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Détection colorimétrique de bactéries à l'aide de test Litmus

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DOI :

10.3791/54546

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17 septembre 2016

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1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole de détection colorimétrique d’E. coli à l’aide d’un test décisif modifié qui tire parti d’un DNAzyme clivant l’ARN, de l’uréase et de billes magnétiques.

Résumé

Il existe une demande croissante pour des méthodes simples mais toujours efficaces qui peuvent être utilisées pour détecter des agents pathogènes spécifiques pour des applications sur le lieu d’intervention ou sur le terrain. Ces méthodes doivent être conviviales et produire des résultats fiables qui peuvent être facilement interprétés par les spécialistes et les non-professionnels. Le test décisif pour le pH est simple, rapide et efficace car il signale le pH d’un échantillon de test via un simple changement de couleur. Nous avons développé une approche pour tirer parti du test décisif pour la détection bactérienne. La méthode exploite un ADN clivage de l’ARN spécifique à la bactérie pour remplir deux fonctions : reconnaître une bactérie d’intérêt et fournir un mécanisme pour contrôler l’activité de l’uréase. Grâce à l’utilisation de billes magnétiques immobilisées avec un conjugué DNAzyme-uréase, la présence de bactéries dans un échantillon d’essai est relayée à la libération d’uréase des billes à la solution. L’uréase libérée est transférée dans une solution d’essai pour hydrolyser l’urée en ammoniac, ce qui entraîne une augmentation du pH qui peut être visualisée à l’aide du test décisif classique.

Introduction

Les agents pathogènes bactériens sont l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. Les éclosions d’infections nosocomiales, d’agents pathogènes d’origine alimentaire et de contaminants bactériens dans l’environnement constituent des menaces graves et continues pour la santé et la sécurité publiques. Pour prévenir ces épidémies, il faut des outils efficaces permettant de détecter les agents pathogènes en temps opportun dans divers contextes. Les tests simples, mais toujours efficaces, portables et rentables sont très convoités, en particulier dans les régions qui sont sensibles aux épidémies mais qui ne peuvent pas se permettre des installations de test coûteuses. 1-3 Bien qu’il existe une multitude de méthodes de détection des bactéries, bon nombre d’entre elles ne conviennent pas comme outils de dépistage ou d’analyse sur site, car elles nécessitent de longues durées d’analyse, des instruments coûteux et des procédures d’analyse compliquées.

Les tests colorimétriques sont particulièrement intéressants pour les applications sur le terrain ou sur le terrain, car les changements de couleur peuvent être facilement détectés à l’œil nu. Le test décisif pour le pH est simple, rapide et efficace. Bien qu’il s’agisse d’une technologie très ancienne, elle est encore largement utilisée aujourd’hui en raison de sa simplicité et de son efficacité. Étonnamment, ce test simple n’avait jamais été modifié pour permettre la détection d’autres analytes avant que nous ne développions récemment une approche de modification de ce test pour le test E. coli. 4

Le test décisif élargi pour E. coli utilise trois composants supplémentaires : un ADN de clivage de l’ARN activé par E. coli (EC1), 5 uréases et des billes magnétiques. Les DNAzymes font référence à des molécules d’ADN monocaténaire synthétiques à activité catalytique. 6 Ils peuvent être isolés à partir de pools d’ADN à séquence aléatoire en utilisant la sélection in vitro. 7,8 Ils sont très stables et peuvent être produits de manière rentable à l’aide d’une synthèse d’ADN automatisée à haut rendement. 9 Pour ces raisons, les DNAzymes, en particulier les DNAzymes clivant l’ARN, ont été largement étudiés pour des applications de biodétection. 6,10,11 Des capteurs d’ADN clivants d’ARN ont été développés pour détecter les ions métalliques,12-16 petites molécules,17,18 les pathogènes bactériens5,19-21 et les cellules cancéreuses. 22 Étant donné la grande disponibilité d’ADNAzymes induits par l’ARN induits par la cible, tout test qui utilise un DNAzyme peut potentiellement être étendu pour détecter une gamme variée d’analytes.

L’uréase est choisie pour sa capacité à hydrolyser l’urée en ammoniac,23,24 entraînant une augmentation du pH. L’uréase est également très efficace, stable et susceptible d’être conjuguée à d’autres biomolécules. Par conséquent, nous avons postulé qu’un conjugué d’un DNAzyme à clivage de l’ARN avec l’uréase permettrait l’utilisation du test décisif pour la détection d’autres cibles. 5

L’action de l’ADN clivage de l’ARN est relayée à l’augmentation du pH médiée par l’uréase grâce à l’utilisation de billes magnétiques qui sont immobilisées avec le conjugué DNAzyme-uréase. Étant donné que l’activité de l’enzyme ADN étudiée dépend strictement de celle d’E. coli, la présence de cette bactérie dans la solution d’essai entraînera la libération d’uréase des billes magnétiques dans la solution, qui est ensuite prélevée et utilisée pour hydrolyser l’urée dans une solution rapporteure contenant un colorant sensible au pH. Le résultat final de cette procédure est un changement de couleur qui peut être facilement signalé par le colorant ou le papier pH.

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Protocole

1. Préparation des réactifs et tampons

  1. 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic acide (EDTA)
    1. Dans un bécher de 2 litres, ajouter 186,1 g d' EDTA à 800 ml d'eau déminéralisée distillée (ddH 2 O). Ajuster le pH de la solution à 8,0 en utilisant des pastilles de NaOH. Ajouter ddH 2 O à un volume final de 1,0 L et transférer la solution dans une bouteille en verre autoclavable pour autoclavage et conserver à 4 ° C.
  2. EDTA 10 x Tris-borate (TBE 10x)
    1. Dans un 4 L bêcher en plastique, ajouter 432 g de Tris-base, 200 g d' acide borique, 80 ml ​​d'EDTA 0,5 M (pH 8,0) et ddH 2 O à un volume final de 4 L. Mélanger à l' aide d' une barre d'agitation jusqu'à ce que tous les composants sont dissous. Transférer la solution dans des bouteilles en verre 1 L pour autoclavage et conserver à 4 ° C.
  3. 10% polyacrylamide dénaturant Stock
    1. Dans un 4 L bêcher en plastique, ajouter 1681,7 g d' urée, 400 ml 10x TBE, 1 L de 40% d' acrylamide / bisacrylamide (29: 1) solution et ddH 2 O jusqu'à ce que le fle volume inal est de 4 L. Mélanger à l'aide d'une barre d'agitation jusqu'à ce que l'urée est dissoute. Transférer la solution à 1 L bouteilles de verre ambré et conserver à 4 ° C.
  4. 2x Gel Loading Buffer (2x GLB)
    1. Dans un bécher de 200 ml en verre, ajouter 44 g d'urée, 8 g de saccharose, 10 mg de bleu de bromophénol, 10 mg de xylène-cyanol FF, 400 ul de 10% de dodécylsulfate de sodium et 4 ml de 10 x TBE. Ajouter ddH 2 O à un volume final de 40 ml et dissoudre les composants avec un léger chauffage à 50 ° C tout en mélangeant avec un barreau d'agitation magnétique. Transfert aliquote de 1 ml à 1,5 ml microtubes et conserver à 4 ° C.
      NOTE: L'usage antérieur nécessite un bref chauffage à 90 ° C pour redissoudre tout solide.
  5. 1 M de Tris-chlorhydrate (Tris-HCl) (pH 7,5)
    1. Dans une bouteille en verre, ajouter 12,1 g de Tris base , et 70 ml de ddH 2 O et mélanger jusqu'à ce que le solide soit dissous. Ajuster le pH à 7,5 en utilisant 1 M d'acide chlorhydrique (HCl). Ajouter ddH 2 O jusqu'à un volume final de 100 ml, autoclave et store à 4 ° C
  6. 5 M de chlorure de sodium (NaCl)
    1. Dans une bouteille en verre, dissoudre 58,4 g de NaCl dans 150 ml de ddH 2 O. Réglez le volume à 200 ml avec ddH 2 O. Conserver à 4 ° C.
  7. Tampon d'élution de l'ADN
    1. Dans un flacon en verre, mélanger 2,0 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 7,5), 8,0 ml de NaCl 5 M et 0,4 ml d'EDTA 0,5 M (pH 8,0). Réglez le volume à 200 ml avec ddH 2 O, autoclave et conserver à 4 ° C.
  8. 1 M de 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7,4)
    1. Dans une bouteille en verre, dissoudre 2,38 g d'HEPES dans 80 ml ​​de ddH 2 O. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH 5 N et O 2 ddH ajouter à un volume final de 100 ml.
  9. 1 M de chlorure de magnésium (MgCl 2)
    1. Dans une bouteille en verre, ajouter 2,03 g de MgCl 2 6H 2 O et amener le volume à 100 ml avec ddH 2 O.
  10. Reaction Buffer (RB)
    1. Dans un tube conique de 50 ml, ajouter 50 pl de 1 M de HEPES (pH 7,4), 1,5 ml de NaCl 5 M, 0,75 ml de 1 M de MgCl2, et 5 pi de Tween-20. Ajouter ddH 2 O à un volume final de 50 ml. Mélanger la solution et filtrer dans un autre tube conique en utilisant un filtre à seringue (0,22 um) et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
  11. Un tampon de liaison (BB)
    1. Dans un tube conique de 50 ml, ajouter 500 pi de 1 M de Tris-HCl (pH 7,5), 8,8 g de NaCl, 50 pi de 1 M de MgCl2, et 5 pi de Tween 20. Ajouter ddH 2 O à un volume final de 50 ml. Mélanger la solution et filtrer dans un autre tube conique en utilisant un filtre à seringue (0,22 um) et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
  12. Solution de substrat (SS)
    1. Dans un tube conique de 50 ml, ajouter 5,8 g de NaCl, 3 ml de 1 M de MgCl2, 1,5 g d' urée et 40 ml de ddH 2 O. Ajuster le pH de la solution à 5,0 en utilisant du HCl 10 mM. Parce que la solution ne soit pas tamponné, ajuster le pH en utilisant HClattentivement l'addition de petites portions de HCl. Ajouter ddH 2 O à un volume final de 50 ml.
    2. Mélanger la solution et filtrer dans un autre tube conique en utilisant un filtre à seringue (0,22 um) et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
  13. Luria Bertani (LB) Broth
    1. Dans un bécher, dissoudre 20,0 g LB poudre dans 1 L de ddH 2 O. Transférer dans un flacon en verre, autoclave, et conserver à 4 ° C.
  14. 1,5% de gélose LB
    1. Dans un ballon de 250 ml, on ajoute 1,5 g d'agar et 100 ml de bouillon LB. Autoclave et conserver à 4 ° C.
  15. Les plaques d'agar-agar
    1. Dissoudre la gélose LB dans un micro-ondes et refroidir la solution à ~ 50 ° C. Versez la solution dans des boîtes de Pétri, en faisant ~ 5 plaques et leur permettre de se solidifier.

2. Synthèse et Purification de E. coliformes sensibles DNAzyme EC1

  1. Synthèse de EC1 par modèle Mediated Enzymatic Ligation
    1. Purifier commdes oligonucléotides synthétisés ercially BS1, DE1 et T1 (séquences fournies dans le tableau 1) de 10% électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide (DPage) selon des protocoles standards.
    2. Préparer un 100 uM stock d'BS1, DE1 et T1. Conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
    3. Dans un tube de 1,5 ml, ajouter 38,5 pi de ddH 2 O, 5 ul de DE1, et 5 ul de tampon de réaction polynucleotide kinase 10x T4 fournies par le fournisseur d'enzyme (500 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM de MgCl2, dithiothréitol 50 mM (DTT), 1,0 mM de spermidine).
    4. Ajouter 1 pi de l'adénosine triphosphate (ATP) (100 mM). Ajouter 5 unités de polynucleotide kinase T4 (10 U / ul). Mélanger par pipetage avec précaution le mélange réactionnel.
    5. Laisser incuber la réaction à 37 ° C pendant 30 min.
    6. Stopper la réaction par chauffage à 90 ° C pendant 5 min.
    7. Ajouter 118 ul de ddH 2 O, 5 pi de BS1, et 5 pi de T1. Chauffer le mélange réactionnel à 90 ° C pendant 2 min et puis refroidir à la température ambiante pendant 10 min.
    8. Ajouter 20 ul de 10 x tampon de T4 ADN ligase réaction fourni par le fournisseur d'enzyme (400 mM de Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM de MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM d' ATP). Ajouter 10 unités de T4 ADN ligase (5 U / pl) et mélanger délicatement par pipetage.
    9. Incuber à température ambiante pendant 2 h.
    10. Ajouter 20 ul de 3 M d'acétate de sodium (NaOAc) (pH 5,2), 500 ul d'éthanol à 100% froid. Mélanger la solution par tourbillonnement et placer le tube dans un congélateur à -20 ° C pendant 30 min.
    11. Centrifuger le microcentrifugeuse à 20.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Retirez délicatement le surnageant par pipetage.
    12. Laver le culot avec froid à 70% d'éthanol et centrifuger à nouveau à 20.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Une fois que enlever à nouveau le surnageant et le culot sécher sous vide pendant 10 min.
    13. Resuspendre l'ADN avec 15 pi de ddH 2 O, puis ajouter 15 pl de 2x GLB.
    14. Vortexer vigoureusement et chauffer à 90 ° C pendant2 minutes. Purifier l'ADN pleine longueur de 10% DPage comme décrit ci-dessous.
  2. Configuration 10% DPage
    1. plaques Clean deux en verre (une plaque complète et une crantées), deux de 0,75 mm d'épaisseur, espaceurs et un peigne à 12 puits. Poser une plaque de verre sur une surface plane avec deux entretoises de chaque côté et la plaque crantée sur le dessus. Coupez les deux plaques ensemble en utilisant les quatre clips fournis par le fournisseur.
    2. Dans un bêcher en plastique de 150 ml, verser 40 ml de 10% DPage, 40 ul de tétraméthyléthylènediamine (TEMED), et 400 pi de 10% de persulfate d'ammonium (APS). Mélanger les composants et verser la solution entre les plaques lentement.
    3. Insérez le peigne, puis laisser le gel se polymériser pendant 10 min. Une fois que le gel est polymérisé, retirer lentement le peigne et rincer les puits avec ddH 2 O.
    4. Monter les plaques sur l'appareil d'électrophorèse sur gel. Utilisez une plaque métallique pour dissiper la chaleur générée pour éviter la surchauffe.
    5. Verser TBE 1x sur les chambres supérieure et inférieureet faire en sorte que les puits soient bien immergées dans le tampon. Rincer les puits avec 1x TBE à l'aide d'une pipette ou d'une seringue.
    6. Réglez l'appareil pour fonctionner à 35 mA et de pré-course pour 15 min avant le chargement des échantillons.
  3. Elution de ligaturé EC1 de 10% DPage
    1. Suite à l'étape 2.2.6, exécutez le gel à 35 mA jusqu'à ce que le colorant de fond (bleu de bromophénol) atteint le fond de la plaque de verre. Cela devrait prendre environ 1,5 heures. Coupez l'alimentation et retirer les plaques de l'appareil.
    2. Poser les plaques sur quelques feuilles de serviettes en papier et retirez soigneusement les espaceurs des plaques de verre. Retirez délicatement la plaque de verre supérieure et envelopper le gel avec une pellicule de plastique.
    3. Retournez le gel sur pour enlever la deuxième plaque de verre et couvrir d'une pellicule de plastique à nouveau. Prenez soin d'éviter les rides de la pellicule de plastique.
    4. Visualiser le produit ligaturé en utilisant l'observation UV (260 nm), qui produira 4 bandes d'ADN distinctes (EC1 entièrement ligaturé, DE1, BS1 et T1).
    5. Excise la bande supérieure (EC1) avec une lame de rasoir stérile et transférer dans un tube de 1,5 ml. Écraser le gel avec une pointe de pipette stérile (200 pi taille de la pointe) jusqu'à ce qu'il se transforme en une pâte fine. Ajouter 550 pi de tampon d'élution d'ADN, couvrir le tube de papier d'aluminium pour protéger le fluorophore incorporé, et agiter pendant 15 min.
    6. Centrifuger la solution de gel à 20 000 xg pendant 5 min et transférer soigneusement 400 ul du surnageant dans un autre tube de 1,5 ml. Évitez de retirer des morceaux de gel pendant le pipetage.
    7. Au microtube avec le surnageant a été transféré ajouter 40 ul de NaOAc 3 M (pH 5,2) et 1,0 ml d'éthanol à 100% froid. Mélanger la solution par tourbillonnement et placer le tube dans un congélateur à -20 ° C pendant 30 min.
    8. Centrifuger le microcentrifugeuse à 20.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Retirez délicatement le surnageant par pipetage.
    9. Laver le culot avec froid à 70% d'éthanol et centrifuger à nouveau à 20.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Encore une fois, retirez lasécher le surnageant et le culot sous vide pendant 10 min.
    10. Déterminer la concentration de EC1 en mesurant l'absorbance UV à 260 nm. Faire 10 uM stock et stocker l'échantillon à -20 ° C jusqu'à utilisation.

3. Conjugaison de uréase à l'ADN

  1. Préparation du succinimidyl 4- (N-maléimidométhyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) Stock
    1. Dissoudre 1 mg de SMCC dans 676 ul de DMSO. Vortex et placer sur la glace jusqu'à utilisation.
  2. Préparation de uréase Stock
    1. Dissoudre 1 mg uréase dans 1 ml de 1 x PBS (sans Mg2 + ou Ca2 +). Placer sur la glace jusqu'à utilisation.
      NOTE: Confit uréase est lente à se dissoudre et mélange doux est nécessaire pour éviter la dénaturation.
  3. Synthèse de uréase-ADN (UrDNA)
    1. Ajouter 10 pi de 100 uM LD1 à un tube de 2,5 ml de microcentrifugation. Ajouter 140 ul de ddH 2 O, 40 pl de PBS 10x, et vortex.
    2. Ajouter 80,5 ul de SMCC stock, 159,5 pi de DMSO, vortex et centrifuger brièvement à l'aide d'une centrifugeuse de paillasse.
    3. Incuber à 37 ° C pendant 60 min. Eviter la condensation sous le chapeau de microcentrifugation.
    4. Ajouter 200 ul de 1 x PBS, 60 ul de NaOAc 3 M (pH 5,2) et 1,5 ml d'éthanol à 100% froid. Mélanger la solution par tourbillonnement et on incube à -20 ° C pendant 30 min.
    5. Centrifuger la solution à 20.000 xg pendant 20 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et sécher le culot sous vide. Évitez de trop sécher.
    6. Pour le culot séché ajouter 400 pi de uréase stock et incuber à température ambiante pendant 5 heures.
    7. Transférer 200 ul de conjugué brut à une colonne pré-lavés filtre centrifuge 100k MWCO. Centrifuger la colonne à 14 000 xg pendant 5 min.
    8. Transférer les 200 ul restants du conjugué brut à la colonne et centrifuger à 14 000 g pendant 5 min. Retirer la colonne et placez-le à l'envers dans un nouveau tube de 2,0 ml de microcentrifugation ( "tube de collecte»).
    9. centrifuge le tube de collecte (à la colonne inversée) à 1000 g pendant 2 min. Retirer le tube de collecte et d'ajouter 30 pl de PBS 1x à la colonne centrifuge pour laver la membrane pour la récupération supplémentaire de conjugués.
    10. Encore une fois inverser la colonne et placer dans le tube de collecte. Centrifuger le tube de collecte (à la colonne inversée) à 1000 g pendant 2 min. Retirer et jeter la colonne.
    11. Stocker le UrDNA à 4 ° C jusqu'à utilisation.

4. Assemblée des EC1 et UrDNA sur Magnetic Beads

  1. Mélanger le stock bille magnétique (MB) bien et transférer 100 pl de suspension MB à un tube de 1,5 ml. Placer le tube de microcentrifugation sur un support en rack magnétique pour isoler le MB.
  2. Enlever le surnageant par pipetage et ajouter 150 ul de tampon (BB) de liaison au tube. Retirer le tube du support et frapper avec précaution le tube pour remettre le MB à une solution homogène. Évitez les éclaboussures de la suspension à la top du tube ou une casquette. Si cela se produit, utilisez une centrifugeuse de paillasse pour faire tourner brièvement le résidu de retour à la suspension.
  3. Répétez l'étape 4.2 deux fois plus.
  4. A cette suspension, ajouter 10 pi de 10 uM EC1. Mélanger soigneusement en tapant sur le tube.
  5. Incuber la solution sous agitation douce pendant 30 minutes. Appuyez sur le tube chaque 2-3 min pour éviter la précipitation de la MB.
  6. Placer le tube de microcentrifugation de retour sur le support magnétique pour isoler le MB et retirer le surnageant par pipetage. Laver le MB trois fois avec 150 pi de BB (comme décrit dans l'étape 4.2).
  7. Une fois que le lavage est terminé, suspendre le MB dans un total de 150 pi de BB. A cette solution, ajouter 15 ul de UrDNA et chauffer la solution à 45 ° C pendant 2 min. Refroidir la solution à température ambiante et laisser incuber pendant 2 h.
  8. Placer le tube de microcentrifugation de retour sur le support magnétique pour isoler le MB et retirer le surnageant par pipetage.
  9. Ajouter 100 ul de tampon de réaction (RB). Retirer til microcentrifugeuse tube du support magnétique et mélanger soigneusement le MB.
  10. Laver les MB trois fois par étape 4.9 répéter.
    NOTE: Le surnageant lavé peut être testé rapidement pour déterminer si non hybridée UrDNA est toujours présente, ce qui peut entraîner un signal faux positif. Le test peut être effectué en ajoutant 10 pi de 50 mM d'urée et de 10 pi de 0,04% de rouge de phénol à la solution de lavage. Continuer à laver le MB jusqu'à ce que la solution de lavage ne provoque pas un changement de couleur. La suspension de 100 ul est stockée à 4 ° C jusqu'à utilisation.

5. Préparation des cellules bactériennes 20

  1. La culture E. coli provenant de stocks
    1. Plate E. coli K12 (MG1655) sur LB agar plaques à partir d' un stock de glycérol sous une flamme ou dans une enceinte de sécurité biologique.
    2. En utilisant une pointe de pipette stérile, appuyez doucement sur le stock de glycérol et légèrement strie la surface d'une plaque de gélose pour éviter la perforation de la gélose LB.
    3. Inversez le striéplaque et incuber à 37 ° C pendant 14 heures.
    4. Sceller la plaque avec du Parafilm et conserver à 4 ° C pendant un maximum de 3 semaines.
  2. La culture E. coli pour Comptage des cellules
    1. Dans un 14 ml tube de culture stérile, passer 2 ml de bouillon LB.
    2. En utilisant une pointe de pipette stérile, prélever une seule colonie de la plaque de gélose striée préparé à l'étape 5.1 et le transférer dans le tube de culture.
    3. Incuber la culture à 37 ° C et agiter à 230 tours par minute pendant 14 heures.
    4. En série diluer la culture bactérienne dans des intervalles de 10 fois.
    5. Pour chaque échantillon dilué, plaque uniformément cinq 100 aliquotes sur des plaques d'agar LB séparées. Intervertir les plaques et incuber à 37 ° C pendant 14 heures.
    6. Compter les cellules de chaque échantillon afin d'obtenir la concentration cellulaire moyenne de chaque dilution.
      NOTE: 10 7 cellules sont souvent utilisées pour mettre en place un test décisif de référence pour E. coli comme ce niveau de E. coli peut déclencher une couleur rapide change. Cependant, un test décisif correctement exécuté peut détecter aussi peu que 500 cellules, tel que discuté dans la section Résultats.
  3. Préparation E. Cellules coli pour les essais
    1. Pour une suspension cellulaire désirée, le transfert de 1 ml de bouillon de culture à un tube de 1,5 ml.
    2. Centrifuger les cellules à 6000 g pendant 10 min à 4 ° C. Retirez délicatement le surnageant sans perturber le culot cellulaire.
    3. Ajouter 10 ul de tampon de réaction au culot cellulaire et remettre en suspension les cellules. Sonication de la suspension cellulaire pendant 5 min. Transférer la suspension cellulaire à une boîte de glace pendant 5 min.
    4. Sonication de la suspension cellulaire pendant encore 5 min.
    5. Centrifuger la suspension cellulaire à 13000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Utiliser le surnageant pour l'essai (10 ul).

6. Test de Litmus

  1. Dans un tube de 1,5 ml, un prélavage du tube en ajoutant et en tourbillonnement 100 ul de tampon de réaction (RB) dans le tube de microcentrifugeuse etjeter le tampon.
  2. Transfert 15 pi de EC1 assemblé (protocole 4) sur le tube de microcentrifugation lavé.
  3. Laver les billes magnétiques en plaçant le tube de microcentrifugeuse sur un support magnétique. Retirer le surnageant par pipetage. Retirez le tube de microcentrifugation du rack, ajouter 100 pi de RB, et resuspendre soigneusement les billes magnétiques.
  4. Laver les MB deux fois par étape 6.3 répéter.
  5. Placer le tube de microcentrifugation de retour sur le support magnétique, éliminer le surnageant et ajouter 10 ul E. échantillon coli préparé à l' étape 5.3.
  6. Mélanger les échantillons et magnétiques perles soigneusement en tapotant doucement sur le tube de microcentrifugeuse.
  7. Laisser incuber la réaction à température ambiante pendant 1 h.
  8. Pour la réaction, ajouter 90 ul de ddH 2 O et placez le tube microfuge sur une grille magnétique.
  9. Au bout d'environ 3 min de séparation magnétique, transvaser soigneusement 85 ul du surnageant dans un tube microfuge de 0,5 ml. Retirer le surnageant lentementéviter de recueillir toutes les billes magnétiques.
  10. Au microtube ci-dessus ajouter 15 pl de 0,04% de rouge de phénol, et 100 ul de solution de substrat.
  11. Prenez une photo à des intervalles de temps spécifiques pour enregistrer le changement de couleur.
    REMARQUE: le changement du pH peut également être contrôlé à l'aide d'un pH-mètre avec une microélectrode. Le pH de départ devrait être d'environ 5,2-5,5 (la solution est jaune). Sinon, la solution peut être ajustée par addition de 1 mM de tampon acétate pH 5,0).

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Résultats

Le principe de l'épreuve décisive bactérienne est expliqué dans la Figure 1 Le test utilise trois matériaux clés:. Un DNAzyme ARN-clivant qui est activé par une bactérie spécifique, uréase et des billes magnétiques. La DNAzyme est utilisé comme élément de reconnaissance moléculaire pour obtenir une détection hautement spécifique d'une bactérie d'intérêt. Uréase et des billes magnétiques sont utilisées pour réaliser la transduction du signal de l'activité ...

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Discussion

La traduction de l'action de l'activité ARN de clivage d'une DNAzyme bactérie sensible à un test décisif est rendu possible grâce à l'utilisation de l' uréase et la séparation magnétique, comme illustré par la figure 1. Bien que la démonstration de la mise à l' épreuve modifiée pour la détection bactérienne est fait avec un E. coli dépendante de l' ARN-clivant DNAzyme, 5,19,20 la conception peut généralement être prolongé pour tout ARN clivant DNAzyme. Com...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le financement de ce projet de recherche a été fourni par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) par l’intermédiaire d’une subvention à la découverte accordée à YL.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)VWR AMRESCO0105
Granules d’hydroxyde de sodium (NaOH)BIO BASIC CANADA INC.SB6789
Tris-baseVWR AMRESCO0497
Acide boriqueAMRESCO0588
UréeVWR AMRESCOM123
40 % acrylamide/bisacrylamide (29:1) solutionBIO BASIC CANADA INC.A0007
SucroseBioshop Canada inc.SUC507
Bleu de bromophénolBioshop Canada inc.BRO777
Xylènecyanol FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10 % dodécylsulfate de sodiumBioshop Canada inc.SDS001
Acide chlorhydrique (HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
Chlorure de sodium (NaCl)Bioshop Canada inc.SOD001
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
Chlorure de magnésium (II) hexahydratéVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
Adénosine triphospahte (ATP)AMRESCO0220
Acétate de sodium trihydraté (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
Éthanol Alcools commerciaux P016EAAN
Tétraméthylèneéthylènediamine (TEMED)AMRESCO0761
10 % Persulfate d’ammonium (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
Dimethyl sulfoxide (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreaseSIGMA-ALDRICHU0251
1x Saline tamponnée au phosphate (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0,04 % rouge de phénolSIGMA-ALDRICHP3532
10x tampon de réaction polynucléotidique kinase T4Lucigen30061-1
10x tampon de réaction de l’ADN ligase T4Bio Basics CanadaB1122-B
ADN ligase T4 (5 U/μ ; l)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) BouillonAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 polynucléotide kinase (10 U/μ ; l)Lucigen30061-1
E. coli K12 (MG1655)ATCCATCC700926
CentrifugeuseBeckman Coulter, Inc.
Plaques de verreCBS scientificngp-250nr
Entretoises de 0,75 mmd’épaisseur CBS scientificVGS-0725r
Peigne à 12 puitsCBS scientificVGC-7512
Lampe UVUVP95-0017-09
Spectrophotomètre (NanoVue)GE HealthcareN/A
Plaque métalliqueCBS scientifiqueCPA165-250
VortexVWR International58816-123
Appareil d’électrophorèse sur gelCBS scientificASG-250
Boîtes de PétriVWR International25384-342
100 kDa MWCO filtres centrifugesEMD MilliporeUFC510024
Magnetic Bead (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
Rack de séparation magnétiqueNew England BioLabsS1506S
Tubes à microfugeSarstedt72.69
Filtre à seringue (0.22 μ ; m)VWR International28145-501
Tube de culture de 14 mlVWR International60818-725
Incubateur de culture cellulaireEppendorf ScientificM13520000
Branson Nettoyeur à ultrasonsBransonN/A
Camera (Canon Powershot G11)CanonN/A
Tube conique de 50 mlVWR InternationalRéférence 89004-364
392187

Références

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