un tube en plastique de 14 G et fixez-le avec 2 sutures. 16
      Note: Si l’incision de la trachée est plus grande que la moitié de la circonférence, les vaisseaux qui longent la trachée peuvent être endommagés, ce qui entraîne une hémorragie grave, une aspiration sanguine ou une bradycardie mortelle.
    2. Commencer la ventilation mécanique à l’aide d’un ventilateur pour rongeurs avec un FiO2 de 0,28 et 0,7 % Vol. d’isoflurane et commencer l’anesthésie intraveineuse avec du midazolam (0,7 mg/100 g p.c./h) et du fentanyl (7 μg/100 g p.c./h). Effectuer des analyses des gaz du sang pour assurer une ventilation et une oxygénation suffisantes. Par conséquent, prélevez environ 0,7 ml de sang par le cathéter artériel et mesurez-le avec un analyseur de gaz sanguins.
      Note: L’anesthésie intraveineuse ne doit commencer que si la ventilation contrôlée mécaniquement est établie.
  3. Après avoir rasé et désinfecté de la même manière qu’en 2.1, effectuez une incision longitudinale de 1 cm de la peau de la jambe droite à 0,5 cm proximal du genou. Disséquez l’artère des structures voisines à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de cotons-tiges sans ménagement.
    Note: En cas de déchirure de l’artère fémorale, l’insertion d’un cathéter en position proximale est toujours possible. Ainsi, il est recommandé de commencer l’implantation le plus loin possible vers le distal.
  4. Insérez un cathéter de thermodilution dans l’artère fémorale en ouvrant l’artère avec un crochet et en insérant le cathéter avec une pince.
  5. Commencez à mesurer le débit cardiaque par méthode de thermodilution. Par conséquent, perfuser rapidement 1 mL de NaCl réfrigéré manuellement via le cathéter veineux après avoir commencé la mesure d’un logiciel de mesure de l’indice cardiaque. Effectuez cette mesure deux fois.

5. Évaluation de la fonction rénale

  1. Effectuez une laparotomie en ouvrant les sutures de la peau et du péritoine avec des ciseaux. Incisez la vessie avec des ciseaux chirurgicaux juste assez pour la cathétériser avec un petit cathéter en plastique. Après avoir posé un fil de coton d’environ 7 cm autour de la vessie, fixez le fil, fixez le cathéter avec des nœuds et enfin recueillez autant d’urine que possible via le cathéter.
  2. Dissoudre la fluorescéine-isothiocyanate-inuline (FITC-Inulin) dans 0,9 % de NaCl et le sel de sodium de l’acide p-aminohippurique (HAP) dans 0,9 % de NaCl pour obtenir des concentrations de 2 mg/mL d’inuline, 5 mg/mL de HAP.
  3. Appliquer un bolus d’un mélange des deux substances de 75 μL i.v., suivi d’une perfusion intraveineuse constante des deux substances à un débit de 3,7 μL/h/300 g p.c.
  4. Après avoir atteint un état d’équilibre17 avec la perfusion de FITC-Inuline et d’HAP, recueillir l’urine pendant 20 min. Prélever des échantillons de sang par cathéter artériel comme décrit à la section 4.2.1 concernant l’analyse des gaz du sang.
  5. Déterminer les concentrations d’inuline dans l’urine et le plasma par spectrométrie de fluorescence et mesurer les HAP par photospectrométrie à l’aide de la méthode anthrone17.

6. Fin des expériences

  1. Euthanasier l’animal conformément aux réglementations légales locales.
  2. Prélevez autant de sang que possible par le cathéter artériel à l’aide de seringues.
  3. Récoltez l’intestin grêle et le gros intestin en coupant la fixation péritonéale du duodénum et du côlon, retirez certaines parties de ceux-ci à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Préparez et récoltez les reins en préparant le rétropéritonéal et libérez-les de leur capsule graisseuse et coupez à travers l’uretère et les vaisseaux attachés. Effectuez une thoracotomie et coupez les poumons et le cœur. Fixez tous les organes dans du formaldéhyde et effectuez les colorations histologiques comme précédemment publié. 15,18

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Résultats

Comme précédemment publié par Schick et al.8, nous démontrons les résultats suivants.

Induction de la septicémie sans mortalité
Dans le modèle CASP, la septicémie est induite par une fuite continue de bactéries localisées intraluminales du côlon qui monte dans la cavité abdominale, entraînant une péritonite fécale et une bactériémie. Ainsi, la taille du cathéter implanté régule la prod...

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Discussion

La physiopathologie de l’IRA septique reste encore inconnue dans sa complexité. La recherche clinique et les essais sur les patients ne permettront pas d’acquérir de nouvelles connaissances en ce qui concerne les modifications histopathologiques, les perturbations de la microcirculation ou les interactions médicamenteuses aux niveaux cellulaires15. Il a été postulé précédemment qu’il est nécessaire de disposer de modèles animaux améliorés et nouveaux pour étudier ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

M.A. Schick et N. Schlegel ont reçu des fonds de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SCHL 1962/2-1 et SCHL 1962/4-1.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Rats de Sprague-DawleyJanvier Labs, France
  ; Isoflurane CPcp-pharma, Burgdorf, Allemagne
Cathéter en polyéthylène PE 10 ; 30mA. Hartenstein, Wuerzburg, Allemagne0.58x0.96 mm
Pivotant (375/D/20)Instech, Plymouth Meeting, PA, USA(375/D/20)
Attaches à boutons en plastiqueInstech, Plymouth Meeting, PA, USALW105S
PerfusorB. Braun ; Melsungen, AllemagnePerfusor fm
cathéter d’aspiration ch. 10B.Braun Melsungen AG, Allemagnecathéter d’aspiration typy " Idéal" ; ch. 10
sutureSyneture ; États-UnisSurgipro ; Suture monofilament polypropylène 4-0
Ethicon ; ÉcosseProlène ; Polypropylène 5-0
14G-i.v. cathéterBD Insynte ; BD Vialon ; Madrid; Espagne14GA i.v. cathéter
cotons-tigesNOBA Verbandmittel Danz GmbH u Co KG ; Wetter; Allemagne
respirateur contre les rongeursHugo Sachs Elektronik KG, Allemagnerespirateur contre les rongeurs, Type :7025
MidazolamRatiopharm, AllemagneMidazolam
ThermodilutioncatheterADInstruments, Spechbach, Allemagne
acide p-aminohippuriqueSigma-Aldrich ; Saint-Louis ; sel ; A3759-25G
InulinSigma-Aldrich ; Saint-Louis ; États-UnisInulin-FITC ; F3272-1G
FormaldéhydeOtto Fischar GmbH & CoKG ; Saarbrü ; cken, AllemagneFormaldéhyde 3,5 %
CyclopentanMerck ; Darmstadt; AllemagneUvasol : Gommage à base d’alcool 2-méthylbutan
Schü ; lke & Mayr GmbH, Norderstedt ; Allemagnekodan Tinktur forte ; 45g 2-Propanol, 10g 1-Propanol pour 100g
de solution de povidone iodéeB.Braun Melsungen AG, AllemagneBraunol, 7,5g de povidone iode pour 100g
de sodium de l’acide p-aminohippurique des États-Unis

Références

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