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In Situ Étiquetage de l' ADN mitochondrial de réplication chez la drosophile adulte Ovaires par EdU Coloration

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DOI :

10.3791/54516

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15 octobre 2016

 , 
1Lab of Molecular Genetics, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

l’ovogenèse de la drosophile continue d’être exceptionnellement utile dans l’étude de la prolifération mitochondriale et de l’hérédité. Ce manuscrit décrit un protocole détaillé utilisé pour marquer l’ADN mitochondrial réplicatif (ADNmt) dans les ovaires adultes de la drosophile avec la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), ce qui facilite la découverte de mécanismes associés à l’hérédité mitochondriale qui étaient auparavant discutables.

Résumé

Le génome mitochondrial est hérité exclusivement par la lignée maternelle. Il est d’une importance fondamentale de comprendre comment la mitochondrie et son génome prolifèrent et se transmettent d’une génération à l’autre par l’ovocyte féminin. En raison de la traçabilité génétique et de la simplicité élégante et ordonnée avec laquelle le développement des ovocytes se déroule, l’ovogenèse de la drosophile est devenue un système inestimable pour l’étude des mitochondries. Une méthode de marquage EdU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine) a été utilisée pour détecter la réplication de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les ovaires de la drosophile. Cette méthode est supérieure à la méthode de marquage BrdU (5-bromo-2'-désoxyuridine) en ce sens qu’elle permet une bonne conservation structurelle et une pénétration efficace du colorant fluorescent dans les tissus entiers.

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour le marquage de l’ADN mitochondrial réplicatif dans les ovaires adultes de la drosophile avec EdU. Certaines solutions techniques sont proposées pour améliorer la viabilité des ovaires, maintenir leur santé pendant la préparation et assurer une imagerie de haute qualité. La visualisation de l’ADNmt nouvellement synthétisé dans les ovaires révèle non seulement le modèle temporel et spatial frappant de la réplication de l’ADNmt par l’ogenèse, mais permet également une quantification simple de la réplication de l’ADNmt sous diverses perturbations génétiques et pharmacologiques.

Introduction

D'ailleurs le génome nucléaire, chaque cellule eucaryote contient également des milliers de copies de petits ADN circulaires dans la matrice mitochondriale. Alors que l'ADN mitochondrial (ADNmt) codant pour les sous-unités essentielles de la chaîne de transport d'électrons, la majeure partie du protéome mitochondrial, y compris les facteurs de transcription et la réplication de l'ADN mitochondrial sont codées par le génome nucléaire. Par contraste avec le génome nucléaire qui suit les lois de Mendel de l'hérédité, le génome mitochondrial des animaux est héritée exclusivement par la lignée maternelle. Par conséquent, comprendre comment l'ADNmt est proliféré et transmis d'une génération à l'autre par l'ovocyte femelle est fondamentalement important. Cependant, le débat se poursuit sur la façon dont la réplication ADNmt est réglementée dans la lignée germinale femelle. En outre, la théorie de goulot d'étranglement ADNmt largement acceptée pour la transmission ADNmt suggère que la population de l'ADNmt dans les cellules germinales primordiales est sous-échantillonné à un nombre relativement faible during développement 1 2. Elle implique également que la réplication de l'ADNmt est temporellement et spatialement réglementé durant l'ovogenèse. Par conséquent, la détection in situ de la réplication de l' ADNmt au cours du développement de la lignée germinale facilitera la compréhension du mécanisme de l' ADNmt héritage.

Drosophila oogenesis fournit un système génétiquement traitable pour étudier la réplication de l' ADNmt et la transmission. Dans chacun des deux ovaires chez la drosophile, il existe des chaînes 16-20 indépendantes des chambres d'oeuf appelées ovariole 3, qui sont les unités fonctionnelles de la production d'oeufs (voir figure 1A). Chaque ovariole contient une organisation linéaire progressive de l'ovogenèse, où l'extrémité antérieure est composée d'une structure appelée germarium. Le germarium est divisé en quatre régions qui contiennent des cellules germinales à des stades de développement distincts. Dans la région 1, les cellules souches germinales passent par la division asymétrique pour produire des cellules filles appelées cystoblasts. Région 2a contient les cystoblasts qui ont terminé leur division finale. Cystoblasts subissent quatre tours de groupes 16 cellulaires division production. Les cellules 16 restent reliées les unes aux autres par des ponts cytoplasmiques appelés canaux annulaires. Une seule des cellules engage la différenciation comme l'ovocyte, tandis que l'autre 15 se développent en tant que cellules nourricières polyploïdes. Une structure essentielle cytoplasmique dite fusome, il est proposé de faciliter avec la formation de canaux annulaires, déterminer la polarité du kyste et l'infirmière des interactions cellule-4,5 ovocyte. Comme les kystes se déplacent vers la région 2b, les structures de kyste couvrent toute la largeur de la germarium, et deviennent plus associés à des cellules folliculaires. Les structures de germarium se terminent par la région 3 contenant la première chambre d'œuf herbe. Par la suite, les chambres d'œufs sont assemblés à l'extrémité postérieure de la germarium, qui progressent à travers les ovariole en 14 étapes morphologiquement distinctes. La croissance de l'ovocyte dépend des cellules nourricières, whprotéines de transport ich, ARNm et structures endomembranaires (par exemple, Golgi) via les canaux périphériques dans l'ovocyte. Au cours de la drosophile ovogenèse, il a été constaté qu'une fraction des mitochondries dans chaque kyste 16 cellules ont été associés à l'fusome, déplacé à travers les canaux périphériques et ont été livrés dans le seul ovocyte dans une grande masse appelée Balbiani corps 6. Ce phénomène a été proposé de contribuer au contrôle de la qualité de transmission mitochondriale par les ovaires des femmes.

La détection de la synthèse de l'ADN mitochondrial repose sur l'incorporation de précurseurs d'ADN marqués dans l'ADN cellulaire. Traditionnellement, un analogue nucléosidique de la thymidine 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) a été utilisé pour marquer la réplication de l' ADN mitochondrial dans des cellules de culture tissulaire à 7,8. Cependant, le marquage BrdU à base d'anticorps présente plusieurs limites, en particulier pour l'ensemble du montage coloration des tissus. Un inconvénient majeur de marquage BrdU est qu'il nécessite dénaturation de l'ADN pour exposerl'épitope BrdU, de sorte qu'il puisse être détecté par l'anticorps anti-BrdU. L'échantillon doit être traité dans des conditions de dénaturation difficiles tels que les produits chimiques (par exemple, l' acide chlorhydrique ou des mélanges de méthanol et d' acide acétique), la chaleur ou la digestion par DNase, ce qui pourrait perturber la structure de l'échantillon et de compliquer la procédure de coloration suivante 9, 10.

Ici, une variante analogue de la thymidine 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (UED) est utilisé pour marquer l'ADN mitochondrial de Drosophila se répliquer dans les ovaires adultes. Cette méthode est plus rapide et hautement sensible. EdU est facilement incorporé dans l'ADN cellulaire lors de la réplication de l'ADN. La détection suivante est basée sur une réaction «clic», un Cu (I) catalysée réaction covalente entre le groupe alcyne terminal et un azoture fluorescent 10. Étant donné que la réaction ne nécessite pas la dénaturation de l'échantillon, il permet une bonne conservation structurelle. En outre, la taille du colorant d'unZide est seulement 1/500 de celle d'une molécule d'anticorps 10, ce qui permet une pénétration rapide et efficace des tissus entiers de montage. Nous avons utilisé cette méthode pour détecter la réplication de l' ADNmt pendant Drosophila ovogenèse et a trouvé un modèle spatial de frappe dans la région germarium de Drosophila ovaire 11, ce qui nous conduit à proposer un ADNmt mécanisme d'héritage sélectif de réplication dépendante. Nous présentons ici un protocole détaillé sur l' étiquetage EdU de réplication ADNmt dans les ovaires chez la drosophile. Pour démontrer l'application du protocole, nous avons également testé la réplication de l' ADNmt dans un ADNmt mutant Drosophila (mt: CoI T300I) 11, ainsi qu'avec le traitement diversifié de découpleurs mitochondriales, qui dissipent la membrane mitochondriale potentiel et potentiellement perturber la réplication de l' ADNmt.

Protocole

1. Tissue Collection et Dissection

  1. Dans chaque flacon contenant de la levure sèche, la culture 10 femelle adulte vole avec 10 hommes pour 2-3 jours.
    Remarque: Le maintien de mouches femelles bien nourries permettra d'améliorer la qualité globale et le rendement de la production de l'ovaire et de faciliter la dissection.
  2. Anesthésier la femelle vole sur un dioxyde de carbone (CO 2) volez pad.
  3. Sous le stéréoscope, placez quelques gouttes de milieu RT (le milieu Drosophila de Schneider supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS)) sur un tampon de dissection. Effectuer toutes les procédures de dissection dans le moyen de garder les tissus vivants et en bonne santé.
  4. Prenez une femelle engraissés voler avec des pinces fines nez pointus à son thorax inférieur. Utilisez un autre jeu de pinces pour tirer doucement à l'extrême postérieure de la mouche jusqu'à ce que les tissus de l'abdomen sont exposés. Détachez les deux ovaires d'autres tissus (par exemple tripes).
    Remarque: Chaque affiche ovaire une structure opaque qui est composerd de 16-20 ovarioles attachés.
  5. Pour améliorer la pénétration des réactifs, ouvrir les ovaires en les tirant en dehors et en passant le bout de la pince entre chaque ovariole une couple de fois. Gardez les ovarioles connectés dans un ovaire pour minimiser la perte de tissus au cours des procédures suivantes.
  6. Transférer les ovaires immédiatement à un tube de 1,5 ml contenant 500 ul de milieu Drosophila de Schneider avec 10% de FBS.
  7. Répétez la dissection et de recueillir 10-15 ovaires dans chaque tube de microcentrifugation.

2. EdU Étiquetage

  1. Aspirer le milieu dans chaque tube, et le remplacer par 500 ul de milieu Drosophila de Schneider avec 10% de FBS contenant 7 uM aphidicoline.
    Note: aphidicoline est utilisé pour bloquer la synthèse de l' ADN nucléaire en inhibant l' ADN polymérase α sans affecter la réplication ADNmt 7, 12. Il est possible d'augmenter la concentration jusqu'à aphidicolineà 70 pM pour obtenir une meilleure inhibition. La solution mère de 3-30 mM aphidicoline dans le DMSO peut être stocké dans l'obscurité à -20 ° C pendant jusqu'à 6 semaines.
  2. Pour garder les ovaires sains, veiller à ce qu'ils sont immergés dans des solutions tout en changeant le milieu. Utiliser un milieu Drosophila de Schneider avec 10% de FBS à l' étape 2.6.
  3. Incuber ovaires pendant 3 heures à la température ambiante sur une bascule paillasse avec une légère rotation.
    1. Pour le traitement de la drogue, par exemple, mitochondrial carbonyl découplant cyanure phénylhydrazone 4-trifluorométhoxy (FCCP), ajouter la concentration appropriée de médicament (par exemple, 10 uM FCCP) dans le milieu après 2 h de traitement aphidicoline. Continuer l'incubation pendant 1 h.
  4. Retirez le milieu contenant aphidicoline avec ou sans médicament. Rincer brièvement les ovaires avec le milieu (aphidicoline est pas nécessaire) deux fois.
  5. Ajouter 1 ml de milieu contenant 10 uM EdU et 7 uM aphidicoline et continuer incubating à température ambiante pendant 2 h. Stocker le mM EdU solution mère à 10 (dans le DMSO) à -20 ° C.
  6. Retirez le milieu contenant EdU et aphidicoline. Laver avec du milieu (sans aphidicoline) deux fois pendant 3 minutes chacun.

3. Tissue fixation et perméabilisation

  1. Préparer une solution de paraformaldehyde à 4% dans du tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4).
    Note: Nous avons utilisé paraformaldehyde disponible dans le commerce stocké dans des ampoules pré-marqué. Ouvrez une nouvelle ampoule et diluer à 4% avant utilisation.
    ATTENTION: Formaldéhyde est toxique; il doit être manipulé dans une hotte avec la peau et une protection oculaire.
  2. Fix ovaires avec 4% de paraformaldehyde pendant 20 min à température ambiante avec une légère rotation.
  3. Enlever le fixateur et de lavage des ovaires deux fois dans 1 ml de BSA à 3% dans du PBS pendant 5 min à chaque fois.
  4. Pour perméabiliser les tissus, éliminer la solution de lavage et ajouter 1 ml de 0,5% de Triton X-100 dans du PBS. Incubation à température ambiante pendant 20 min.
  5. Retirer la solution de perméabilisation et laver deux fois dans 1 mlde 3% de BSA dans du PBS.

4. EdU Détection

Remarque: EdU détection est basée sur la chimie «clic», Cu (I) catalysées [3 + 2] cycloaddition 13, ce qui ajoute des azides fluorescents au groupe alcyne terminal edu, et la molécule fluorescente est soumise à une détection ultérieure. Etant donné que Cu (I), qui est facilement oxydé en l'espèce non catalytique de Cu (II), est nécessaire pour catalyser la réaction, il est recommandé de réduire le sulfate de Cu (II) in situ pour obtenir du Cu (I). Autrement dit, le sulfate de Cu (II) est utilisé en présence d'un agent réducteur tel que l'acide ascorbique (ici, le "tampon additif") pour produire du cuivre (I).

  1. Avant l'expérience, préparer la solution de travail de l'azoture Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 azide, Alexa Fluor 555 azoture ou autres, selon le fluorophore préféré, qui sont nommés comme "colorant azoture" ci-après), un additif EdU tampon de réaction et le tampon EdU selon fabricantinstructions.
    1. Reconstituer l'azoture de colorant dans 70 DMSO ul. Stocker la solution de travail à -20 ° C pendant jusqu'à 1 an.
    2. Préparer un tampon frais de réaction EdU en diluant le EdU tampon 10x de réaction avec de l'eau déminéralisée.
      Remarque: Après utilisation, stocker toute solution 1x restant à 4 ° C. La solution 1x est stable pendant 6 mois.
    3. Faire une solution 10x stock de l'additif tampon EdU par dissolution complète de la poudre dans 2 ml d'eau déminéralisée.
      Remarque: Cette solution mère est stable pendant 1 an à -20 ° C. Si la solution se développe une couleur brune, il est dégradé et doit être mis au rebut.
  2. Préparer la réaction cocktail EdU frais à chaque fois, et utiliser dans les 15 minutes de préparation. Pour obtenir des résultats reproductibles, assurez-vous que les composants de la réaction sont maintenues dans les mêmes rapports.
    1. Faire fraîche 1x EdU tampon solution additive en diluant la solution 10x stock (préparé à l'étape 4.1.3) 1:10 dans de l'eau déminéralisée. Utilisez ce solution sur le même jour.
    2. Préparer 1 ml de EdU réaction cocktail en combinant les ingrédients suivants dans l' ordre: 860 ul 1x EdU tampon de réaction, 40 ul CuSO 4, 2,5 ul de colorant azoture, 100 pl additif tampon 1x EdU.
      Remarque: il est important que les ingrédients sont ajoutés afin d'assurer des performances optimales.
  3. Retirez le PBS avec 3% de BSA et ajouter 0,5 ml de la réaction cocktail EdU à chaque tube. Incubation à température ambiante pendant 30 minutes avec une légère rotation. Gardez les échantillons protégés de la lumière.
  4. Retirer la réaction cocktail EdU et laver une fois avec 1 ml de 3% de BSA dans du PBS.
  5. On lave les échantillons une fois avec 1 ml de PBS.

5. Anticorps Étiquetage

Remarque: Effectuez l'étiquetage des anticorps après EdU coloration. Si aucune coloration supplémentaire est souhaitée, on peut procéder au montage et à l'imagerie directe. Il est important que les échantillons soient protégés contre la lumière dans toutes les procédures suivantes.

  1. Retirer la solution de lavage. Bloquer les ovaires dans 1 ml de solution de blocage contenant 0,2% de BSA et 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 30 min.
  2. On élimine la solution de blocage et le remplacer par un anticorps primaire dilué dans une solution de blocage (par exemple, l' ATP synthase de la souris sous - unité α anticorps, 1: 1000 dilution). Incuber dans l'obscurité à 4 ° CO / N.
  3. Laver les échantillons avec 1 ml de solution de blocage de 3 fois, 10 minutes à chaque fois. Pour minimiser l'arrière-plan, laver deux fois de plus pendant 30 minutes chacun. On élimine la solution de blocage.
  4. Incuber avec l' anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage (par exemple, une chèvre anti-souris , Alexa Fluor 568 anticorps secondaire, dilution 1: 200) pendant 2 heures à température ambiante.
    Remarque: Utilisez une couleur différente de celle couplée à EdU.
  5. Répétez les étapes de lavage effectuées à l'étape 5.3.
  6. Rincer avec 1 ml de PBS, une fois pour éliminer le détergent.

6. Montage et imagerie

  1. Retirez soigneusement tout le PBS et immcouvrir édiatement ovaires avec 50 pi de milieu de montage (avec ou sans DAPI).
    Remarque: utiliser un support de montage qui ne durcit pas lors ovarioles sont séparés les uns des autres. Les ovaires peuvent être stockés dans un milieu de montage à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine.
  2. Coupez l'extrémité d'une pointe de pipette et l'utiliser pour transférer soigneusement les ovaires sur une lame de microscope.
  3. Complètement séparée de chaque ovariole avec des pinces fines nez pointus sous la loupe binoculaire. Retirez les tissus de connexion à l'extrémité postérieure et le stade 14 ou chambres d'oeufs matures. Les jeunes chambres d'œufs sont à l'extrémité antérieure et transparente.
  4. Alignez les chambres d'œufs avec une pince de sorte qu'ils ne se chevauchent pas les uns avec les autres.
  5. Abaissez lentement une lamelle de verre # 1.5 sur le dessus des échantillons. Laisser le milieu de montage pour polymériser pendant plusieurs heures à la température ambiante. Sceller avec du vernis à ongles transparent.
  6. Image glisse le lendemain, ou conserver à 4 ° C avant l'imagerie.
  7. Visualisez sous une mi confocalcroscope avec un objectif à immersion 63X. Capturez trois dimensions z piles images.
    Remarque: Il est fort signal de EdU dans des chambres d'œufs stade ultérieur et la fluorescence de fond dans la gaine épithéliale. Lors de l'examen d'étiquetage EdU dans un germarium particulier, il faut éviter de germariums qui se chevauchent par ou à proximité d'autres tissus ou des chambres d'œufs stade ultérieur.

Résultats

Le protocole ci - dessus permet la visualisation des structures ponctuées associées aux mitochondries (figure 1B-C), qui indiquent la réplication de l' ADN mitochondrial de Drosophila pendant l' ovogenèse. Les points lacrymaux EdU localisée avec des mitochondries marquées par coloration pour la sous - unité de l' ATP synthase alpha (figure 2). Les signaux observés étaient absents dans les ovaires traités avec du bromure d'éthidium 11, un inhibiteur de la réplication de l' ADNmt 14, la validation de ces points lacrymaux en effet étiquette reproduisant mtDNA.Aphidicolin a été utilisé pour inhiber la coloration de l' ADN nucléaire sans affecter la replication de l' ADNmt (figure 2). Sans traitement aphidicoline, signaux EdU intenses étiqueter les noyaux, et ADNmt puncta étaient à peine détectés (figure 3). Cependant, en présence d'aphidicoline, l'incorporation nucléaire a été considérablement réduit et de nombreux points lacrymaux associées aux mitochondries ont été observées.

Il y a un haut niveau de réplication ADNmt dans des chambres d'œufs post-germarium (figure 1B). Cependant, notamment, la réplication de l'ADNmt affiche une configuration spatiale dans le germarium. Comme indiqué par le nombre de EdU puncta, il y a un niveau modéré de la réplication de l' ADNmt dans la région 1 du germarium, mais presque aucune incorporation EdU dans la région 2A (figure 1C). Comme le kyste se déplace vers le bas pour la région 2B dans le germarium, la réplication de l' ADNmt a repris et le nombre de EdU puncta dans le kyste postérieur de la région 2B était beaucoup plus élevé que dans la région 2A (figure 1C). Plus précisément, l'incorporation intensive EdU a été concentrée autour des canaux périphériques et les structures de fusome, comme souillé par la hu li tai shao (Hts) protéines. ADNmt maintenu la réplication à un niveau élevé dans la région 3 de la germarium (figure 1C)

Pour démontrer l'association des spécifdes gènes ou un traitement avec l' ADN mitochondrial prolifération iques, des ovaires chez la drosophile ont pu être soumises à une manipulation génétique ou d'un traitement médicamenteux. Nous avons traité des ovaires avec différentes concentrations de FCCP, un protonophore mitochondriale classique, ce qui dissipe le potentiel de membrane mitochondriale. En tant que témoin, DMSO n'a eu aucun effet sur la réplication de l' ADNmt (figure 4A). Des doses élevées de FCCP (10 uM) presque épuisées réplication de l' ADNmt entièrement à travers le germarium (Figure 4D). Néanmoins, la concentration inférieure de FCCP (2 ou 5 uM) a eu un impact mineur sur la réplication de l' ADNmt dans la région 1 , mais la réplication inhibée dans les régions 2B et 3 (figure 4B-C), ce qui suggère des régions 2B et 3 sont plus sensibles aux perturbations mitochondrial, ou ils maintiennent par rapport lentes cinétiques de réplication. Les résultats ci-dessus indiquent que la réplication de l'ADNmt est associée à l'activité mitochondriale. En particulier, les différentes régions du germarium ont réagi différemment à imp mitochondrialairment.

figure-results-1
Figure 1. réplication de l' ADNmt pendant la drosophile ovogenèse. (A) Schéma d'un ovariole drosophile et une vue agrandie de l'germarium. Le ovariole illustre de gauche à droite, avant vers l'arrière, les stades de développement successifs de chambres d'œufs. Dans le germarium, le fusome (rouge), les cellules souches germinales (bleu), les mitochondries (vert), ovocyte future (ligne brisée, reconnue par le positionnement, la structure fusome et grappes mitochondriales), le développement de kystes (pêche) et quatre régions de développement sont présentées . (B) représentant la projection z-stack d'un ovariole de type sauvage marqué par EdU et d' anticorps contre Hts-RC, un marqueur pour les canaux périphériques et fusome. En présence d'aphidicoline, la EdU a été incorporé dans l'ADNmt (pointes de flèches) et des noyaux (flèches). Barre d'échelle, 10 pm.(C) vue grossie de germaria décrites dans la région encadrée dans B. Les quatre régions de développement sont indiqués. Barre d'échelle, 5 um 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-2
Figure 2. réplication de l' ADNmt dans la germarium Drosophila visualisés par EdU incorporation avec le traitement de l' aphidicoline (A) -. (D) de la section confocale représentant d'un type germarium sauvage montrant EdU incorporation (vert, b), les mitochondries, marqué par l' ATP synthase sous - unité alpha coloration (rouge, C) et des noyaux, marqué avec la coloration DAPI (bleu, D) avec une pré-incubation avec un inhibiteur de l' ADN polymérase α aphidicoline. (A &# 39 ;-D) Une image agrandie de la zone encadrée en (A) montrant EdU incorporation (B '), les mitochondries (C') et les noyaux (D '). En présence d'aphidicoline, l'incorporation nucléaire (flèches) est réduite et que de nombreux points lacrymaux ont été localisées à l'intérieur des mitochondries (têtes de flèches). Les barres d'échelle, 10 um. Le chiffre a été modifié depuis 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. réplication de l' ADNmt est à peine détectée dans le germarium Drosophila sans traitement aphidicoline (A) -. (D) section confocale Représentant d'un type germarium sauvage montrant EdU incorporation (vert), les mitochondries, marquée parATP synthase sous-unité alpha de coloration (rouge), et des noyaux, marqué avec la coloration DAPI (bleu) en l'absence de l'inhibiteur aphidicoline polymérase α-ADN. « Une image agrandie de la zone encadrée (A) montrant l' incorporation EdU (B (A'-D)), les mitochondries (C ') et les noyaux (D'). Sans aphidicoline, signaux EdU intenses étiquette noyaux (flèches), et ADNmt puncta étaient à peine détectés. Les barres d'échelle, 10 um. Le chiffre a été modifié depuis 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. mitochondrial découplant porte atteinte à la réplication de l' ADNmt. Projets z-stack représentatifs montrant type sauvage germarium traités avec du DMSO(A) ou le FCCP découplant mitochondrial à des concentrations de 2 uM (B), 5 uM (C), 10 uM (D) pendant EdU incorporation. Notez l'étiquetage EdU altérée dans la région 2B traitée avec 2 uM FCCP (B), et dans les deux régions 2B et 3 traités avec 5 uM FCCP (décrites dans des boîtes). Quatre régions de développement sont présentés. Arrows, l'ADN nucléaire; pointes de flèches, ADNmt. Barre d'échelle, 10 pm. Le chiffre a été modifié depuis 11. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

l'étiquetage EdU est une méthode nouvelle et efficace pour détecter la synthèse d'ADN dans des cellules proliférantes, qui est basée sur l'incorporation et la coloration des analogues de nucléoside dans l'ADN nouvellement synthétisé. Cette méthode est supérieure à la méthode de marquage BrdU en ce qu 'elle est plus rapide et hautement sensible. Plus important encore , il permet une bonne conservation structurelle et efficace pénétration EdU-colorant de l' ensemble du montage des tissus 9, 10. Historiquement, comme une alternative supérieure à l' étiquetage de BrdU, l' étiquetage EdU a été utilisé pour l' étude de la réplication de l' ADN nucléaire au cours de la phase S du cycle cellulaire. Aphidicoline est un inhibiteur de l' ADN polymérase α, qui est la principale polymerase pour la replication de l' ADN nucléaire de la phase S 12 15. la réplication de l'ADN mitochondrial est effectuée par γ de la polymérase d'ADN, ce qui est insensible au traitement aphidicoline. Par conséquent, le traitement à l'aphidicoline avant et pendant l'incubation EdU a inhibé de manière significative EdU incorporation dans l'ADN nucléaire. Cela devraitnoter que aphidicoline peut être stable pendant plusieurs semaines si stocké de manière appropriée, et l'efficacité de l'aphidicoline dans l'inhibition de la réplication de l'ADN nucléaire était variable dans nos mains. Les ovarioles ou chambres d'oeufs avec un fort marquage de l'ADN nucléaire devraient être exclus de l'analyse d'autres données.

la réplication de l'ADN mitochondrial peut être facilement visualisé comme puncta dans le cytoplasme, qui offre aussi un moyen simple de quantifier le niveau de réplication ADNmt en comptant le nombre de EdU puncta, normalisé au volume total du cytoplasme. Logiciel d'imagerie peut être utilisé pour identifier automatiquement EdU lacrymaux dans des images microscopiques, ce qui est particulièrement utile pour des analyses informatiques de grands ensembles de données. Cependant, des précautions doivent être prises, car l'inhibition incomplète de la réplication de l'ADN nucléaire peut conduire à l'incorporation dans EdU loci distincts sur le chromosome et afficher comme puncta l'intérieur du noyau. Aussi dans d'autres cas, l'intensité de l'incorporation dans EdU repliCating ADNmt pourrait être faible, alors que le fond et le bruit pourrait être élevé. Par conséquent, les paramètres individuels pour les analyses d'image automatiques doivent être soigneusement définis. Il est également recommandé que les images doivent être examinées avec les yeux formés pour vous assurer que puncta appropriée EdU sont identifiés.

Visualisation de l' ADNmt nouvellement synthétisé au cours de la drosophile oogenesis donne l'occasion d'examiner comment la réplication de l' ADNmt est régulée dans des conditions physiologiques ou pathologiques, en réalisant l'expérience dans les mouches soumises à une variété de perturbations pharmacologiques ou génétiques. Dans une étude précédente, EdU dosage d'incorporation a été réalisée dans un ADNmt mutant Drosophila mt: CoI T300I 11. Par ailleurs, afin de perturber le potentiel de la membrane mitochondriale, les ovaires ont été traitées avec diverses concentrations de FCCP découpleur mitochondrial ou le 2,4-dinitrophénol (DNP) avant l'incorporation EdU. En fonction des fins expérimentaleset les caractéristiques des médicaments, différentes méthodes peuvent être adoptées pour la livraison effective. Pour les mouches adultes, les médicaments peuvent se présenter sous forme de vapeur (par exemple, l' éthanol et la cocaïne) 16,17 ou des médicaments peuvent être injectés dans l'abdomen, où elle se diffuse rapidement à travers le corps 18. La pratique la plus courante est que les médicaments sont ajoutés à l'aliment de mouche ou un / papier filtre de drogue-saturée de saccharose. Par exemple, l'inhibiteur de l' assemblage des microtubules, la colchicine, a été introduit dans les mouches pendant 2-3 jours avant la dissection de l' ovaire 19. Par conséquent, il est important d'évaluer la méthode de distribution de médicaments et de choisir des concentrations appropriées.

Pour assurer la réussite de l' imagerie réplication ADNmt dans les ovaires chez la drosophile, plusieurs étapes critiques doivent être soigneusement exécutées. Tout d'abord, la préservation de la viabilité et de la santé des ovaires lors de la dissection et EdU incorporation est essentielle (étapes 1 et 2). Le milieu Drosophila de Schneider avec FBS doit être réchauffé à la température ambianteAvant utilisation. Il faut réduire au minimum le contact direct entre les chambres d'œufs et d'outils de dissection ou des embouts de pipette. Les ovaires doivent être immergés dans des solutions tout temps pour éviter la déshydratation. Une mauvaise manipulation des tissus peuvent facilement conduire à faible ou pas de signaux fluorescents. Lors de l'étape de montage de tissu, ovariole doivent être séparés les uns des autres et répartis sur la lame de microscope. Assurez-vous que les chambres d'oeufs ne sont pas empilées les unes sur les autres. Nous avons remarqué que les chambres d'œufs au-delà de l'étape 14 affichés peu incorporation EdU. En outre, en raison de la grande taille, la fin des chambres d'œufs de scène provoquent souvent les chambres d'œufs plus jeunes voisins d'être de mise au point. Ainsi, il est recommandé que les chambres de fin d'œufs de stade être jetés.

Ici , nous fournissons un protocole détaillé pour l' étiquetage répliquer ADNmt dans Drosophila ovaires adultes. Cette méthode permet de quantification simple de réplication ADNmt sous diverses perturbations génétiques et pharmacologiques,et sera utile pour les mécanismes sous-jacents biogenèse mitochondriale du développement et de l'ADNmt héritage de dissection.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions K. Delaney pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le programme intra-muros du National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Schneider' s Drosophila mediumInvitrogen21720-024
FBSInvitrogen10100-147
Paire de pinces Dumont #5 FineScience Tools11252-20
AphidicolinSigmaA0781Aliquote après dissolution dans DMSO. Évitez la décongélation et la congélation répétitives. Protéger de la lumière. Peut être utilisé dans les 6 semaines suivant la dissolution.  ;
FCCPSigmaC2920
DMSOSigmaD2650
Paraformaldéhyde, 16 % EM gradeMicroscopie électronique Sciences15710Le formaldéhyde est toxique ; il doit être manipulé dans une hotte avec protection de la peau et des yeux.
PBSKD MedicalRGF-3190
BSASigmaA7030
Triton X-100SigmaT9284
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit d’imagerieInvitrogenC10337EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, tampon de réaction EdU et additif tampon Edu sont inclus
Sous-unité ATP synthase de souris et anticorps alpha ; (15H4C4)MitoSciencesAb14748Dilution 1:1 000
Anticorps Hts de souris (clone RC)Études développementales Hybridoma Bank (DSHB)hts RCDilution 1:1 000
Chèvre anti-souris Alexa Fluor 568 anticorps secondaireInvitrogenA-11004Dilution 1:200
Milieu de montage Vectashield avec DAPIVector LaboratoriesH-1500
Lamelles en verre, #1.5 22 mm x 22 mmFisher Scientific12-541-B
Lame de microscopeFisher Scientific22-038-103
Vernis à onglesElf Denombreux pigments utilisés dans les vernis à ongles sont fluorescents et s’infiltrent dans les échantillons. Seul un vernis à ongles transparent doit être utilisé.

Références

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