Manipulation génétique de l&#39;agent pathogène des plantes<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions

Résumé

Nous décrivons une stratégie de remplacement de gène robuste pour manipuler génétiquement le champignon Ustilago maydis. Ce protocole explique comment générer des mutants de deletion pour enquêter sur les phénotypes d'infection. Elle peut être étendue à modifier les gènes de manière quelconque, par exemple en ajoutant une séquence codant pour une étiquette de protéine fluorescente.

Résumé

Délétion du gène joue un rôle important dans l'analyse de la fonction génique. L'une des méthodes les plus efficaces pour perturber les gènes de manière ciblée est le remplacement de la totalité du gène avec un marqueur sélectionnable par recombinaison homologue. Au cours de la recombinaison homologue, l'échange d'ADN a lieu entre les séquences avec une grande similitude. Par conséquent, des séquences génomiques linéaires flanquant un gène cible peuvent être utilisés pour diriger spécifiquement un marqueur sélectionnable sur le site d'intégration souhaité. Des extrémités franches de la construction de deletion activent les systèmes de réparation d'ADN de la cellule et ainsi favoriser l'intégration de la construction, soit par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue ou non homologue jonction bout. Dans les organismes avec efficacité la recombinaison homologue, le taux de délétion du gène réussi peut atteindre plus de 50%, ce qui cette stratégie, un système de dissociation génétique précieux. Le champignon Ustilago maydis est un modèle micro-organisme eucaryote montrant tel recombinat homologue efficaceion. Sur ses environ 6.900 gènes, beaucoup ont été caractérisé fonctionnellement avec l'aide de mutants de deletion, et répété échec des tentatives de remplacement de gènes points fonction essentielle du gène. Caractérisation ultérieure de la fonction du gène par le marquage avec des marqueurs ou des mutations des domaines prédits fluorescents repose également sur l'échange d'ADN par recombinaison homologue. Ici, nous présentons le U. maydis stratégie de génération de contrainte en détail en utilisant l'exemple le plus simple, la suppression du gène.

Introduction

Ustilago maydis est un champignon modèle phytopathogènes qui a été largement étudié depuis des décennies ^1,2. Il existe en deux morphologies, une étape non pathogène type levure et une filamenteux, forme infectieuse ^3. Découvertes révolutionnaires universelles telles que les mécanismes de recombinaison et de réparation de l' ADN homologues ont été faites à l'étape de ce champignon ⁴ croissance type levure. En outre, le commutateur morphologique des facteurs de filaments et de virulence infectieuses importantes pour l' infection sont bien caractérisés ^5,6. La connaissance moléculaire de plus en plus sur ....

Protocole

1. Génération de deletion Constructs

1. Générer un plasmide contenant la construction de deletion (figure 1) comprenant un flanc respectif de 1 kb en amont (UF) et le flanc aval (DF) chacune et la cassette de résistance appropriée flanquée par des sites de restriction de coupe émoussés.
   NOTE: Toute stratégie de clonage peut être utilisé (pour le clonage voir référence ²²⁾ , nous recommandons Golden Gate clonage pour ces plasmides ^9.
2. Exciser la suppression construire à partir du plasmide en utilisant un couteau émoussé pour obtenir 1 pg d' ADN de la suppression de construire ^9. Purifier la ....

Résultats

Les constructions de deletion pour les quatre gènes codés dans chitinolytiques U. maydis génome a été généré par clonage Golden Gate utilisation de la cassette Hygr pour la suppression de CTS1, le NATR pour la suppression de CTS2, la cassette d'G418R pour la suppression de CTS3 et CBXR pour la suppression de CTS4 ^20. Une vue d' ensemble de la stratégie de remplacement de gène est illustrée.......

Discussion

Ce protocole décrit comment générer des mutants de délétion pour les études de génétique inverse en U. maydis. Le point de départ est une construction de deletion qui contient des séquences flanquantes du gène d'intérêt contenant des séquences d'environ 1 kb en amont du début et en aval du codon d' arrêt ainsi que d' une cassette de résistance approprié , car il a déjà été optimisé ^7,9 . Les constructions doivent être générées individuellement pour chaque gène et soigneusement vérifié.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide aminobenzoïque (acide libre)	Sigma Aldrich	A-9878
Bacto agar  ;	BD	214010	alternativement utiliser le fournisseur local
Bacto peptone	BD	211677	alternativement utiliser le fournisseur local
Bacto extrait de levure  ;	BD	212750	ou utilisez le fournisseur local
CaCl2*2H2O	Grü ; ssing GmbH	10234	ou utiliser le fournisseur local
Ca-Pantothenat (sel Hemi-Ca.)	Sigma Aldrich	P-2250
Carboxin  ;	Sigma Aldrich	45371
Acides aminés  ;	BD	223050
Cholinchlorid	Sigma Aldrich	C-1879
Acide citrique	ChemSolute	24,321,000	alternativement utiliser le fournisseur local
CuSO4*5H2O	Fluka	61240	alternativement utiliser le fournisseur local
D(+)Saccharose  ;	Roth	4621.1	ou utiliser le fournisseur local
DNA degr. acide libre  ;	Sigma-Aldrich	D-3159
EDTA	Sigma Aldrich	E4378
FeCl3*6H2O	Grü ; ssing GmbH	10288	alternativement utiliser le fournisseur local
Geneticin (G418) disulfate	Sigma Aldrich	A1720
Trichoderma lysing enzymes	Sigma Aldrich	L1412
D(+) Glucose	Caelo	2580	alternativement utiliser le fournisseur local
Glycérine  ;	Fisher Chemical	G065015	également utiliser le fournisseur local
H3BO3	AppliChem	A2940	Substance dangereuse. Veuillez vérifier les consignes de sécurité du fabricant.
Héparine sodium sel	Sigma Aldrich	H3393-50KU
Hygromycine B-solution	Roth	1287.2	Substance dangereuse.  ;
KCl	VWR	26764298	également utiliser le fournisseur local
Kh2PO4	AppliChem	A3620	ou utiliser le fournisseur local
MgSO4 sans eau	Merck	7487-88-9	sans eau est essentiel. Vous pouvez également utiliser le fournisseur local
MnCl2*4H2O	AppliChem	A2087	ou utiliser le fournisseur local
myo-Inositol	Sigma Aldrich	I-5125
Na2-EDTA*2H2O	AppliChem	A2937	utiliser le fournisseur local
Na2MoO4*2H2O	Roth	0274.2	ou utiliser le fournisseur local
Na2SO4	Grü ; ssing GmbH	12174	ou le fournisseur local
NaCl	Fisher Chemical	S316060	le fournisseur local
NaOH	ChemSolute	13 751 000	le fournisseur local
NH4NO3	Roth	K299.1	ou le fournisseur local
Acide nicotinique (acide libre)	Sigma Aldrich	N-4126
Nourseothricin dihydrogen sulfate  ;   ;	Werner BioAgents	5,001,000
Bouillon nutritif  ;	Fournisseurs locaux	Difco
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1) pH 6.7	Sigma Aldrich	P3803	Substance dangereuse. Veuillez vérifier les consignes de sécurité du fabricant.
polyéthylène glycol (PEG)	Sigma Aldrich	P-3640
Acétate de potassium	AppliChem	121479	également utiliser le fournisseur local
Pyridoxine (monochlorure)	Sigma Aldrich	P-9755
Riboflavine  ;	Sigma Aldrich	R4500
RNaseA	Sigma Aldrich	R5503
SDS	Roth	Cn30.3	alternativement utiliser le fournisseur local
petite seringue	BD	300300	alternativement utiliser
le fournisseur local filtre stérile, 22 µ ; m	VWR	28145-477	alternativement utiliser le fournisseur local
Sorbitol	Roth	6213.1	alternativement utiliser le fournisseur local
Chlorhydrate de thiamine	Serva	36020.02	alternativement utiliser le fournisseur local
tri-Na-Citrate	Fisher Chemical	S332060	alternativement utiliser le fournisseur local
Tris- (hydroxyméthyl) aminométhane	VWR	103156X	ou utiliser le fournisseur local
Tris chlorhydrate	Roth	9090.4	ou utiliser le fournisseur local
Triton X-100.	Serva  ;	37240	ou utiliser le fournisseur local
ZnCl2	Fluka	96470	utiliser le fournisseur local
Composition des solutions/préparation du matériau			Composition des solutions
Carboxin			Stock : 5 mg/ml dans du méthanol, concentration finale : 2 & micro ; g/ml
de plaques			0,25 % (p/v) d’acides casaminés, 0,1 % (p/v) d’extrait de levure, 1,0 % (v/v) de solution vitaminique de vacances, 6,25 % (v/v) ; Solution de sel de Holliday, 0,05 % (p/v) de dégr. d’ADN. acide libre, 0,15 % (p/v) NH4NO3, 2,0 % (p/v) de gélose Bacto ; ajuster à pH 7,0 en utilisant 5 M de NaOH ; Après l’autoclavage, ajouter 1 % de glucose  ;
Génétique (G418)			Stock : 50 mg/ml en H2O, concentration finale : 500 µ ; g/ml
de billes de verre lavées au HCl (0,35-0,45 mm)			Couvrir les billes de verre avec du HCl concentré (25 %, 7,8 M) et incuber pendant 60 min. Balancer plusieurs fois. Décanter le HCl (conserver le liquide décanté) et laver les billes de verre avec 3 M HCl (conserver le liquide décanté). Laver plusieurs fois les billes de verre avec du H2O double distillé jusqu’à ce que le pH soit de 7 (le liquide ne doit plus être jaune-vert). Aliquote les perles de verre et séchez-les à 180 °C. Le HCl décanté doit être neutralisé avant d’être éliminé.
d’héparine			: 15 mg/ml
solution			16.0 & permil ; (p/v) KH2PO4, 4.0 &permil ; (p/v) Na2SO4, 8.0 &permil ; (p/v) KCl, 1,32 &permil ; (p/v) CaCl2*2H2O, 8.0 et permil ; (v/v) oligo-éléments, 2.0 &permil ; (p/v) MgSO4 ; filtrat stérile
Holliday solution vitaminée  ;			0.1&permil ; (p/v) Thiamine, 0,05&permil ; (p/v) riboflavine, 0,05&permil ; (p/v) Pyridoxine, 0,2&permil ; (p/v) Ca-Pantothenat, (0,05&permil ; (p/v) Acide aminobenzoïque, 0,2&permil ; (p/v) Acide nicotinique, 0,2&permil ; (p/v) Cholinchloride, 1,0&permil ; (w/v) myo-Inositol ; peut être stocké à -20 ° ; C
Hygromycine			Stock : 50 mg/ml dans PBS, concentration finale : 200 & micro ; g/ml
Nourseothricine			Stock : 200 mg/ml dans H2O, concentration finale : 150 µ ; g/ml
NSY-glycérol-moyen			0,8 % (p/v) de bouillon nutritif, 0,1 % (p/v) d’extrait de levure, 0,5 % (p/v) de saccharose,  ; 80,0 % (v/v) 87 % de glycérine (f.c. 69,6 %)  ;
RegLight			1,0 % (p/v) d’extrait de levure 0,4 % (p/v) de Bacto Peptone, 0,4 % (p/v) de saccharose, 18,22 % (p/v) de sorbitol, 1,5 % (p/v) Agar
SCS, pH 5,8			Solution 1 : 20 mM de tri-Na-citrate, 1 M de sorbitol ; colution 2 : 20 mM d’acide citrique, 1 M de sorbitol, ajouter la solution 2 dans la solution 1 jusqu’à ce que le pH 5,8 soit atteint ; autoclave
STC, pH 8			1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM CaCl2 ; filtre
stérile STC/PEG			40 % (v/v) PEG dans un tampon STC  ;
Tampon TE, pH 8			1,31 mM Tris-Base, 8,69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase			10 µ ; g/ml RNaseA dans le tampon TE
Oligo-éléments			0,06&permil ; (p/v) H3BO3, 0,14&permil ; (p/v) MnCl*4H2O, 0,4 &permil ; (p/v) ZnCl2, 0,4 &permil ; (p/v) Na2MoO4*H2O :2, 0.1 &permil ; (p/v) FeCl3*6H2O, 0,04&permil ; (p/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution			12,5 mg/ml SCS ; filtre stérile ; préparer peu de temps avant utilisation
Tris-HCl pH 7,5			806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base ; vérifier le pH et si nécessaire ajuster avec HCl ; autoclave
Usti-lyse tampon 1, pH 8			10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM de NaCl, 1 % (p/v) SDS, 2 % (v/v) de TritonX-100, 1 mM d’EDTA. Ne mesurez pas le pH à l’aide d’un pH-mètre.  ;
Usti-lysis buffer 2			mix Usti lysis buffer 1 avec 1x TE dans un rapport de 1:1
YEPS-Light medium			1,0 % (p/v) d’extrait de levure, 0,4 % (p/v) de Bacto Peptone, 0,4 % (p/v) de saccharose, pour plaques : 1,5 % (p/v) de Bacto Agar

sel Le ou ou CM Stock de sel de Holliday