Cytoplasmique microinjection dans zygotes Bétail assistée par laser

Résumé

Ce protocole montre comment effectuer une microinjection cytoplasmique dans des zygotes d’animaux d’élevage. Cette technique peut être utilisée pour apporter n’importe quelle solution dans l’embryon unicellulaire, comme des outils d’édition du génome pour générer des animaux knock-out.

Résumé

La microinjection cytoplasmique dans des embryons unicellulaires est une technique très puissante. À titre d’exemple, il permet de fournir des outils d’édition du génome qui peuvent créer des modifications génétiques qui seront présentes dans chaque cellule d’un organisme adulte. Il peut également être utilisé pour délivrer des siRNA, des ARNm ou des anticorps bloquants afin d’étudier la fonction des gènes dans les embryons préimplantatoires. La technique conventionnelle de micro-injection d’embryons utilisée chez les rongeurs consiste en une micropipette très fine qui pénètre directement dans la membrane plasmique lorsqu’elle est avancée dans l’embryon. Lorsque cette technique est appliquée aux animaux d’élevage, elle se traduit généralement par une faible efficacité. Cela s’explique principalement par le fait que, contrairement aux souris et aux rats, les zygotes bovins, ovins et porcins ont un cytoplasme très foncé et une membrane plasmique très élastique qui rend la visualisation lors de l’injection et la pénétration de la membrane plasmique difficiles à réaliser. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de micro-injection appropriée pour l’administration de solutions dans le cytoplasme de zygotes bovins qui s’est avérée efficace pour les embryons de moutons et de porcs. Tout d’abord, un laser est utilisé pour créer un trou dans la zone pellucide. Ensuite, une micropipette en verre à bout émoussé est introduite à travers le trou et avancée jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille atteigne environ 3/4 dans l’embryon. Ensuite, la membrane plasmique est brisée par l’aspiration du contenu cytoplasmique à l’intérieur de l’aiguille. Enfin, le contenu cytoplasmique aspiré suivi de la solution d’intérêt est réinjecté dans le cytoplasme embryonnaire. Ce protocole a été utilisé avec succès pour l’administration de différentes solutions dans les zygotes bovins et ovins avec une efficacité de 100 %, une lyse minimale et des taux de développement normaux des blastocystes.

Introduction

microinjection cytoplasmique d'embryons 1 cellules est une technique très puissante. Il peut être utilisé pour fournir une quelconque solution dans l'embryon, par exemple, produire des gènes knock-out pour étudier la fonction des gènes ou pour générer des animaux génétiquement modifiés. Zygotes des animaux d'élevage plus d'intérêt agronomique ont une composition en acides gras très élevé qui rend leur cytoplasme opaque et sombre ^1. Ils ont aussi une membrane plasmique assez élastique (PM). Ces caractéristiques font de microinjection pronucléaire utilisant / injection cytoplasmique classique utilisé dans des espèces de rongeurs difficiles et souvent inexactes.

La micro - injection cytoplasmique présente des avantages sur la micro - injection pronucléaire car il est plus facile à réaliser et entraîne aussi moins de dommages aux embryons injectés, ce qui entraîne la viabilité élevée ^2. L'objectif global de ce protocole est de démontrer une méthode efficace pour la fourniture de solutions dans le cytoplasme des zygotes des animaux d'élevage. Pour être en mesure d'effectuerla micro-injection cytoplasmique avec un rendement élevé sur des embryons de bétail, un laser est utilisé pour produire un trou dans la zone pellucide (ZP), puis une aiguille de verre à extrémité émoussée est utilisée pour la micro-injection. Cette stratégie vise à réduire les dommages mécaniques imprimé sur l'embryon lors de l'injection. Ensuite, l'aspiration du contenu cytoplasmique à l'intérieur de l'aiguille d'injection permet une rupture efficace et sûre de la MP en sorte que la solution est délivré dans le cytoplasme de l'embryon.

Cette technique a déjà été utilisée avec succès dans les embryons de bovins pour délivrer l' ARNsi dans le cytoplasme ^3,4 zygotique et pour générer des mutations à l' aide des séquences répétées courtes regroupées régulièrement espacées (palindromiques CRISPR) / CRISPR associé du système 9 du système (cas9) ^5. Il est également approprié (avec des modifications mineures) pour injecter bovins cumulus-ovocytes enfermés ^6. Ici, nous décrivons notre protocole d'injection délivrant un colorant, qui peut être applicable à l'injection d'une quelconque dessolution IRED dans le zygote, et de montrer que l'utilisation de cette technique provoque la lyse minimale et n'a aucune incidence sur le développement précoce de l'embryon.

Protocole

1. Micropipette production

1. L'injection d'une micropipette
   1. Placez un capillaire de verre borosilicate (diamètre extérieur (OD): 1,0 mm, diamètre interne (ID): 0,75 mm) dans un extracteur micropipette (dans le centre des détenteurs de droits et capillaires à gauche) et le verrouiller.
   2. Utilisez un programme approprié pour tirer le capillaire en verre de sorte qu'il en résulte une fine pointe avec une longue tapper. (Exemple: la chaleur: 825; Pull: 30; Vitesse: 120; Temps: 200; Pression: 500).
   3. Retirez délicatement les pipettes tirés de l'appareil et placez-le sur un microforge en position horizontale.
   4. Apportez la pipette tiré et l'microforge chauffe filament avec son perle de verre dans le foyer. Utiliser le réticule d'oculaire pour mesurer l'épaisseur désirée et déplacer la pipette horizontalement jusqu'à ce que le filament chauffant atteint la cible diamètre intérieur (5 um).
   5. Ajuster la température à environ 45% et porter doucement la pipette vers le bas afin qu'il touche le filament. Activer le chauffe brièvement. Ce wfondre mal légèrement la pipette de sorte qu'il adhère au filament et lors du refroidissement, la pipette se brisera au point de générer une coupe droite de contact.
      Remarque: Réglage de la température appropriée est la clé de cette étape car les températures trop élevées feront la courbure de la pipette et donc une coupe droite ne sera pas possible et les températures trop basses ne seront pas suffisantes pour faire fondre la pipette (figure 1A).
   6. Faire une angle de 30 ° environ près de la pointe de la pipette en le positionnant à environ 10 um loin du filament chauffant. Régler la température à 60%, et activer l'élément chauffant.
      Note: Ceci pliez la pipette sur le filament. Cet angle est souhaité de sorte que la pointe de l'aiguille est parallèle à la surface de la plaque d'injection quand il est monté dans l'injecteur (figure 1B).
   7. Poignée pipettes microinjection avec prudence car ils sont extrêmement forte et fragile.
2. micropipette Tenir
   1. Placer un borosilicmangé capillaire en verre (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) dans un extracteur micropipette (dans le centre des détenteurs de droits et capillaires à gauche) et le verrouiller.
   2. Utilisez un programme approprié pour tirer le capillaire en verre de sorte qu'il en résulte une pointe fine avec une longue même cône et des parois parallèles (Exemple: Heat: 815; Pull: 20; Vitesse: 140; Temps: 175; Pression: 200).
   3. Retirez délicatement la pipette tiré du dispositif de traction et placez-le sur le porte-microforge en position horizontale. Réglez la mise au point sur le filament chauffant et pipette.
   4. Utilisez le réticule de l'oculaire pour mesurer le diamètre de la pipette et déplacer la pipette jusqu'à ce que son diamètre sur le filament atteint 180 um.
   5. A la taille indiquée, marquer le capillaire en verre avec un stylo à pointe de diamant, puis appuyez doucement sur la pointe tirée pour briser le verre. Cela devrait se traduire par une coupe droite (figure 1C).
   6. Déplacer la pipette en position verticale avec sa pointe à proximité du filament. Réglez la température du microforge à 60%.
   7. Fire-polish la pointe de la pipette en utilisant des techniques standard ⁷ jusqu'à ce qu'il atteigne un ID de 40 um. Utilisez le réticule de l' oculaire pour vérifier l'ID (figure 1D).
   8. Faire un angle sur la pipette.
      1. Apportez la pipette à une position horizontale d'environ 10 pm loin du filament et 5 mm de sa pointe. Régler la température à environ 60%, et activer le dispositif de chauffage pour plier la pipette sur le filament. Continuer à chauffer jusqu'à ce qu'un angle (d'environ 30 ^o) souhaitée est atteinte. Vérifiez l'angle visuel (figure 1E).
         Remarque: La pipette est habituellement monté sur le micro - injecteur selon un angle approximatif de 60 ^° par rapport au fond de la cuvette d'injection. La pointe de la pipette est plié de sorte qu'il soit parallèle au fond de la cuvette, qui est nécessaire pour l'injection correcte de l'embryon à son plan médian.

le "Setup Micromanipulateur> 2.

1. Vérifiez que les microinjecteurs sont entièrement chargés avec de l'huile et qu'il n'y a pas de bulles d'air dans le système (des bulles dans le microinjecteur empêchent un contrôle précis de l'injection).
2. Vérifiez que les micromanipulateurs sont en position centrale. Cela permettra une vaste gamme de déplacement des pipettes.
3. Insérez la pipette de maintien dans le support de micromanipulateur gauche et la pipette d'injection dans le support de micromanipulation droite.
4. Laisser l'huile d'entrer dans les pipettes par capillarité et vérifier que le système fonctionne correctement en déplaçant l'huile et à l'intérieur de la pipette à l'aide des commandes de micro-injecteur.
   Remarque: S'il n'y a pas de mouvement de l'huile à l'intérieur des aiguilles, il pourrait y avoir un sabot. Dans ce cas, utiliser une nouvelle aiguille.
5. Utilisez les commandes micromanipulateur pour amener les pipettes dans le centre du champ de vision du microscope. Utilisation de grossissement 4X, vérifier que les conseils de micropipette sont dans le bon angle (parallel au fond de la cuvette).
   Remarque: Une configuration correcte des aiguilles est la clé pour une injection réussie et des résultats de cohérence.
6. Calibrer le système laser suivant le manuel d'étalonnage du fabricant.

3. Préparation de la vaisselle d'injection (Figure 2)

1. Placer une goutte de 50 ul de réchauffé (37 ° C) FOS-HEPES (composition détaillée dans la section des matériaux) supplémenté avec du sérum de 20% de fœtus bovin (FBS) sur le centre du couvercle d'une boîte de Pétri de 100 mm. Placer un 1 - 2 ul goutte de la solution à injecter à proximité de la goutte d'injection. Veiller à ce que les embryons ne refroidissent pas en dessous de la température ambiante.
   Remarque: Dans ce protocole, nous allons ajouter le colorant de Dextran-Rouge à la solution d'injection pour être en mesure de visualiser le site d'injection et de suivre plus tard.
2. Couvrir les gouttes dans la plaque d'injection à l'aide d'environ 10 ml d'huile minérale.
3. Placer le plat d'injection sur la scène du microscope inversé et amener le pipEttes dans la goutte d'injection. Vérifiez que les aiguilles sont en discussion à l'intérieur de la goutte. Régler leur hauteur au besoin en utilisant les commandes micromanipulateur.
4. À l'aide d'une micropipette, charger environ 20 - 30 zygotes (17-20 h après la fécondation (HPF)) dans la partie supérieure de la goutte d'injection. Effectuer l'injection à la température ambiante de sorte que le nombre d'embryons dans la chute d'injection est déterminé par la vitesse à laquelle la personne peut les injecter. Ne chargez pas plus d'embryons que ceux qui peuvent être injectés en 30 min.
   1. Pour charger les embryons dans le microdispenser, appuyer sur le piston complètement et immerger la pointe dans la solution contenant les embryons. Touchez les embryons à être ramassés avec la pointe du capillaire en verre (une à la fois) et libèrent lentement le piston de sorte que chaque embryon pénètre dans le capillaire. Répétez jusqu'à ce que tous les embryons sont pris en charge ou la capacité de microdispenser est pleine.
   2. Pour libérer les embryons chargés, appuyer sur le piston doucement jusqu'à ce que la totalité du volume containing les embryons est libéré du capillaire.

4. microinjection

1. En utilisant l'objectif de 4X, charger la solution à injecter dans la pipette d'injection en appliquant une pression négative (aspiration de). Chargez une solution suffisante pour injecter 2 - 3 zygotes. Ensuite, passez à la chute de l'injection.
2. Dans la goutte d'injection, déplacer la pipette de maintien de sorte que la pointe se rapproche à un zygote. Appliquer une pression négative (aspiration) avec le micro-injecteur de maintien de sorte que le zygote se fixe à la pipette de maintien et de changement à un objectif 20X.
3. Une fois que le zygote est fixé à la pipette de maintien, vérifier sa qualité en utilisant la pipette d'injection pour déplacer doucement l'embryon autour sans le détacher. Une bonne zygote de qualité doit avoir les deux corps polaires (bien que parfois un seul est visible) et un cytoplasme homogène. Ne pas injecter zygotes anormaux (Figure 3A).
4. Si nécessaire, repositionner l'embryon pour une injection appropriéeemplacement. Un bon positionnement serait celui dans lequel il y a un espace entre le ZP et le PM, de sorte que le PM ne soit pas endommagé par le laser.
5. Vérifier que la pipette d'injection est positionné sur plan médian de l'embryon en touchant doucement le zygote sur le site d'injection. S'il est pas sur son plan médian, l'aiguille aura tendance à faire tourner l'embryon au lieu de ponction. Réglez la hauteur de la pipette d'injection selon les besoins.
6. Faire un trou dans la ZP utilisant un laser (figure 3B).
   1. En utilisant le logiciel la place du laser, le laser à réticule dans la ZP où le trou est réalisé (sur le côté opposé à celui où l'embryon est fixé à la pipette de maintien). Utilisation de la fenêtre de contrôle de laser, cliquez sur le bouton de tir. Assurez-vous que la taille du trou est assez grand pour créer une ouverture dans la ZP pour l'aiguille de passer à travers sans endommager le PM (Exemple: 0,662 msec Largeur d'impulsion / 6,9 um taille du trou).
7. Passez l'aiguille d'injectionà travers le trou dans la ZP et prendre contact avec la MP. Continuez à pousser la pipette avant jusqu'à ce que l'aiguille est ¾ du chemin dans l'embryon (figure 3C).
8. Observer la position du ménisque à l'interphase solution d'huile, car cela va être utilisé pour contrôler régulièrement le volume d'injection.
9. Appliquer une pression négative (aspiration) sur la pipette d'injection, ce qui se traduira par PM et le cytoplasme étant aspiré dans l'aiguille d'injection. Continuez jusqu'à ce que le mouvement du cytoplasme dans l'aiguille accélère ou lorsque la teneur en cytoplasme mélangeant avec une solution d'injection peut être vu. Ceux - ci indiquent la rupture de la PM (Figure 3D).
10. Injecter retour le contenu cytoplasmique suivie par la solution dans le cytoplasme de la zygote en appliquant une pression positive (injection), jusqu'à ce que le ménisque à l'interphase solution-huile a avancé diamètre équivalent d'un zygote passé le point de départ.
    Remarque: Dans nos conditions, ce représente environ 7 pl de solution injectée (figure 3E).
11. Modification d'un objectif 4x et déplacer l'embryon / s injecté sur la face inférieure de la goutte d'injection. Relâchez l'embryon en appliquant une pression positive sur le micro-injecteur de maintien. Garder les embryons non-injecté sur le côté supérieur et ceux injectés sur le côté inférieur de la chute pour aider à garder la trace des embryons / non-injecté injecté et travailler efficacement.

5. Embryo récupération et injection Résultats

1. Faire 3 gouttes d'environ 200 ul dans un nouveau plat avec préchauffé SOF-HEPES. Recueillir les embryons injectés en utilisant un microdispenser (tel que décrit ci-dessus). Laver les embryons injectés en les déplaçant à travers le 3 SOF-HEPES gouttes.
2. Compter les embryons lysées lors de microinjection et jetez-les.
   Note: Un zygote lysées peut être facilement distingué d'un un intact depuis le premier apparaît translucide, remplir toute la ZP, et il a généralement cytoplasmiquele contenu fuit vers l'extérieur de l'embryon.
3. En option, vérifier l'efficacité de microinjection en utilisant un microscope à fluorescence. Soyez conscient que l'exposition aux rayons UV peut provoquer des lésions de l'embryon qui peut affecter le développement ultérieur.
4. Les groupes de culture de 25 embryons injectés dans 50 gouttes ul de milieu d'optimisation simplex de potassium (KSOM) additionné de 4 mg / ml de sérum - albumine bovine (SAB) dans de l' huile minérale à 38,5 ° C, 5% de CO ₂ dans l' air et à l' humidité jusqu'à saturation.
5. Compléter le milieu de culture avec 5% de SBF deux jours après l'injection.
6. Vérifiez blastocyste (BL) taux de 7 jours après l'injection. Calculer les taux BL que le nombre total de blastocyste embryons / nombre total d'embryons cultivés dans cette goutte.

Résultats

Assistée par laser microinjection cytoplasmique est un protocole puissant et fiable pour fournir des solutions dans le cytoplasme des zygotes de bétail. La figure 3 montre un aperçu général des zygotes avant et après l' injection, ainsi que le contour global de la technique. Dextran-rouge est utilisé comme solution d'injection pour permettre site de suivi de l'injection et l'injection d'efficacité et de précision. La livraison réussie de la solution e...

Discussion

Microinjection de zygotes est une méthode bien établie pour l'introduction de solutions dans des embryons de mammifères. Avec quelques variations dépendant de l'espèce et du but de l'expérience, cette technique peut être utilisée au sens large. Nous montrons comment effectuer microinjection intracytoplasmique utilisant un laser pour aider l'entrée d'une micropipette extrémité franche. Zygotes de certaines espèces animales (comme les bovins, les moutons et les porcs) ont un cytoplasme sombre, ce qui e...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Extracteur de micropipettes	Sutter Instrument	P-97
Capillaire en verre	Instruments Sutter	B100-75-10	Ces capillaires sont utilisés pour la fabrication des pipettes de maintien et d’injection. Tout tube borosilicate à paroi épaisse/standard sans filament peut être utilisé.
Microforge	Narishige	MF-9	Équipé d’un objectif de grossissement 10X.
Micromanipulateur	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Microscope inversé	Nikon	TE2000-U	Équipé d’objectifs 4X, 20X et d’un système laser.
Instruments de recherche	laser	7-47-500	Saturn 5 Laser actif.
Microdistributeur	Drummond	3-000-105	Le microdistributeur est utilisé pour déplacer les embryons. Une pipette p10 peut également être utilisée mais en chargeant un volume aussi minimal que possible.
Falcon	100 x 15 mm	351029	Utilisez le couvercle du plat pour fabriquer la plaque d’injection car ils ont des parois inférieures et faciliteront le positionnement et le déplacement du micromanipulateur. Le couvercle d’une boîte de culture de 60 mm peut également être utilisé.
Boîte de culture de 35 mm	Corning	430165	Ces boîtes sont utilisées pour la culture des embryons dans 50 &mu ; l gouttes recouvertes d’huile minérale. Alternativement, un plat à 4 puits peut également être utilisé. Quelle que soit la parabole choisie pour cultiver les embryons, ils doivent toujours être équilibrés dans l’incubateur pendant au moins 4 heures avant de leur transférer les embryons.
Incubateur	Sanyo	MCO-19AIC	Tout incubateur pouvant être réglé sur 38.5 ° ; C, 5 % CO2 peuvent être utilisés.
Stéréomicroscope	Nikon	SMZ800	Utilisé pour visualiser les embryons dans les gouttes de culture et pendant les lavages. N’importe quel stéréomicroscope avec un grossissement de 10X peut être utilisé.
Unité de commande HT	Minitube	12055/0400	Système de chauffage fixé au stéréomicroscope.
Platine de microscope chauffée	Minitube	12055/0003	Système de chauffage fixé au stéréomicroscope.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Une solution stérile de 10 mg/ml est utilisée pour l’injection.
Huile minérale	sigma	M8410	Conservez l’huile minérale à température ambiante et à l’abri de la lumière à l’aide de papier d’aluminium.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Supplémenté en 4 mg/ml de BSA. Les plaques KSOM pour la culture d’embryons doivent être équilibrées dans un incubateur pendant au moins 4 heures avant d’être utilisées.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Utilisez un FBS qualifié pour les cellules souches.
Les zygotes			sont injectés à une dose de 17 à 20 hpf et peuvent être dérivés in-vitro ou in-vivo.
NaCl	Sigma	S5886	Concentration finale : 107,7 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
KCl	Sigma	P5405	Concentration finale : 7,16 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
KH2PO4	Sigma	P5655	Concentration finale : 1,19 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Concentration finale : 0,49 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
DL-lactate de sodium	Sigma	L4263	Concentration finale : 5,3 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O  ;	Sigma	C7902	Concentration finale : 1,71 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
D-(&minus ;)-Fructose  ;	Sigma	F3510	Concentration finale : 0,5 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
HEPES  ;	Sigma	H4034	Concentration finale : 21 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Concentration finale : 1x. Composant du milieu SOF-HEPES.
BME-EAA	Sigma	B6766	Concentration finale : 1x. Composant du milieu SOF-HEPES.
NaHCO3	Sigma	S5761	Concentration finale : 4 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
Pyruvate	de sodium Sigma	P4562	Concentration finale : 0,33 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
Glutamax	Gibco	35050	Concentration finale : 1 mM. Composant du milieu SOF-HEPES.
BSA	Sigma	A-3311	Concentration finale : 1 mg/ml. Composant du milieu SOF-HEPES.
Gentamicine	Sigma	G-1397	Concentration finale : 5 &mu ; g/ml. Composant du milieu SOF-HEPES.
Eau pour le transfert d’embryons	Sigma	W1503	Composant du milieu SOF-HEPES.
Milieu SOF-HEPES	Fabriqué en laboratoire		pH 7,3 - 7,4, 280 ± ; 10 mO. Filtre stérilisé par un 22 &mu ; Le filtre M peut être conservé au réfrigérateur à 4 & deg ; C pendant 1 mois. Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation.

Plat de culture de