Article de méthode

A High Throughput, multiplexée et ciblée protéomique CSF Assay à Quantifier neurodégénératifs Biomarqueurs et apolipoprotéine E isoformes Status

DOI :

10.3791/54541

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20 octobre 2016

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1Centre for Translational Omics, Genetics and Genomic Medicine Deptartment, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 2Dementia Research Centre, Institute of Neurology, University College London, 3Clinical Neurochemistry Laboratory, Institute of Neuroscience and Physiology, Department of Psychiatry and Neurochemistry, The Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 4Neurology Unit, Department of Pathophysiology and Transplantation, University of Milan, 5Great Ormond Street Hospital for Children, University College London

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons un haut-débit, multiplex, et le liquide céphalorachidien protéomique ciblée (CSF) test développé avec le potentiel pour la traduction clinique. Le test peut quantifier des marqueurs potentiels et les facteurs de risque pour la neurodégénérescence, telles que les variantes de l'apolipoprotéine E (E2, E3 et E4), et mesurer leur expression allélique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De nombreuses maladies neurodégénératives manquent encore de traitements efficaces. biomarqueurs fiables pour identifier et classer ces maladies seront importantes dans le développement de nouvelles thérapies futures. Souvent, de nouveaux biomarqueurs potentiels ne font pas dans la clinique en raison des limites de leur développement et des coûts élevés. Cependant, la protéomique ciblées en utilisant la réaction Multiple Surveillance chromatographie liquide-tandem / spectrométrie de masse (MRM LC-MS / MS), en utilisant spécifiquement triple spectromètres de masse quadripolaires, est une méthode qui peut être utilisée pour évaluer rapidement et valider des biomarqueurs pour la traduction clinique dans les laboratoires de diagnostic . Traditionnellement, cette plate-forme a été largement utilisée pour la mesure de petites molécules dans les laboratoires cliniques, mais il est le potentiel d'analyser les protéines, qui en fait une alternative intéressante à la technique ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) méthodes basées. Nous décrivons ici comment protéomique ciblée peut être utilisée pour mesurer les marqueurs multiplexés de démence, y compris la détection et la quantification du facteur de risque connu apolipoprotéine E isoforme 4 (ApoE4).

Afin de rendre le dosage approprié pour la traduction, il est conçu pour être rapide, simple, hautement spécifique et rentable. Pour ce faire, chaque étape dans le développement de l'essai doit être optimisé pour les protéines et les tissus individuels, ils sont analysés dans. Cette méthode décrit un flux de travail typique, y compris divers trucs et astuces pour le développement d'une cible protéomique MRM LC-MS / MS pour la traduction .

Le développement de la méthode est optimisée en utilisant des versions personnalisées de synthèse de peptides tryptiques quantotypic, qui calibrent MS pour la détection, puis enrichi en CSF pour déterminer l'identification correcte du peptide endogène dans la séparation chromatographique avant l'analyse dans les MS. Pour y parvenir absolute quantification, versions standard interne isotopes stables marqué des peptides avec peu acides marqueurs de séquence d'acide et contenant un site de clivage de la trypsine, sont inclus dans l'essai.

Introduction

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L'impact croissant des maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la démence Lewy corps et la maladie de Parkinson, devient un enjeu socio - économique dans de nombreux pays 1. Il existe un besoin de marqueurs supplémentaires qui peuvent être utilisés pour identifier et classer les patients dans les premiers stades de la maladie, et de surveiller tous les nouveaux traitements potentiels. L'objectif global de cette méthode est de créer un pipeline générique pour une manière simplifiée, économique et plus rapide de la validation de marqueurs de CSF potentiels de neurodégénérescence. La raison est d'utiliser la protéomique ciblées ou peptide MRM LC-MS / MS comme une méthode facilement amendable pour évaluer plusieurs biomarqueurs protéiques potentiels à partir d'expériences de découverte. Ceux-ci peuvent encore être multiplexes sur une séparation rapide chromatographique (<10 min) et évalués. Dans cet écran multiplex pour les biomarqueurs neurodégénératives, nous avons inclus la démence facteur de risque connu apolipoprotéine isoforme E4 (ApoE4) donc nous CAn déterminer simultanément son statut et son niveau d'expression, par ce qui élimine la nécessité pour les tests de génotypage séparés 2. LC MS / MS est couramment utilisé comme la méthode de choix pour quantifier avec précision de petites molécules sur d'autres méthodes telles que ELISA ou dosage radio-immunologique (RIA). Ce changement dans l'utilisation de la technologie MS aux protéines d'analyse, a été tirée principalement par des problèmes avec les technologies immunodéprimés. Ceux-ci comprennent spécificité croisée, le lot à la variation de lot, durée de vie limitée, et le coût élevé. Par conséquent, la protéomique ciblées est en train de devenir une alternative de plus en plus à des méthodes d'anticorps à base tels que Western blot, RIA et ELISA. Cependant, la capacité de multiplexer plusieurs marqueurs dans une analyse est le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes basées sur immuno-3. La technique est applicable à de nombreux tissus et a été utilisé en tant que stratégie de validation de nombreuses études protéomiques , y compris le plasma et l' urine 4 5,6.

Le technique peut être appliqué à tout laboratoire qui a accès et de l'expertise dans l'utilisation de spectromètres de masse triple quadripôle. design Peptide est relativement simple avec l'utilisation croissante de bases de données open source. Le marché concurrentiel de la synthèse sur mesure des peptides rend beaucoup plus abordable. peptides lourds, cependant, sont chers et donc les marqueurs doivent être évalués sur une petite cohorte avant de passer à une plus grande échelle. Il existe un potentiel de croissance pour la technique à utiliser dans les paramètres cliniques de diagnostic, avec la plupart des grands hôpitaux ayant des plates-formes triples quadripôles à base qui peuvent être facilement adaptés pour exécuter des analyses protéomiques ciblées. Une telle application de la méthode, ce qui en fait dans le cadre de diagnostic de routine, est son application récente au dépistage de tache de sang nouveau - né pour l' anémie falciforme 7.

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Protocole

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NOTE:. Un schéma du protocole global décrit ici est donnée dans le Fi gurer 1 Tous les échantillons utilisés pour le développement de cette méthode sont des échantillons cliniques de diagnostic excédentaires et avoir l' approbation éthique du comité de Londres Bloomsbury éthique.

figure-protocol-1
Figure 1. Schéma illustrant le processus global de création d' un CSF ciblées MRM LC-MS / MS. Assay peptides marqueurs du candidat pour l' évaluation sont choisis parmi les protéines cibles. Grâce à l'utilisation de peptides synthétisés sur mesure, un procédé de multiplexage LC-MS / MS cible est créée. Après évaluation, le test peut être utilisé pour évaluer l'efficacité des marqueurs potentiels de la neurodégénérescence.

1. Peptide Sélection et Design

NOTE: Les critères pour un peptide marqueur est qu'il doit être unique (protéotypique (quantotypic). Pour déterminer si un peptide est unique ou non, le 'explosion' outil de recherche sur le site Uniprot (http://www.uniprot.org/blast/) peut être utilisé.

  1. Définir une liste de protéines cibles (marqueurs), à savoir, ApoE (voir le tableau 2).
    NOTE: Si le marqueur a été identifié à partir de précédentes expériences de profilage protéomique 8, puis sélectionnez le peptide qui donne la meilleure réponse de cet ensemble de données.
  2. Si cette information est disponible, utiliser les sites Web open source, tels que in silico trypsine digestion des protéines cibles, en utilisant un outil logiciel comme MS-Digest.
  3. Choisissez le peptide qui est tryptique et non susceptible d'afficher des modifications traductionnelles.
    NOTE: Cette information peut être vérifiée sur le site Uniprot www.uniprot.org. Évitez peptides sujettes à modification chimique pendant LC-MS préparation des échantillons.
  4. Commander la synthèse personnalisée des peptides choisis.
    NOTE: peptides marqueurs peuvent être synthétisés sur mesure par diverses sociétés commerciales. Pour le peptide ApoE quantotypic utilisé pour mesurer les niveaux d'ApoE totaux a été déterminée à AATVGSLAGQPLQER. Les séquences de peptides protéotypiques utilisées pour déterminer les variantes E2 et E4 sont les peptides tryptiques de la position 158 (RLAVYQAGAR et CLAVYQAGAR) et la position 112 (LGADMEDVCGR et LGADMEDVR), respectivement.

2. Préparation des Peptides standard

Remarque: Afin de sélectionner les meilleures transitions quantitative, la détection de la matrice rachidien (LCR) doit être optimisée. La façon la plus efficace d'optimisation de peptides multiplexés est de créer des pools de peptides à des concentrations connues. Ces piscines peuvent ensuite être utilisés pour le développement de la méthode et des courbes standards.

  1. Resuspendre peptides synthétiques (détails peptidiques sont donnés dans le tableau 2) à 1 mg / stock mlconcentration selon les instructions du fabricant. Par défaut, si les instructions ne sont pas disponibles, les peptides resuspendre dans 50:50 (v / v) acétonitrile (ACN) / H 2 O.
  2. Préparer les dilutions 1:10 du peptide à partir de la concentration en stock et piscine 1000 pmol de chaque peptide dans un tube de microcentrifugeuse de liaison faible. Sécher dans un concentrateur Speed-vac la piscine finale et conserver à -20 ° C. Préparer plusieurs piscines pour une utilisation future.
  3. Aliquoter 100 pi de CSF dans des tubes de liaison faible. Lyophiliser la CSF.
  4. Resuspendre une aliquote de mise en commun de 1000 pmol peptides dans un tampon de digestion (HCl 100 mM Tris, pH 7,8, 6 M d'urée, 2 M Thiourea, 2% ASB14) pour obtenir des concentrations de 10 et 1 pmol / ul.
  5. De Spike les peptides regroupés dans les 100 aliquotes lyophilisées de CSF à 0, 1, 2, 5, 10 et 15 concentrations de particules. Ajouter 20 ng de protéine non apparentée comme la levure intacte énolase pour agir en tant que standard interne et de contrôle pour la digestion de l'efficacité trypsin.
  6. Compléter les aliquotes CSF avec tampon de digestion à un montant final de 20 pi. Vortex.
  7. Ajouter 1,5 pl de dithiothréitol (30 mg dans 1 ml de Tris HCl 100 mM, pH 7,8) et agiter à la température ambiante pendant 1 h.
  8. Ajouter 3 pi de iodoacétamide (35 mg dans 1 ml de Tris HCl 100 mM, pH 7,8) et agiter à la température ambiante pendant 45 minutes dans l'obscurité.
  9. Ajouter 165 ul de ddH 2 O.
  10. Ajouter 10 pl de 0,1 pg / pl de solution de trypsine modifiée de qualité séquençage remis en suspension dans 50 mM de tampon de bicarbonate d'ammonium, pH 7,8. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° CO / N et arrêter la digestion par la congélation des échantillons. Magasin digère à -20 ° C jusqu'au moment de l'analyse.

3. Optimisation de la sclérose en plaques Peptide de détection

  1. Copiez et collez la séquence du peptide à optimiser, dans un logiciel approprié, par exemple, Skyline 9. Cliquer sur la séquence peptidique pour obtenir les informationsdes ions de masse d'ions précurseurs et des produits attendus.
  2. Diluer les peptides de concentration en stock (voir section 2.1) suite à 1 ng / ml de concentration pour MS développement de méthodes.
  3. infuser directement les peptides dans le spectromètre de masse à débit optimisé (généralement 0,1 à 0,8 ml / min) et 0-5% d'énergie de collision.
  4. Acquérir le spectre MS afin d'identifier les ions précurseurs à charges multiples expérimentales 8. Choisissez l'ion précurseur (m / z) qui donne le plus d'intensité (ou une liaison double ions précurseurs triplement chargés sont conseillés).
  5. Réinjecter le peptide et appliquer une énergie de collision de fragmenter le peptide par induite par collision de dissociation (CID). Optimiser les énergies de cône et de collision pour obtenir le meilleur modèle de fragmentation (ions fragments seuls ou doublement chargés, et la masse de fragment ionique de préférence plus grand que l'ion parent, il est conseillé).
  6. Vérifiez que les transitions obtenues expérimentalement correspondent transitions générées in silico </ Em> (comme décrit à l'étape 3.1). Enregistrer la liste de transition dans le fichier de méthode MRM en utilisant au moins 2 transitions les plus intenses par ion précurseur. Inclure 2 transitions: 1 pour la quantification et 1 pour confirmation dans l'essai final.
    NOTE: Certains fabricants MS ont une fonction (c. -à- Waters Intellistart) pour MRM automatisé ou l' optimisation d'analyse SRM. Si possible infuser des peptides avec des phases mobiles combinées à 50 - 70% d'ACN avec 0,1% FA.

4. Méthode LC-MRM Développement

NOTE: Analyser le mélange de peptides synthétiques par une chromatographie en phase liquide système (UPLC) couplé à spectromètre de masse triple quadripôle Ultra Performance. Vérifiez que la source est propre. Solvant A est ddH 2 0 avec 0,1% FA; Solvant B est ACN avec 0,1% FA.

  1. Utiliser le système LC-MS équipé d'une colonne garnie UPLC C-18 phase (1,6 um de diamètre, de 90 pores A, 2,1 mm x 50 mm de longueur) et fixée à une pré-colonne de la même phase.
  2. Décongelez digests CSF sur la glace, centrifugeuse à 16.000 g pendant 10 min et de transfert de 60 ul dans 300 ul flacons d'insertion de verre et stocker le dossier à -20 o C.
  3. Injecter la plus forte concentration du point de la courbe standard en utilisant 10 min 1-40% gradient ACN linéaire (voir le tableau 1 pour les paramètres de gradient)
  4. Ouvrez le chromatogramme et la note le temps de rétention résultant et les deux principaux les plus intenses transitions (quantitatives) par peptide avec toutes les transitions créées à l'étape 3.
  5. Sur la base de cette information, mettre à jour une méthode de MRM 10 min (créé à l' étape 3.6) avec des canaux chronométrés pour mesurer des peptides (voir la figure 2 pour un exemple). Pour maintenir la sensibilité, gardez chaque canal avec des points par pic supérieur à 8 et le temps de séjour supérieur à 0,01 s pendant au moins une transition pour chaque peptide.
  6. Inclure «retards solvant» dans la méthode MRM: une au début jusqu'à 10 secondes avant la première élution de pic etl'autre à la fin du procédé, 20 secondes après le dernier pic d'élution. Pour ce faire, en sélectionnant «retards solvant» dans les événements de la méthode dans MS fichier de méthode.
  7. Exécutez la courbe standard grâce à la méthode de MRM chronométré et veiller à ce qu'il n'y a pas d'interférence avec des pics non spécifiques transitions (générés à l'étape 3.6) par la vérification de la linéarité.
  8. Déterminer si les peptides sont détectables en exécutant le contrôle groupé non dopés et le LCR de la maladie grâce à la méthode.
  9. Retirer les peptides qui sont inférieurs à la limite de détection du dosage.

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Figure 2. Exemple de MS Méthode dynamique MRM. Timed canaux de transitions peptidiques peuvent être regroupées en fonction des temps de rétention établis. L'activation de MRM à incorporer de façon synchronisée avec les peptides marqueurs sélectionnés éluent de la colonne de chromatographie, qui minimise le nombre de transitions sur une période de temps et augmente la sensibilité de l'essai. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

5. Ajout de normes internes

NOTE: Comme décrit précédemment 10, les normes internes stables marqués d'un isotope peuvent être inclus dans l'essai. En raison de la charge de ces normes, il est conseillé de d'abord évaluer les peptides dans la matrice.

  1. Déterminer les peptides idéaux optimisés pour la détection dans le LCR: choisir les peptides qui sont les plus récurrents, avec la plus forte intensité et sans pics d'interférence.
  2. Conception des peptides correspondant à des étiquettes lourdes comprennent 13 C 15 N d'acides aminés qui augmentent la masse du peptide d'au moins 6 Da par rapport au peptide endogène. En outre, ajouter une balise de 4 - 6 acides aminés supplémentaires à l'extrémité N ou C-terminale de la pep lourdemarée pour contrôler la digestion tryptique.
  3. Diluer normes internes stables marqués d'un isotope dans un tampon de digestion (voir étape 2.4). Déterminer la quantité idéale de stable étalon interne marquée par un isotope qui sera enrichi dans le LCR par dopage dans différents niveaux en fonction des abundancies précédemment observées au cours du développement. But pour atteindre environ 1: 1 de la norme marquée par un isotope stable au peptide endogène.
    NOTE: Les normes internes des isotopes stables marqué peuvent être synthétisés par diverses sociétés commerciales.

6. LC-MRM Dosage de CSF Des échantillons de patients

  1. De Spike optimisé quantité de normes marqués par des isotopes stables dans 100 pi de CSF et lyophiliser le mélange.
  2. Reprendre le CSF dans 20 pi de tampon de digestion et effectuer la digestion comme décrit aux points 2.7 - 2.10.
  3. Analyser les échantillons en utilisant la méthode LC-MRM développé à l'étape 4.
  4. Pour l'analyse quantitative, exécutez la pep normemarées à des concentrations de 0 à -15 pmol une courbe standard. Voir l'étape 2.5 pour la préparation de la courbe standard.

Analyse 7. Données

NOTE: quantitative des données est basée sur le rapport d'intensité des normes internes de pointe de référence (peptides lourds marqués). Des informations détaillées concernant / MRM analyse des données de SRM a déjà été décrite 10. données Ratio peuvent ensuite être utilisés dans une courbe standard pour déterminer les niveaux absolus ou les calculer à partir de la concentration ajoutée de peptide lourd marqué.

  1. Analyser les données LC-MRM en utilisant un logiciel standard de 10 fabricants les spectromètres de masse de. Vous pouvez également utiliser le logiciel Skyline pour analyser les données quantitatives MRM 10.
  2. Vérifiez la sensibilité de la course en vérifiant la réponse d'un étalon interne tel que le énolase de levure à pointes ou à une norme marquée par un isotope stable dans chaque série. Veiller à ce que le coefficient de variation (CV) ne dépasse pas25%.
  3. examiner manuellement l'annotation de données pour assurer l'exactitude. Analysez chaque peptide et le rapport à une norme marquée par un isotope stable interne appropriée, à savoir, utiliser la version stable marquée par un isotope du peptide si elle est disponible.
  4. Pour obtenir des valeurs absolues de pmol pour 100 ul de CSF, exécutez les données de rapport dans les courbes standard appropriées qui ont été exécutés en même temps.
  5. Calculer le coefficient de variation (CV). CV pour chaque peptide doit être inférieure à 25% et inférieur à 15% pour les peptides abondants élevés.
    NOTE: pmol de valeur absolue pour 100 valeurs de CSF pi peut être utilisé dans l'analyse statistique aval subséquente.

8. apolipoprotéine E isoforme Status

Remarque: Pour déterminer l'état de l'ApoE isoforme, la présence des peptides correspondants peut être effectuée en déterminant la présence de chaque isoforme.

  1. Considérons le ApoE dans 100 pi de seuil de CSF de> 1000 signaux-à-bruit positif pour ce peptide. Voir la figure 5 pour les peptides requis / absent pour déterminer le statut des isoformes d'un patient. Déterminer l'expression allélique en calculant le% de chaque isoforme au total expression ApoE.

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Résultats

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En utilisant le procédé décrit ci - dessus, un dosage multiplex à haut débit 10 min constitué de 74 peptides à partir de 54 protéines a été mis au point, en tant que dosage de marqueurs des maladies neurodégénératives maladies et à corps de Lewy (LBD) d'Alzheimer 8. La figure 3 montre un chromatogramme de multiplexage publiée 8 précédemment des marqueurs peptidiques significatifs de l'analyse. Les peptides inclus dans l'essai et de leurs transitions...

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Discussion

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Comme avec tous les tests basés sur la SEP, les étapes critiques du procédé sont la détermination des quantités appropriées et précises des normes internes. Si la quantification absolue est utilisée, alors les quantités correctes de peptides enrichis dans la courbe standard sont également critiques.

Notre test ne nécessite pas la précipitation du CSF ou l'utilisation de tout type d'étapes de nettoyage vers le haut ou dessalage avant l'analyse de MS - il est un procédé de réaction...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été financé et facilité par l’initiative de recherche GOSomics de l’Institut national de recherche en santé, du Centre de recherche biomédicale de l’hôpital Great Ormond Street et du Centre de spectrométrie de masse biologique de l’UCL à l’Institut de santé infantile de l’UCL avec des dons aimables de la Fondation Szeban Peto. Le Centre de recherche sur la démence est un centre de coordination de la recherche sur la maladie d’Alzheimer au Royaume-Uni. Les auteurs remercient Alzheimer’s Research UK, l’unité de recherche biomédicale sur la démence Queen Square du NIHR, le centre de recherche biomédicale UCL/H et le centre de neurologie expérimentale Leonard Wolfson.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acétonitrile (ACN), grade LC-MSFisherA955-1
Acide formique, grade LC-MS,FisherA117-50
Dithiothréitol (DTT)Sigma  ;D5545 - 5 g
d’acide chlorhydrique, 37 % p/pVWR  ;BDH3028 - 2,5 LG
Iodoacétamide   ;Sigma  ;I1149 - 5 g
Hydroxyde de sodium (NaOH)FisherS318-500
Trypsine, qualité séquençage, modifiéePromegaV5113
Acide trifluoroacétique (TFA), qualité LC-MSFisherA116-50
UreaSigmaU0631- 500 g
Eau, LC-MS ULTRA ChromasolvFluka14263
Peptides synthétisés sur mesure dessalés 1-4 mgGenscriptacide
aminé lourd personnalisé [13C ; 15N] peptides personnalisésGenscriptpersonnalisé
ASB 14Merck Millipore182750 - 25 g
ThiouréeSigmaT7875 - 500 g
Base TrisSigmaT6066
Précolonne VanGuardWaters186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μ ; m  ; Colonne de 2,1 x 50 mmEaux186007114
Levure Enolase  ;SigmaE6126
300 μ ; l flacons en verre transparent à visFisher scientific03-FISV
Bouchons à vis à fente en Y  ;Fisher scientific9SCK-(B)-ST1X
LyophilisateurEdwards Mudulyo  ;Mudulyo
Concentrateur/Aspirateur rapideEppendof  ;concentrateur  ; plus 5301
Spectromètre de masse Xevo -TQ-SWaters
Système UPLC AcquityWaters
Système

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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