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Article de méthode

Micromodelage et l'Assemblée des microvaisseaux 3D

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DOI :

10.3791/54457

⸱

9 septembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit présente un procédé de moulage par injection pour concevoir des microvaisseaux qui récapitulent les propriétés physiologiques de l'endothélium. Le procédé à base microfluidique crée des réseaux vasculaires 3D de brevet avec conditions, adaptable telles que le débit, la composition cellulaire, la géométrie, et les gradients biochimiques. Le procédé de fabrication et des exemples d'applications possibles sont décrites.

Résumé

Dans les plates - formes in vitro pour étudier les cellules endothéliales et la biologie vasculaire sont largement limitées à 2D culture de cellules endothéliales, l' écoulement des chambres avec un polymère ou des substrats de verre à base, et des essais de formation de tube à base d' hydrogel. Ces essais, tandis que d'information, ne récapitulent la géométrie lumière, matrice extracellulaire appropriée, et la proximité multi-cellulaire, qui jouent un rôle clé dans la modulation de la fonction vasculaire. Ce manuscrit décrit un procédé de moulage par injection pour produire des navires d'ingénierie avec des diamètres de l'ordre de 100 um. Microvaisseaux sont fabriqués par ensemencement des cellules endothéliales dans un canal microfluidique intégré dans un type natif du collagène hydrogel. En incorporant des cellules parenchymales dans la matrice de collagène avant la formation de canal, des micro-environnements spécifiques de tissus peuvent être modélisés et étudiés. modulations supplémentaires de propriétés et les médias hydrodynamique composition permettent un contrôle de la fonction vasculaire complexe dans le microenvironnement désiré.Cette plate-forme permet l'étude du recrutement de cellules périvasculaires, des interactions de sang endothélium, la réponse de l'écoulement, et les interactions avec les tissus microvasculaire. microvaisseaux Engineered offrent la possibilité d'isoler l'influence des composants individuels d'une niche vasculaire et de contrôler précisément ses produits chimiques, et des propriétés biologiques mécaniques pour étudier la biologie vasculaire à la fois la santé et de la maladie.

Introduction

La microvascularisation dans chaque organe contribue à définir le microenvironnement des tissus, maintenir l' homéostasie tissulaire et régulent l' inflammation, la perméabilité, la thrombose, et de la fibrinolyse 1,2. Endothelium microvasculaire, en particulier, est l'interface entre le débit sanguin et le tissu environnant et donc joue un rôle essentiel dans la modulation de la fonction vasculaire et de l' organe en réponse à des stimuli tels que les forces hydrodynamiques et les cytokines et les hormones circulantes 3 ​​- 5. La compréhension des interactions entre les détails de l'endothélium, le sang et le tissu environnant microenvironnement est importante pour l'étude de la biologie vasculaire et la progression de la maladie. Cependant, les progrès dans l' étude de ces interactions a été entravée par limitées dans les outils in vitro qui ne récapitulent pas dans la structure microvasculaire vivo et fonctionnent 6,7. En conséquence, le champ et le progrès thérapeutique a beaucoup compté sur coûteuse et longueconsommant des modèles animaux qui ne parviennent pas souvent à traduire le succès chez les humains 8 - 10. Alors que les modèles in vivo sont précieux dans l'étude des mécanismes de la maladie et les fonctions vasculaires, elles sont complexes et manquent de contrôle précis de l' individu cellulaire, biochimique, et les indices biophysiques souvent.

Vascularisation dans tout le corps possède une structure hiérarchique d' âge mûr en conjonction avec des lits capillaires expansives, fournissant perfusion optimisée et le transport des nutriments simultanément 11. Dans un premier temps , les formes de vascularisation comme un plexus primitif qui réorganise à un réseau hiérarchisé ramifié au début du développement 12,13. Bien que plusieurs des signaux impliqués dans ces processus sont bien compris 14 - 16, il reste insaisissable comment une telle structuration vasculaire est déterminé 15. À son tour, récapitulant ce processus in vitro pour concevoir des réseaux vasculaires organisés a been. De nombreuses plates - formes existantes difficiles in vitro pour modéliser le système vasculaire, par exemple deux cultures de cellules endothéliales dimensions, manquent des caractéristiques importantes telles que la proximité multicellulaire, la géométrie en trois dimensions luminale, le débit et la matrice extracellulaire. Tube essais de formation en hydrogels 3D (collagène ou fibrine) 17 - 19 ou invasion des dosages 20,21 ont été utilisés pour étudier la fonction endothéliale en 3D et leurs interactions avec d' autres vasculaires 17,22 ou de cellules de tissu types 23. Cependant, assemblés lumens dans ces tests manquent interconnectivité, flux hémodynamique, et la perfusion appropriée. En outre, la tendance à la régression vasculaire dans ces tubes 24 empêche la formation des essais de culture à long terme et la maturation qui limite le degré d'études fonctionnelles qui peuvent être exécutées. Par conséquent, il est nécessaire de concevoir des plates - formes bourgeonnante in vitro des réseaux microvasculaires capable de modéliser de façon appropriée enendothéliales caractéristiques et sont capables de la culture à long terme.

Une variété de techniques d'ingénierie vasculaires ont émergé au fil des ans pour des applications médicales pour remplacer ou bypass touchés vaisseaux chez les patients atteints de maladies vasculaires. Les navires de grand diamètre fabriqués à partir de matériaux synthétiques tels que le polyéthylène téréphtalate (PET), et le polytétrafluoroéthylène (ePTFE) ont eu un succès thérapeutique considérable avec une longue perméabilité à long terme (moyenne 95% patence plus de 5 ans) 25. Bien que les greffes synthétiques de petit diamètre (<6 mm) généralement face à des complications telles que l' hyperplasie intimale et thrombopoïèse 26 - 28, ingénierie tissulaire greffes de petit diamètre réalisés avec du matériel biologique ont fait des progrès significatifs 29,30. Malgré les progrès de ce genre, les navires d'ingénierie sur le micrométrique sont restés un défi. Pour modéliser correctement le système microvasculaire, il est nécessaire de générer des configurations de réseau complexes avec sufficient résistance mécanique pour maintenir la perméabilité et avec une composition de matrice qui permet la perméation des nutriments pour les cellules parenchymateuses et le remodelage cellulaire.

Ce protocole présente une nouvelle artificielle réseau de vaisseaux perfusable qui imite un natif in vivo de réglage avec un paramètre ajustable et contrôlable microenvironnement 31-34. La méthode décrite génère microvaisseaux conçu avec des diamètres de l'ordre de 100 um. microvaisseaux d'ingénierie sont fabriqués par perfuser les cellules endothéliales à travers un canal microfluidique qui est incorporé dans le type doux collagène hydrogel. Ce système a la capacité de générer des réseaux modelées avec une structure luminale ouverte, reproduire les interactions multicellulaires, moduler la composition de la matrice extracellulaire, et appliquer des forces hémodynamiques physiologiquement pertinents.

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Protocole

1. microfabrication de Patterned Polydiméthylsiloxane (PDMS) avec Design Network

  1. Wafer Fabrication Création d' un modèle négatif de la conception de réseau
    1. Créer un modèle de réseau en utilisant toute conception (CAO) assistée par ordinateur. Assurez-vous que la dimension diagonale entre l'entrée et la sortie correspond à la distance entre les entrée et de sortie des réservoirs sur les dispositifs de logement dans les étapes à venir (voir 2.1.1).
      Remarque: La conception du modèle lui - même est fonction personnalisée sur les objectifs de recherche spécifiques de l'utilisateur (voir la figure 1 , par exemple , les modèles).
    2. Générer un masque du motif de réseau en utilisant l'impression haute résolution ou commander un photomasque chrome à partir d'un fournisseur commercial. Un protocole plus détaillé du processus de photolithographie est disponible ailleurs 35.
    3. Nettoyer une tranche de 8 "de silicium pendant 5 min à 100 W avec un traitement au plasma d'oxygène.
    4. Verser suffisamment photorésist négatif (SU-8Fonctionne bien 2,100) sur la plaquette de telle sorte que la forme d'une cuillerée resist avec un diamètre de 2,5 cm. En utilisant une tournette, tourner la tranche à 500 rpm avec 100 tr / sec rampe et maintenir pendant 10 secondes. Puis rampe jusqu'à 1600 tours par minute à 300 tours par minute / seconde et maintenir pendant 30 secondes. Note: La vitesse et la rampe doivent être optimisés pour chaque condition de laboratoire pour obtenir une épaisseur de réserve de 150 um.
    5. Soft-cuire la plaquette à 65 ° C pendant 7 min, rampe jusqu'à 95 ° C à 360 ° C / h, et maintenir pendant 45 min. refroidir lentement jusqu'à la température ambiante sur la plaque chauffante. Mentions légales le modèle de navire sur la plaquette revêtue par une exposition à 365 nm lumière UV sous un photomasque de chrome, avec une exposition triple de celui de la recommandation du fabricant (350 mJ / cm 2 pour une épaisseur SU-8 de l' ordre de 150 um).
      Note: Depuis SU-8 est un résist négatif, les régions exposées (tout sauf le design pattern) deviendront insolubles pour le développeur à l'étape 1.1.7.
    6. Hard-cuire la tranche exposée à 65° C pendant 5 min et rampe jusqu'à 95 ° C à 360 ° C / h et maintenir pendant 25 min, puis le laisser refroidir lentement à la température ambiante sur la plaque chauffante.
    7. Immerger la plaquette dans SU-8 développeur pendant 10 - 15 min pour laver non impressionnées résister, puis nettoyer avec de l'alcool isopropylique et sec sous un courant d'azote comprimé. Inspectez le motif sous un microscope optique pour assurer la SU-8 resist est bien lié à la plaquette (chercher épluchage et des bulles indésirables).
    8. Mesurer l'épaisseur des caractéristiques de motif à l' aide d' un profilomètre selon les instructions du fabricant 36. Lors de l' acquisition de mesure, d' éviter les régions de la structure qui sont essentiels pour le fonctionnement du réseau (c. -à- conduits d'entrée et de sortie) sous forme d' un profilomètre de contact à base susceptible de compromettre l'intégrité structurelle des éléments à motifs sur la plaquette. Vous pouvez également utiliser une méthode non-contact (c. -à- profilomètre optique) d'éviter complètement ce problème.
  2. Genération de Patterned et plat Moules pour Collagène Molding
    Remarque: Manipulez silanes dans une hotte chimique.
    1. Placer la plaquette dans un dessicateur avec 100 ul de trichloro (3,3,3-trifluoropropyl) silane pendant 2 h à silaniser la surface.
    2. Transfert plaquette silanisé dans une boîte de Pétri carrée de 120 x 120 mm. Verser l'agent mélangé et dégazé PDMS élastomère et de durcissement (10: 1 rapport p / p) sur la tranche pour atteindre 4 - 6 mm d'épaisseur. Verser PDMS supplémentaires dans un 120 x 120 mm carré Petri plat séparé pour générer des moules plats sans motifs. Cure à 65 ° C pendant 2 heures.
    3. Retirer du four et laisser PDMS refroidir à température ambiante. L'utilisation d'un scalpel découpez soigneusement un carré autour de la SU-8 et pelez lentement le moule PDMS de la plaquette. Coupez les bords de 30 mm x 30 mm. Pour des moules plats, coupe guéri PDMS sans un motif imprimé en morceaux carrés d'environ 40 mm x 40 mm.

Dispositifs de logement 2.

  1. fabrication de Haut et Bas Logement Pieces
    1. Fabriquer des corps de récipient à l'aide du poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA). Pour fabriquer, commander les pièces d'un magasin de machine standard avec commande numérique par ordinateur (CNC) capacités de fraisage. Voir la figure 1 pour une vue schématique des pièces supérieure et inférieure.
    2. La conception de la pièce supérieure de boîtier (figure 1D) pour inclure une 20 mm x 20 mm et sur ​​le côté inférieur du dispositif à une profondeur de 1 mm, deux orifices d'injection de collagène (4 mm de diamètre) sur la partie supérieure du dispositif situé au niveau des coins du puits carré, deux réservoirs d'entrée et de sortie avec 6 mm de diamètre, et quatre trous de vis (diamètre 3 mm) aux quatre coins de l'appareil.
      Remarque: Des trous supplémentaires peuvent être percés à la périphérie de la pièce à des fins de manipulation.
    3. Concevoir le bas morceau de logement (figure 1E) pour inclure un trou carré au milieu (dimensions 15 mm x 15 mm) avec autour de 25 mm x 25 mmétagère avec une profondeur de 0,25 mm. Percer 4 trous de vis avec 4-40 fil. Vérifiez que les trous de vis dans la partie inférieure et supérieure des pièces seront alignés ensemble lors des prochaines étapes de montage.

3. microvaisseaux Dispositif de fabrication

  1. Préparation des matériaux
    1. Laver et autoclave deux ensembles de pinces, une spatule en acier inoxydable, un petit tournevis plat, vis en acier inoxydable, et plusieurs goupilles de positionnement en acier inoxydable. Pour la fabrication des récipients, dans un autoclave aussi PDMS microélectrodes moules PDMS carrés plats, des lamelles de verre (22 x 22 mm), et des morceaux de coton.
    2. Stériliser les pièces de logement PMMA dans l'eau de Javel pendant au moins 1 h, puis rincer à l'eau autoclavée dans la hotte de culture de tissus à deux reprises, et laisser sécher à l'air dans des boîtes de culture de tissu stérile (150 mm x 25 mm).
  2. Stérile polyéthylèneimine-glutaraldéhyde (PEI - GA) Revêtement
    1. Traiter les puits intérieurs des morceaux stérilisés PMMA secsavec du plasma pendant environ 1 min. Ajouter 1% polyéthylèneimine (PEI) sur les puits internes (les 20 mm carré et sur le dessus et le plateau carré de 25 mm sur le fond) des pièces de PMMA pour 10 min. Rinçage stérile avec H 2 O et laisser sécher sous la hotte de culture tissulaire.
      Remarque: Le temps nécessaire pour le traitement de plasma est variable en fonction de l'appareil utilisé - le PEI doit se propager facilement indiquant une surface hydrophile. Dans le cas contraire, le traitement par plasma supplémentaire peut être nécessaire.
    2. Appliquer 0,1% de glutaraldéhyde (GA) sur PEI surfaces traitées des pièces de PMMA pendant 30 min. Rincer deux fois avec de l'eau stérile et laisser sécher.
      Remarque: Dans les prochaines étapes, le collagène va adhérer à la surface revêtue par collagène glutaraldéhyde réticulation. Cela permet de sécuriser le gel en place dans le dispositif lors des prochaines étapes de montage et pendant toute la période de culture de l'appareil.
  3. Collagène Gel Préparation
    1. Fabriquez navires utilisant 0,6% - 1% de collagènesolutions. Pour 0,75% de collagène pour cuve de fabrication, le type mélange collagène solution mère (1,5% - isolé de rat queues 37) avec de l' hydroxyde de sodium (NaOH), 10x médias Supplément (M199), et les milieux de culture cellulaire. Gardez toutes les solutions sur la glace.
    2. Déterminer le volume de collagène par l'équation suivante, où V ƒinal est le volume final de gel nécessaire (typiquement, 1 ml de collagène par appareil est suffisante), V stocks collagène est le volume de stock de collagène nécessaire, stock de C collagène est la concentration du stock de collagène, le collagène et C est la concentration désirée du collagène dans le vaisseau.
      figure-protocol-1
    3. Utiliser une seringue de 1 ml pour transférer le volume approprié de stock collagène à un nouveau 30 ml tube conique. Déterminer les volumes de NaOH neutralisant (NaOH V), supplément de milieu M199 10x(V 10 X), et des milieux de culture cellulaire (V 1 X) comme suit et mélanger séparément dans un tube conique de 15 ml:
      figure-protocol-2
    4. Ajouter le mélange de réactifs neutralisants (V 10 X, NaOH V, V 1 X) au collagène aliquoté, et d' utiliser une petite spatule pour mélanger doucement la solution jusqu'à ce qu'un gel homogène. Évitez d'introduire des bulles en agitant lentement et doucement.
    5. Pour incorporer les cellules dans la matrice à la concentration souhaitée (par exemple, 0,5 - 20 millions de cellules / ml), ajouter les cellules à la solution de collagène après son mélange avec les réactifs de neutralisation, et continuer à mélanger jusqu'à ce que les cellules sont réparties de façon homogène.
    6. Lorsque les cellules sont ajoutés, ajuster le volume du milieu de culture cellulaire pour recevoir le volume additionnel, tel que déterminé par l'équation suivante, dans laquelle les cellules V </ sub> est le volume requis de la suspension cellulaire, C densité cellulaire ƒinal est la densité désirée de cellules dans le récipient, la densité cellulaire de la suspension C est la densité des cellules dans la solution mère.
      figure-protocol-3
  4. Collagène Injection - Top Piece
    1. Placer le moule PDMS microélectrodes dans un 100 mm mm plat x 20. Plasma nettoyer le moule PDMS pendant 1 min.
    2. Aligner la pièce de PMMA haut sur ​​le dessus du moule PDMS de sorte que les réservoirs carrés sur le moule sont directement sous entrée et de sortie des réservoirs (voir la figure 1D - lignes en pointillés). Placez les goupilles en acier inoxydable dans l'entrée et la sortie des trous réservoir sur la pièce de PMMA supérieure pour maintenir un accès clair à partir des réservoirs à motif.
    3. Utiliser une seringue de 1 ml pour extraire ~ de 0,5 à 0,6 ml de collagène. Veiller à ce que l'absence de bulles restent dans la seringue.
    4. Appuyez lightly avec des pincettes sur le boîtier supérieur pour assurer au ras contact entre la pièce supérieure et le moule PDMS. Injecter collagène lentement à travers un orifice d'injection sur la pièce de PMMA supérieure. Vérifiez que le collagène remplit dans le domaine x 20 mm 20 mm au-dessus du motif et ne fuit pas.
    5. Fermez le plat sans bousculer les goujons et laisser gélifier dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min.
  5. Collagène Injection - Piece Bottom
    1. Placer une lamelle couvre-objet en verre de 22 x 22 mm dans le centre de la pièce de fond. Utiliser une seringue de 1 ml pour distribuer ~ 0,25 ml de collagène uniformément sur la lame de verre. Abaissez doucement le PDMS carré plat sur le collagène, en veillant à la PDMS est à plat contre le PMMA et il n'y a pas de bulles piégées. Laisser gélifier à 37 ° C pendant 30 min.
  6. Assemblée de l' appareil
    1. Après la gélification, ajouter suffisamment de PBS autour de la pièce PDMS à plat sur la pièce de fond pour entourer le PDMS (environ 1 ml). Utilisez des pinces pour enlever tout excess collagène autour des bords, et lentement décoller la pièce PDMS. Ajouter plus de PBS sur le dessus du collagène pour maintenir l'hydratation.
    2. Pour préparer la pièce supérieure, utiliser des pinces pour ramasser la pièce de PMMA haut et retournez-le de telle sorte que le moule PDMS est sur le dessus. Ajouter quelques gouttes de PBS à l'interface, puis rapidement et retirez fermement le moule PDMS de la pièce de PMMA supérieure.
    3. Retirez délicatement inoxydable goupilles en acier de l'autre côté du boîtier PMMA en utilisant une autre paire de pinces. Ajouter plusieurs gouttes d'PBS sur le collagène microélectrodes. Retournez la pièce supérieure PMMA sur de sorte que le collagène fait face vers le bas et placer 4 vis dans les trous de coin.
    4. Déposer délicatement la pièce supérieure sur le dessus de la pièce de fond, en alignant les vis avec les trous d'angle sur la pièce de fond. Ne pas laisser les deux parties de coulisser les uns contre les autres. Utilisez un tournevis pour serrer les vis à l'aide d'une touche de douceur. Ne pas trop serrer.
    5. Aspirer le PBS entourant les surfaces de PMMA et placer une petite piece du coton sous un bord de l'appareil. En utilisant une pipette, retirer tout PBS dans les réservoirs et les remplacer par des milieux de culture cellulaire. Permettre au dispositif de se gélifier ensemble dans un incubateur à 37 ° C pendant au moins 1 h.
  7. cellule semis
    1. Les cellules de culture humaines de la veine ombilicale endothéliales (HUVEC) dans les milieux de croissance endothélial à 37 ° C (CO 2, O 2) à la confluence 38. Chaque fois que possible, utiliser entre les passages 4 et 7.
    2. Trypsiniser les cellules endothéliales par lavage du flacon de culture avec 6 ml de PBS, puis en ajoutant 2 ml de trypsine à 0,05% à 37 ° C pour dissocier les cellules. Laissez les cellules dans trypsine jusqu'à ce que la plupart des adhérences focales ont détaché et les cellules sont arrondies (cela prend habituellement environ 2 - 3 min). Arrêter la réaction de la trypsine en ajoutant 4 ml de milieu de croissance endothélial contenant du sérum de fœtus bovin (FBS). Laver le ballon avec les médias plusieurs fois pour s'assurer que les cellules sont détachées du flacon et recueillirdans un tube conique.
    3. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et leur remise en suspension à une densité de 10 millions de cellules par ml. Retirez tous les milieux de culture cellulaire à partir de l'entrée et de sortie des réservoirs. En utilisant une pointe de chargement de gel de 200 ul, ajouter 10 pl de suspension cellulaire dans le centre du réservoir d'entrée. Les cellules devraient commencer à circuler dans le réseau immédiatement et enrober le réseau.
    4. Ajouter 200 pi médias également aux deux réservoirs et laisser les cellules se fixent et se propagent dans le réseau pendant au moins 1 h.
  8. Culture Device
    1. La culture de l'appareil avec écoulement par gravité au travers du réseau en ajoutant 200 ul de milieu de culture cellulaire dans le réservoir d'entrée et de 50 ul vers le réservoir de sortie. Avec cette méthode de culture, remplacer tous les médias 12 h pour maintenir la viabilité endothéliale.
      Remarque: Si les conditions de culture d'écoulement continu sont souhaitables (pour maintenir la contrainte de cisaillement constante, collecter des médias à la sortie, etc.) un syrpompe inge peut être utilisé à la place de la gravité conduit la culture.
    2. Laisser les cellules endothéliales ensemencées au moins 24 h pour fixer et stabiliser avant d'appliquer le flux continu. Avant l'installation en flux continu, maintenir les dispositifs avec des conditions d'écoulement par gravité entraîné.
      NOTE: Les conditions des médias pour l'écoulement appliquée diffèrent de la gravité conduit la culture. L'addition d'un succédané de plasma, tel que le dextran, les médias stabilise les microvaisseaux modifiés et empêche un collapsus vasculaire au cours de la perfusion continue 39.
    3. Pour rendre les médias pour la configuration en flux continu, dissoudre 3,5% Dextran (70 kDa) dans des milieux de croissance de l'endothélium pour la culture des vaisseaux optimal. En utilisant une technique stérile, remplir 10 ml seringues avec des milieux de croissance endothéliale avec 3,5% de dextran.
    4. Préparer un plat de culture stérile pour l'écoulement par fusion des trous dans la paroi latérale d'une boîte de Pétri en utilisant un fer à souder.
    5. Attacher 12 "tube de silicium (1/32" ID) à un raccord de verrouillage Luer (femelle, 1/16 "ID), et un 1 /16 "connecteur droit tube-tube avec un 1« segment de tube sur l'autre extrémité. Insérez une "aiguille émoussée 20G (détaché du moyeu d'aiguille) à l'extrémité libre de la 1" 1/4 segment. Préparez également un «segment 3 de tube relié à un 90 ° joint de raccord coudé tube-tube (pour être monté dans l'entrée du logement). Dans les étapes suivantes, le tube plus long sera enfilée dans le plat préparé et attaché à la 3 «segment par l'aiguille 20 G. tuyau de sortie doit refléter la tubulure d'entrée, avec une extrémité libre au lieu d'un couplage de verrouillage Luer. Autoclave tous les segments avant de les utiliser.
    6. Enfilez entrée autoclavé et tubes de sortie à travers des trous dans le plat préparé. Fixer 3 "segments à intérieurs 20 G aiguilles. Fixer l'accouplement de verrouillage Luer à la seringue remplie médias et perfuser les médias à travers le tube en utilisant la pompe à seringue fixée à un débit élevé. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles dans le tube ou les connecteurs, car ceux-ci pour empêcher l'écoulement du navire.
    7. Insérez le connector conjointe dans l'entrée du logement. Régler la pompe à seringue pour le débit désiré et commencer la perfusion.
      NOTE: Ce peut être ajustée en fonction de la géométrie de la cuve et les conditions expérimentales de contraintes de cisaillement appliquées. Pour un canal de 100 um de diamètre, un taux de 3 ul / min fonctionne bien.
    8. Si on le désire, recueillir perfusat avec un tube de sortie préparé inséré dans un 5 ml polystyrène stérile tubes à fond rond contenant 500 ul de milieu.
      Remarque: Une petite quantité de milieu est ajouté dans le tube collecteur pour empêcher la formation de bulles qui peut bloquer l'écoulement.
    9. Selon le débit, la seringue peut avoir besoin d'être rechargés après 24-36 h. Cela se fait en retirant le connecteur de l'entrée du boîtier, en remplacement de la seringue, et permettant à des médias pour perfuser à un débit élevé pendant plusieurs minutes. Cette séquence assure que les bulles ne sont pas introduits dans le tube. Réinitialiser la pompe au débit souhaité pour la culture, insérez le connecteur dans l'entrée du boîtier, etretourner à l'incubateur.

4. Analyse de périphérique

  1. Analyse Perméabilité
    1. Utiliser 40 kDa Dextran-FITC pour visualiser la perméabilité du récipient in situ. Placer le corps de récipient sur un microscope confocal et de se concentrer au niveau du plan de la cuve. Ajouter 5 uM 40 kDa FITC-Dextran à l'entrée et de l'image au grossissement 4X, 25 msec temps d'exposition, et à 1 trame par seconde pendant 10 min.
    2. Analyser la série d'images avec le code d'analyse pour évaluer la perméabilité de Dextran à travers la paroi du vaisseau en collagène (um / s) sur la base d' un modèle publié par Zheng et al. al. , 31.
  2. Analyse immunocoloration et imagerie confocale
    1. Pour fixer les navires, perfuser avec 3,7% de formaldéhyde par l'entrée pendant 20 min et lavage en perfusant PBS trois fois (20 min par lavage). Bloquer la liaison non spécifique d'anticorps avec 2% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 0,5% de Triton X-100 EHrfused à travers le réseau pendant 1 h. Perfuser solutions d'anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C et laver trois fois avec du PBS. Perfuser des solutions d'anticorps secondaire pendant 1 - 2 h et on lave à nouveau avec du PBS de la même manière.
    2. Prendre des images immunofluorescence de microvaisseaux in situ en utilisant un microscope confocal avec un z-étape de 1 pm. Image microvaisseaux à un grossissement de 4X, 10X, ou 20X.
      Note: Grossissement de 4X fournira de l' information globale de la structure du réseau, tandis que 10X et 20X images grossies fournir des détails cellulaires tels que l' allongement, la formation de jonction, etc.
    3. Analyser les piles d'images en utilisant ImageJ avec des projections Z (image / Piles / Z-projet), des sections transversales (image / vue Stacks / Orthogonal) et reconstructions 3D (image / Stacks / Projet 3D).
  3. Microscopie électronique à balayage Imaging
    1. Pour l' analyse par microscopie électronique, la fixation in situ par perfusion d'une demi-force de sol de Karnovskyution (paraformaldehyde à 2% / 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate 0,2 M) pendant une nuit. Démonter le navire et séparer soigneusement les deux pièces. Couper les bords et immerger complètement dans la solution de fixateur pendant plusieurs jours.
    2. Immerger la partie supérieure épaisse du navire dans 25% de glutaraldéhyde pendant 20 minutes et rincer trois fois avec du PBS (2 min chacun). Déshydrater dans les lavages à l'éthanol en série de 50%, 70%, 85% (2 minutes chacun) et deux lavages à l'éthanol à 100% (5 min à chaque fois).
    3. Préparer l'échantillon à analyser avec une déshydratation par séchage au point critique suivant le protocole du fabricant 40. Pulvérisez cathodiquement le récipient avec de l'or-palladium (7 nm) et d'analyser sous un microscope électronique à balayage avec une tension d'accélération de 5 kV, la taille du spot 3.

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Résultats

La plate - forme de vaisseau d' ingénierie crée microvascularisation fonctionnelle intégrée dans un type de collagène naturel I matrice et permet un contrôle serré de l'environnement cellulaire, biophysique et biochimique in vitro. Pour fabriquer microvaisseaux d'ingénierie, les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) sont perfusés par l'intermédiaire du réseau microfluidique de collagène embarqué où ils se fixent pour former une lumière de ...

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Discussion

Microvaisseaux modifiés sont un modèle in vitro , où les caractéristiques physiologiques telles que la géométrie luminale, les forces hydrodynamiques et les interactions multicellulaires sont présents et accordable. Ce type de plate - forme est puissante en ce qu'elle offre la possibilité de modéliser et d' étudier le comportement de l' endothélium dans une variété de contextes où les conditions de culture in vitro dans peut être adaptée à celle du microenvironnement en question. Par exempl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Lynn et Mike Garvey Laboratoire d'imagerie à l'Institut des cellules souches et médecine régénérative ainsi que la facilité de Washington nanofabrication à l'Université de Washington. Ils reconnaissent également le soutien financier de l'Institut national de la santé accorde DP2DK102258 (à YZ), et la formation accorde T32EB001650 (à SSK et MAR) et T32HL007312 (MAR).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Wafer Fabrication
AutoGlow Plasma SystemAutoGlow
Headway Spin CoaterHeadway Research, Inc  ;PWM32 Spin Coater  ;
ABM Aligneur de contactAB-M
Alpha Step ProfilomètreTencorAlpha Step 200
SU-8 DéveloppeurMicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
8" plaquette de siliciumWafer World Inc.
Générateur de micro-motifs de tableHeidelberg Instruments&mu ; PG 101Pour la génération de photomasque
Plaque chauffanteVWR97042-646
Alcool ispropyliqueAvantor Performance Matériaux9088
Boîtes de Pétri (120 x 120 mm, carrées)Sigma-AldrichZ617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silaneSigma-AldrichMKBG3805V
Base élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) et agent de durcissementDow CorningSylgard 184Mixte à 10:1 (p/p)
Dessiccateur sous videSigma-AldrichZ119024-1EA
FourVWR9120976
Device Fabrication and Culture
poly(methyl methacrylate) (PMMA)Plexiglas
Corona TreaterProduits Electro-Technic, Inc.BD-20Appareil portable pour le traitement au plasma des dispositifs PMMA et des moules PDMS
Fer à souderWeller  ;WTCPS
Vis mécanique fendue à tête de treillis en acier inoxydableMcMaster-Carr  ;91785A096
Goupilles en acier inoxydableMcMaster-Carr  ;93600A060
Pince à épiler  ;Miltex24-572Toute pince à épiler similaire peut être utilisée
Spatule (Micro Cuillère)Services de microscopie électronique62410-01
TournevisN’importe quel tournevis à tête plate peut être utilisé, autoclavé
Lamelles en verre (22 x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
Eau de JavelClorox4460030966
boîtes de Pétri (150 x 25 mm)430599Corning
(100 x 20 mm)Corning2909
Coton, coupé en morceauxPolyéthylène autoclavé
(PEI)Sigma-AldrichP3143Diluer à 1 % dans de l’eau de culture cellulaire
GlutaraldéhydeSigma-AldrichG6257Diluer à 0,1 % dans de l’eau
de culture cellulaireCollagène stérile H2OAutoclavé DI H2O
de type I, dissous dans de l’acideIsolé à partir de queues de rat comme décrit dans Rajan et. al. 2006 (ref #37)
Seringue de 1 mlBD309659
seringue de 10 mlBD309604
tubes coniques de 15 mlCorning352097
Tubes coniques de 30 mlCorning352098
M199 10x Media  ;Life Technologies11825-015
1 N NaOH (stérile)Sigma-Aldrich415413Diluer à 1 N dans de l’eau de qualité culture cellulaire
HUVECsLonza
Milieu de croissance endothélialeLonzaCC-3124
TrypsinCorning25-052-CI
Sérum fœtal bovin (FBS)Thermofisher Scientific10082147
Dextran de Leuconostoc spp. (70  ; kDa)Sigma-Aldrich31390
Saline tamponnée au phosphate (PBS)Hémocytomètre Corning21-031-CV
Hausser Scientific Co.3200
Embouts de chargement de gelVWR37001-152
18 G Aiguille de remplissage émousséBD  ;305180
Aiguille de distribution en acier inoxydable de 20 gMcMaster-Carr75165A123
Tygon 1/32" ID, 3/32 » OD Tube en siliconeCole-ParmerEW-95702-00
1/16 » Raccord tube-à-tubeMcMaster-Carr5116K165
90° ; Connecteurs coudés, tube à tubeMcMaster-Carr5121K901
Accouplement Luer Lock (femelle, 1/16" ID)McMaster-Carr51525K211
Pince en plastique, avec mâchoires Services demicroscopie électronique72971
Pompe à seringue doubleHarvard Apparatus70-4505
5 ml Tube à fond rond en polystyrèneFisher Scientific14-959-2A
Device Analysis
FormaldéhydeSigma-AldrichF8775
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA8806-5G
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
Lapin anti-hCD31Abcamab32457dilution
de travail 1:25FITC conjugué anti-von Willebrand Factor anticorpsAbcamab8822dilution de travail 1:100
Anticorps anti-lapin de chèvre 568secondaire Thermofisher ScientificA-11011dilution de travail 1:100
HoeschtThermofisher ScientificH1399Remis en suspension dans du
cacodylate de sodium DMSO  ;Sigma-AldrichC0250Pour fabriquer un tampon cacodylate de 0,2 M
ÉthanolVWR InternationalBDH1164-4LP
40 kDa Dextran conjugué au FITCSigma-AldrichFD40S  ;
forts  ;
CHIR-99021Selleck ChemS2924Inhibiteur de GSK-3 à petite molécule
Recombinant humain VEGFPeprotech100-20
Recombinant humain bFGFPeprotechAF-100-18B
Boîtes de Pétri de 1 cm x 3 cm acétique à 0,1 %

Références

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