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Article de méthode

Infection expérimentale avec

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DOI :

10.3791/54554

⸱

16 novembre 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit comment inoculer des souris C57BL / 6J avec la souche EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) et de mesurer l' interféron-γ (IFN-γ) Réponses par tueuses naturelles (NK), T (NKT) des cellules tueuses naturelles, et adaptative des lymphocytes T post-infection. Ce protocole décrit également la façon de mener des études de survie chez les souris après l' infection avec une DL 50 dose modifiée de l'agent pathogène.

Résumé

L. monocytogenes est une bactérie Gram-positif qui est une cause de maladies d' origine alimentaire chez les humains. L'infection expérimentale de souris avec cet agent pathogène a été très informatif sur le rôle des cellules du système immunitaire innée et adaptative et des cytokines spécifiques de l'immunité de l'hôte contre les pathogènes intracellulaires. La production d'IFN-γ par des cellules innées lors de l' infection par L. monocytogenes sublétale est importante pour l' activation des macrophages et le contrôle précoce de l'agent pathogène 1-3. En outre, la production d' IFN-γ par les lymphocytes mémoire adaptative est importante pour amorcer l'activation des cellules innée à 4 réinfection. Le L. monocytogenes modèle d'infection sert ainsi un excellent outil pour examiner si de nouvelles thérapies qui sont conçus pour augmenter la production d' IFN-γ ont un impact sur les réponses de l' IFN-γ in vivo et ont des effets biologiques productifs tels que l' augmentation de la clairance bactérienne ou l' amélioration de la survie de la souris deinfection. Décrite ici est un protocole de base pour la façon de mener les infections intra - péritonéales de souris C57BL / 6J avec la souche EGD de L. monocytogenes et de mesurer la production d' IFN-γ par les cellules NK, les cellules NKT et les lymphocytes adaptatifs par cytométrie en flux. En outre, les procédures sont décrites: (1) croître et de préparer les bactéries pour l'inoculation (2), mesurer la charge bactérienne dans la rate et le foie, et (3) mesure la survie des animaux de points d'extrémité. Des données représentatives sont également fournis pour illustrer la façon dont ce modèle d'infection peut être utilisée pour tester l'effet d'agents spécifiques sur les réponses d' IFN-y pour L. monocytogenes et la survie des souris de cette infection.

Introduction

IFN-γ est une cytokine qui est essentielle pour la médiation de l' immunité contre les agents pathogènes intracellulaires et pour contrôler la croissance des tumeurs 5. L'importance de cette cytokine dans la résistance bactérienne est évidente dans l'observation que les humains avec des mutations dans la voie de signalisation de l' IFN-γ sont très sensibles à l' infection par des mycobactéries et salmonella 6. De même, des souris déficientes en soit l' IFN-γ ou les défauts d'exposition du récepteur de l' IFN-γ dans la résistance aux mycobactéries 7-9 et d' autres agents pathogènes intracellulaires , y compris L. monocytogenes 10,11, 12 Leishmania major, Salmonella typhimurium 13 et 11 certains virus. En plus des agents pathogènes la lutte contre, l' IFN-γ joue un rôle crucial dans l' hôte de défense contre les tumeurs 14. Bien que la production accrue d'IFN-γ est bénéfique dans le contexte d'une infection ou d'un cancer, la production prolongée de cette cytokine a été liée tle diabète o le développement de l' auto - immunité systémique 15-17 et l'accélération de type I dans le modèle de souris diabétique non obèse 18.

Les principales sources d'IFN-γ comprennent les cellules NK, les cellules NKT, les lymphocytes T yô, helper 1 (Th1) des cellules T et des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) 5,19,20. IFN-γ améliore l'immunité innée et adaptative par: (1) vers le haut de régulation complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et à l'expression II, (2) l'augmentation de l'expression des molécules co-stimulatrices sur les cellules présentatrices d'antigène, (3) macrophage améliorant phagocytose et la production de cytokines pro-inflammatoires et microbicides facteurs (par exemple, l' oxyde nitrique et les espèces réactives de l' oxygène), (4) la promotion de la différenciation des cellules T CD4 + naïves en cellules effectrices Th1, (5) la promotion de la commutation de classe d'anticorps à l' immunoglobuline ( Ig) 2a et IgG3 (chez la souris), (6) l'induction de la production de chimiokines pour recruter des cellules immunitaires aux sites d'infection, et (7) le renforcement de cellules NK et réponses CTL 5,19. Compte tenu de l'importance capitale de l' IFN-γ dans la réponse de l' hôte aux agents pathogènes et les tumeurs, l' IFN-γ recombinant a été testé en tant que traitement de diverses infections et de tumeurs malignes (passé en revue dans 19). Cependant, parce que l' administration systémique de l' IFN-γ ou la cytokine promotion Th1 interleukine-12 (IL-12) est associé à des effets secondaires et liée à la dose de toxicité 19,21, il y a intérêt à développer des stratégies alternatives pour augmenter la production d'IFN-γ par les cellules immunitaires. Développement de nouveaux produits biologiques et de petites molécules nécessite des outils de dépistage in vivo pour tester si ces agents augmentent la production d' IFN-γ au cours d' une réponse immunitaire et si cela se traduit par des effets biologiques significatifs tels que l' augmentation de la survie des animaux.

L' infection expérimentale de souris avec la bactérie L. monocytogenes gram-positives a été un modèle instrumental pourdéchiffrer le rôle de l' IFN-γ dans l' hôte une immunité contre les agents pathogènes intracellulaires 1,22. L'infection des souris avec l'agent pathogène par voie intraveineuse ou intrapéritonéale (ip) conduit à la diffusion rapide des bactéries à la rate et le foie, où ils deviennent internalisés par les macrophages résidents et les hépatocytes avec des charges bactériennes de pointe dans la rate qui se produisent entre 3 et 4 jours post infection 1,3,22. La production d'IFN-γ par les cellules NK est importante pour l' activation des macrophages et une résistance précoce contre le pathogène 3; mais à des doses infectieuses élevées, la production d'IFN-γ peut également être préjudiciable à la clairance de l' agent pathogène 23. Les cellules NKT sont également une source d'IFN-γ dans la rate et le foie pendant le contrôle précoce des agents pathogènes 2,24 et cette production a été montré pour amplifier la production d' IFN-γ par d' autres types cellulaires , notamment les cellules NK 2. D'autre part, plus tard, agissant lymphocytes T adaptatifs, des cellules T CD8 + en particulier, sont importants pour la médiation de la clairance de l'agent pathogène et de fournir une protection contre la réinfection 1,4,22.

Ce modèle d'infection a été attrayante pour les chercheurs pour un certain nombre de raisons (examiné en 1). Tout d'abord, l'infection par l'agent pathogène est hautement reproductible et induit une forte réponse immunitaire Th1 et cellulaire. Deuxièmement, lors de l'infection sublétale, la charge bactérienne est concentrée dans le foie et la rate où il peut être facilement mesurée. Troisièmement, l'agent pathogène peut être manipulé en toute sécurité sous le niveau de biosécurité 2 (NSB2) conditions. En quatrième lieu, l'organisme et la réponse immunitaire qu'il engendre ont été largement caractérisées. Enfin, une variété de souches mutantes ou génétiquement modifiés ont été développés qui sont disponibles pour l'utilisation.

Décrit ici est un protocole de base pour l' inoculation de souris C57BL / 6J avec la souche EGD de L. monocytogenes 25 et pour mesurer l' IFN - γ reponses par NK, NKT et les lymphocytes adaptatifs post-infection. On décrit également la façon de mesurer la charge bactérienne dans la rate et le foie après l' infection sublétale et de réaliser des études de survie après l' infection avec une DL 50 dose modifiée de l'agent pathogène. Enfin, les données représentatives sont présentées de la manière dont ce protocole peut être utilisé pour cribler les effets de nouveaux traitements sur les réponses IFN-y et la survie de la souris de l' infection par L. monocytogenes.

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Protocole

Déclaration de sécurité

Ce protocole décrit l' infection de souris avec vivants L. monocytogenes. L'agent pathogène est manipulé en toute sécurité dans des conditions de BSL2 par du personnel qualifié qui ne sont pas immunodéprimés. Les personnes immunodéprimées sont les femmes enceintes, les personnes âgées et les personnes qui sont infectées par le VIH ou qui ont des maladies chroniques qui nécessitent un traitement avec la thérapie immunosuppressive. Le personnel doit revêtir une couche protectrice de laboratoire ou une robe, des gants, un masque et des lunettes de protection lors de la manipulation des échantillons infectés. Le travail décrit ici a été réalisée dans des conditions de BSL2 vertu d'un certificat (# 32876) qui a été délivré par le University Health Network (UHN) Bureau de la biosécurité. Carcasses de souris infectées ou des tissus non utilisés étaient des sacs doubles et éliminés de déchets biologiques dangereux. Cages de souris infectées ont également été décontaminés par autoclavage.

Déclaration d'éthique

Les souris ont été maintenues et infectées dans un Quarachambre ntine au sein de UHN installations animales et ont été pris en charge conformément aux lignes directrices établies par le Conseil canadien de protection des animaux. Toutes les procédures sur des souris ont été réalisées dans l'utilisation des animaux protocole # 3214 qui a été approuvé par le comité de protection des animaux UHN. En raison de considérations éthiques, la mort n'a pas été utilisé comme critère d'évaluation pour les études de survie. La DL 50 dose modifiée rapportée ici pour infection par L. monocytogenes a été déterminée à la dose à laquelle 50% des souris atteint paramètres spécifiques, qui consistaient en une perte de 20% du poids corporel ou en montrant au moins deux des signes cliniques suivants: léthargie, fourrure ébouriffée, une posture voûtée, respiration laborieuse, les yeux ternes ou enfoncés. Les souris ont été euthanasiés quand ils ont atteint extrémités par l' exposition au dioxyde de carbone (CO 2) , conformément aux directives de l' établissement UHN.

1. Préparation des stocks Glycérine pour le stockage à long terme

NOTE: Cette procédure décrit comment les stocks de glycérol de laSouche EGD de L. monocytogenes sont préparés à partir d' un stock de glycérol d' origine. Les mesures qui ont le potentiel de générer des aérosols doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique certifié (BSC).

  1. Préparer l'infusion de cerveau-coeur (BHI) des plaques de gélose pour la croissance bactérienne. Pour cela , ajoutez 3,8% (p / v) de bouillon de BHI et 1,5% (p / v) d' agar à deux fois distillée H 2 O (ddH 2 O). liquide Autoclave. Une fois l'agar refroidit à 50 ° C, verser le liquide dans des boîtes de Pétri bactériennes (25 ml / boîte) et laisser des plaques sèches (à découvert) dans le BSC pendant 1 h.
    NOTE: Transfert BHI agar dans un bain à 50 ° de l' eau après autoclavage pour éviter la solidification avant la coulée des plaques. Magasin BHI plaques à 4 ° C à l'envers (avec le côté des médias sur le dessus) jusqu'à ce que prêt à l'emploi.
  2. Préparer les médias BHI liquide. Pour cela, mélanger 3,8% (p / v) de bouillon de BHI dans ddH 2 O. Autoclave.
  3. Retirer congelé stock de glycérol de la souche L. monocytogenes EGD de -80 ° C gelr et le dégel à la température ambiante.
  4. Trempez une pointe de pipette stérile dans le stock de glycérol décongelé et immédiatement strie la pointe avant et en arrière à travers une section d'une plaque BHI. Ceci est la série primaire.
  5. Tourner la plaque de 90 ° C et en utilisant une pointe de pipette frais, faites-le glisser à travers la première série et l'étaler à l'autre ¼ de la plaque (ce qui est la série secondaire). Répéter une fois de plus pour rendre la série tertiaire.
  6. Tourner la plaque à l'envers et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Des colonies isolées uniformes devraient être obtenus dans la dernière série de stries et visible entre 16 et 24 heures.
  7. Distribuer 10 ml de bouillon BHI stérile dans un tube de 50 ml d'évent stérile. Choisissez une colonie de L. monocytogenes à partir de la plaque à l' aide d' une pipette stérile et inoculer le bouillon. Incuber la culture dans un 37 ° C incubateur agitateur orbital pendant une nuit ou jusqu'à ce que la DO 600 = 1,0 avec des paramètres à 225 rotations par minute (rpm).
    NOTE: Verre ou jetable plades erlenmeyers STIC peuvent également être utilisés pour la culture des bactéries. Quel que soit le type de récipient utilisé, assurez-vous qu'il est stérile, ventilé et que le volume de la culture ne dépasse pas 20% du volume total du récipient pour assurer une aération appropriée des bactéries.
  8. Préparer des stocks de glycerol stérile par mélange de 100% de glycerol à la culture bactérienne liquide durant la nuit à un rapport 1: 1. Distribuer le mélange bactérien / glycérol en flacons de 2 ml cryogéniques (500 pl / flacon) et des flacons de transfert à -80 ° C congélateur pour le stockage.
    NOTE: Bead actions méthodes peuvent également être utilisés à la place des stocks de glycérol pour stocker les bactéries. Par ce procédé, des microbilles poreuses sont inoculés avec une culture pure de L. monocytogenes et sont stockés à -80 ° C. Chaque bille peut être utilisée pour inoculer une culture fraîche selon les besoins. Voir la liste des matériaux pour plus d'informations.

2. Détermination de la courbe de croissance de L. monocytogenes dans Jour Culture

REMARQUE: Cette procédure décrit comment générer la courbe de croissance de L. monocytogenes qui est utilisée pour estimer les unités formant colonie (UFC) pour des études d'infection. Toutes les étapes qui ont le potentiel de générer des aérosols doivent être effectuées dans un BSC certifié.

  1. Prendre 100 ul de culture d'une nuit générée à l'étape de 1,7 à 10 ml de milieu BHI dans un tube de 50 ml d'évent et de croître à 37 ° C dans un incubateur sous agitation (225 tpm, incliné à 45 ° d'angle). Utilisez un tube non inoculé comme témoin.
  2. Prendre des échantillons de 0,5 ml de la culture à des intervalles horaires (1, 2, 3, 4, 5, 6 heures, etc.). Diluer chaque partie aliquote de 1: 1 (v / v) avec des supports de BHI dans une cuvette en matière plastique. Pipeter haut et en bas pour mélanger. Mesurer la densité optique (DO) à 600 nm (DO 600) en utilisant un spectromètre. Poursuivre la mise en culture des bactéries jusqu'à ce que la DO 600 = 1.
  3. Dans le même temps, prendre un échantillon de 100 ul de la culture et diluer avec 900 ul BHI médias dans un stérile 1,5 ml micrTube ocentrifuge (ce qui est le 10 -1 dilution). Centrifuger les bactéries à 6000 g pendant 5 min, et aspirer le surnageant.
  4. Laver deux fois les bactéries par remise en suspension du culot dans 1 ml de BHI support, centrifuger pendant 5 min à 6000 x g, puis en aspirant le surnageant. Reprendre le culot dans 1 ml BHI médias. Préparer une série de dilutions de 10 fois de cet échantillon dans un milieu BHI (10 -2 à 10 -9). Se propager 100 ul de chaque dilution sur des plaques de gélose BHI séparées. Incuber les plaques pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur.
  5. Le lendemain, ramasser des plaques qui ont entre 30-300 colonies. Jeter le reste. Compter les colonies sur ces plaques. Le tableau 1 montre un exemple de chiffres obtenus dans une partie aliquote qui a été prise lors de la DO 600 = 0,84. Dans cet exemple, l' une des plaques ( par exemple 10 -6 dilution) ont numérations de colonies entre 30-300 et a été utilisé pour le UFC / ml de calcul.
    NOTE: Les plaques avec une plus grandede 300 colonies ne sont pas utilisées, car la surpopulation peut entraver la croissance bactérienne et rend également difficile de discerner et d'énumérer des colonies individuelles. Plaques avec chiffres <30 sont également pas utilisé parce que les petites erreurs de technique de dilution ou la présence de contaminants peuvent avoir un impact important sur la précision des chiffres à l'extrémité inférieure de la gamme.
  6. Diviser le nombre de colonies par le volume plaqué, puis multiplier par le facteur de dilution pour obtenir la valeur / ml UFC pour une dilution particulière. Dans l'exemple du tableau 1, le compte à la dilution 10 -6 était 70. Divisez cette valeur par 0,1 ml pour obtenir la valeur / ml CFU pour la culture diluée. Puis multiplier cette valeur par le facteur de dilution (10 6) pour obtenir la valeur / ml CFU de la culture non dilué (7,0 x 10 8).
  7. Tracer la DO600 (axe des y) en fonction du temps en heures (abscisse) pour identifier la phase de croissance logarithmique 26.
    NOTE: Ce curv de croissancee fournit une estimation de la UFC / ml de la culture jours lorsqu'elle est cultivée dans une certaine lecture de DO. Choisir une DO600 de lecture qui se trouve dans la phase logarithmique de croissance qui peut être utilisé comme une cible DO 600 pour les cultures en croissance par jour. Ces données peuvent maintenant être utilisées pour estimer la CFU dans une culture pour la préparation de l'inoculum (Procédure 3).

3. Préparation de l'inoculum de l' infection expérimentale par L. monocytogenes

NOTE: Cette procédure décrit la préparation de l'inoculum infectieux à partir d' une culture de la journée qui a été lancé à partir d' une culture de la nuit (préparé dans la procédure 2). Toutes ces étapes sont effectuées dans le BSC, sauf indication contraire.

  1. Calculer le nombre d'UFC requis pour l'infection sur la base du nombre de souris et le modèle expérimental de l'étude. Ajouter un volume approprié de BHI médias dans un ballon ou d'une culture tubulaire Erlenmeyer ventilée stérile.
    NOTE: La CFU de bactéries préparée sera fonction du type d'expérience réalisée. Pour étudier NK et les réponses des cellules NKT pendant l' infection, chaque souris est inoculé avec 10 5 CFU de bactéries (Procédure 6). Si l' étude des réponses adaptatives des cellules T à l' infection ou la mesure de la charge bactérienne, chaque souris est ensemencé avec 2 x 10 4 CFU de bactéries (Procédure 8). Si l' étude de la survie aux extrémités, chaque souris est ensemencé avec la dose DL 50 de l'agent pathogène (qui est de 10 5 CFU pour les hommes et 1,5 x 10 5 CFU pour les femmes, voir Procédure 9).
  2. Inoculer le tube contenant un milieu BHI avec 100 ul de culture de la nuit. Incuber la culture dans un incubateur à 37 ° C , agitation orbitale (225 rpm) jusqu'à ce que la cible DO 600 est atteinte. Transférer le contenu de la culture dans un tube de centrifugation stérile.
  3. centrifuger les bactéries dans un culot pendant 5 min à 6000 x g en utilisant une centrifugeuse. Aspirer le surnageant en utilisant un vide attaché à un ballon de piège contenant l'eau de Javel.
  4. Lavage culot deux fois avec 1 x tampon phosphate salin (PBS), la centrifugation (5 min à 6000 x g) entre les deux.
  5. Aspirer le deuxième lavage et diluer les bactéries à la concentration appropriée dans du PBS 1X pour délivrer le UFC d'intérêt pour chaque souris dans un volume de 200 ul.
    NOTE: Il est préférable d'utiliser une source commerciale de stérile PBS 1x pour les bactéries de lavage et pour la préparation de l'inoculum, car verrerie de laboratoire peut introduire des contaminants immunologiques comme lipopolysaccharide.

4. Infection expérimentale de souris avec L. monocytogenes

NOTE: Cette procédure décrit comment infecter des souris avec l'inoculum préparé dans la procédure 3 et comment vérifier l'UFC livré dans l'inoculum. Manipulation des souris et des injections sont effectuées dans un BSC.

  1. Commander un nombre suffisant de souris C57BL / 6J mâle ou femelle pour votre expérience. commander également des souris pour servir de témoins non infectés.
  2. Permettre à des souriss'acclimater pendant 1 semaine avant l'inoculation bactérienne.
    NOTE: Ceci est parce que le stress lié au transport des animaux peut déclencher une augmentation transitoire de la production d'hormones de stress et lymphopénie 27,28.
  3. Le jour de l'inoculation, obtenir un poids corporel initial pour chaque souris et l'enregistrer dans le cahier de laboratoire.
  4. Dans le BSC, mélanger la suspension bactérienne de haut en bas à l'aide d'une pipette stérile pour veiller à ce que les bactéries sont réparties uniformément et ensuite prendre jusqu'à 200 ul de l'inoculum dans une seringue de 1 ml d'ingénierie de sécurité munie d'une aiguille 25 G.
  5. Injecter une adresse IP de la souris avec 200 ul d'inoculum préparé (par exemple, 10 5 UFC pour l' infection des cellules NK, la procédure 6). Pour cette procédure, Scruff souris avec la main moins dominante en saisissant la peau lâche autour des épaules de la souris. Après s'être assuré que la souris est bien contenue, injecter la souris dans le quadrant inférieur de l'abdomen, juste en dehors de la midline pour éviter la vessie.
  6. Jetez l'aiguille et la seringue dans un container approprié.
  7. Répéter les étapes 04.03 à 04.06 jusqu'à ce que toutes les souris sont injectées. Procéder à des étapes similaires avec 1x PBS injecté souris (témoins non infectés).
    NOTE: Étant donné que la CFU est une estimation basée sur la courbe de croissance, il est également bon de vérifier la réelle UFC dans l'inoculum. Pour cela, préparer 3 - 4 dilutions différentes de l'inoculum préparé (en utilisant 10 fois la série de dilution) que vous attendez se traduira dans les colonies dénombrables. Étaler 100 pi de chaque diluant sur une plaque de gélose BHI et incuber une nuit à 37 ° C. Compter les colonies et calculer les réels UFC / ml comme décrit dans la procédure 2.

5. Préparer la chaleur tué L. monocytogenes pour les études immunitaires

NOTE: Toutes les étapes qui ont le potentiel de générer des aérosols sont effectuées dans le BSC.

  1. Cultiver la culture de jour jusqu'à ce que la DO 600 valeurs are atteint qui sont dans la phase logarithmique. Distribuer la culture dans 1,5 ml microtubes.
  2. Incuber les tubes dans un 70 ° C dans un bain d'eau pendant 1 heure pour tuer les bactéries.
  3. Laver deux fois avec des bactéries 1x PBS comme dans les étapes 3.3 et 3.4. Remettre en suspension dans un milieu stérile RPMI complet contenant du sérum de veau fœtal (FCS) (voir fichier supplémentaire 1 pour la recette) à une concentration de 4 x 10 6 / ml. Aliquoter tué bactéries dans 2 ml flacons cryogéniques stériles et conserver à -80 ° C.
  4. Confirmer la mort des bactéries en étalant 100 ul de préparation de bactéries tuées par la chaleur sur des plaques de gélose BHI et incuber une nuit à 37 ° C.
    NOTE: Ces bactéries tuées à la chaleur doivent être prêts pour stimuler les lymphocytes dans la culture Procédure 8. S'il y a des colonies en croissance sur la plaque de gélose BHI, répétez la procédure de la chaleur tuant.

6. Mesure de l'IFN-y Réponses par NK et NKT cellules lors de l'infection

NOTE: Cette procédure décrit comment mesurer les réponses IFN-y par les cellules NK et NKT chez les souris à 24 h après l' infection avec 10 5 UFC de L. monocytogenes. Cette dose est utilisée car elle induit des réponses robustes IFN-y par les cellules NK et NKT dans la rate 24. Effectuer toutes les étapes du BSC. Pour aider à maintenir la viabilité des cellules, garder les cellules sur la glace chaque fois que possible et d'utiliser des tampons glacées.

  1. Inoculer souris comme décrit dans la procédure 4 avec 10 5 UFC de L. monocytogenes. Dans le même temps, injecter des souris témoins non infectées IP avec un volume égal de PBS 1x.
  2. Euthanasier souris à 24 heures après l'inoculation par inhalation de CO 2 selon les directives institutionnelles.
  3. Lie chaque souris sur son côté droit et mouiller la peau avec 70% d'éthanol en utilisant un flacon souple.
  4. En utilisant des pinces aseptiques ou stériles et des ciseaux difficiles coupe, inciser la peau juste en dessous du bas de la cage thoracique.
  5. Vaporiser vers le basla couche musculaire exposée à l'éthanol à 70%. La rate doit être visible sous la couche musculaire (ouverte de la tête de flèche sur la figure 1).
  6. En utilisant des pinces aseptiques ou stériles et des ciseaux fins, inciser la couche musculaire pour révéler la rate. saisir délicatement la rate avec la pince et d'utiliser des ciseaux fins pour couper la rate loin de tissu conjonctif environnant.
  7. Placez la rate dans un tube conique de 15 ml contenant stérile 1x PBS.
  8. Remplir à moitié des boîtes de Pétri stériles stérile 1x PBS. Dissocier la rate à travers une cellule de nylon crépine 70 um dans la boîte de Pétri en utilisant l'extrémité plate d'une seringue de 3 ml stérile.
  9. Transférer la suspension de splénocytes dans un tube de 15 ml conique stérile propre à l'aide d'une pipette 10 ml sérologique stérile.
  10. Centrifuger les échantillons à 335 xg pendant 10 min à 4 ° C.
  11. Aspirer le surnageant dans un flacon piège contenant l'eau de Javel. Desserrez le culot cellulaire en tapotant le tube avec un doigt ou en faisant glisser le tube inférieuret - vient le long d' une surface ondulée (par exemple, le débit d'air de ventilation dans le BSC).
  12. Lyse des globules rouges en ajoutant 1,5 ml de chlorure de potassium-ammonium (ACK) du tampon de lyse (voir fichier supplémentaire 1 pour la recette) à chaque rate. Après exactement 1 min et 15 secondes, remplir le tube avec PBS 1x pour arrêter la lyse cellulaire.
  13. Centrifuger les cellules comme décrit dans l'étape 6.10. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de cellules activées par fluorescence (FACS) Tampon (1x stérile PBS contenant 2% de FCS).
  14. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Pour cela, prendre deux aliquotes de suspension de cellules pour compter. Ajouter 15 ul de chaque suspension cellulaire à un volume égal de bleu Trypan (0,04% en diluant une solution de bleu trypan à 0,4% d'au ddH 2 O). Charge 15 pi de chaque / Trypan suspension bleu cellulaire dans la chambre de l'hémocytomètre (ie, un dans la chambre supérieure, une dans la chambre inférieure).
  15. En utilisant un microscope, compter toutes les cellules non-bleues danscinq grands carrés de la grille centrale dans chaque chambre (figure 2). Prenez ce nombre et le diviser par 10 pour obtenir le nombre de cellules dans 10 6 / ml. Dans l'exemple de la figure 2, le nombre est de 215 cellules dans les 5 carrés; Par conséquent, la concentration cellulaire est de 21,5 x 10 6 / ml. Moyenner les concentrations cellulaires obtenues à partir des deux échantillons.
  16. Seed 1 x 10 6 cellules par puits / tache dans une plaque à fond rond de 96 puits pour cytométrie coloration. Assurez-vous de semer également les cellules pour un souillures et de la fluorescence moins (FMO) contrôles. Voir le flux recommandé cytométrie panneau de coloration dans le tableau 2.
    NOTE: Pour les étapes suivantes, il est recommandé de garder les cellules sur la glace ou à 4 ° C et à protéger les cellules de la lumière avec une feuille quand fluorochromes sont présents. Une pipette à canaux multiples peut être utilisé pour distribuer des liquides dans des plaques de 96 puits coloration pour accélérer le traitement. Veillez à ne pas perturber le culot cellulaire lorsqueaspirer le surnageant de centrifugation de la plaque. La coloration peut également être effectuée dans des tubes FACS si la centrifugeuse est pas muni d'adaptateurs de plaques. Toutes les étapes de centrifugation à partir de ce point sont faites à 456 g pendant 5 min à 4 ° C.
  17. Centrifuger la plaque, puis laver les cellules deux fois avec un tampon FACS. Un lavage est effectué par addition de 200 ul de tampon FACS à chaque puits, centrifuger la plaque, puis en aspirant le surnageant.
  18. Effectuez l'étape de blocage par addition de 50 pl / puits de tampon FACS contenant anti-souris CD16 / CD32 (bloc Fc purifié) (0,5 pg). Incuber les cellules à 4 ° C pendant 15 min. Laver les cellules une fois dans du PBS 1X, comme décrit ci-dessus.
  19. Ajouter 100 pi viabilité colorant (fixable colorant de viabilité dilué 1: 1000 dans PBS 1x) aux cellules. Tache cellules à 4 ° C dans l'obscurité (au réfrigérateur) pendant 30 min. Laver les cellules deux fois dans du tampon FACS comme décrit ci-dessus.
  20. Après un second lavage, ajouter 100 ul d'anticorps de surface cellulaire ou des tétramères aux puits respectifs en fonction de to le panneau de coloration décrit dans le tableau 2. Tache cellules à 4 ° C dans l'obscurité (au réfrigérateur) pendant 30 min. A ce moment, ajouter également des anticorps pour la coloration des contrôles positifs et FMO simples.
    NOTE: En ce qui concerne les contrôles positifs simples, il est recommandé de soit splénocytes d'utilisation qui sont colorées avec différentes versions fluorochrome de l'anticorps CD4 ou des billes de compensation commerciales qui sont colorées avec les anticorps utilisés dans le panneau. Avant d'effectuer cette procédure de coloration, tous les anticorps FACS doivent être titrés dans les études d'essai pour déterminer les concentrations optimales pour la coloration.
  21. Laver les cellules deux fois dans un tampon FACS comme décrit ci - dessus et fixer ensuite les cellules en les remettant en suspension dans 50 pi de paraformaldehyde à 4% (16% de paraformaldehyde actions dilué dans ddH 2 O) et incubation pendant 10 min à température ambiante. ATTENTION: Le paraformaldéhyde est toxique et ne doit être manipulé dans la hotte.
  22. Laver les cellules deux fois in tampon FACS, centrifuger entre les deux. Remettre en suspension les cellules dans du tampon FACS. Continuer à venir cellules étape ou stocker dans le réfrigérateur à l'abri de la lumière jusqu'à trois jours.
  23. Centrifuger les cellules, retirer le surnageant et laver les cellules deux fois avec 150 pi de 1x perméabilisation Wash Buffer / (tampon / Wash Perm), centrifuger entre les deux. Le / Wash Buffer Perm est préparé à partir d' un 10x disponible en diluant 1: 9 (v / v) dans ddH 2 O.
  24. Après le second lavage, remettre en suspension les cellules dans 150 pi de Perm / Wash Buffer et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  25. Centrifuger les cellules à nouveau, puis aspirer le surnageant. Resuspendre les cellules dans 50 ul de tampon 1x Perm / Wash contenant anti-IFN-γ et incuber pendant 1 heure à 4 ° C dans l'obscurité.
  26. Laver les cellules deux fois avec un tampon 1x Perm / Wash, centrifuger entre les deux. Resuspendre les cellules dans 250 pi de tampon FACS puis transférer les cellules dans des tubes FACS.
  27. Passez à la cytométrie de flux acquisition en utilisant un cytomet de fluxer qui a une configuration laser et le filtre ensemble approprié de discriminer fluorochromes utilisés dans le panneau de coloration décrit dans le tableau 2 29. Prélever au moins 200.000 événements par échantillon et 10.000 événements pour les contrôles de rémunération.
  28. Appliquer la matrice de compensation et analyser les données à l' aide de cytométrie de flux logiciel d'analyse 30.

7. Mesure de la charge bactérienne dans la rate et le foie au moment de l'infection de pointe

NOTE: Toutes les étapes sont effectuées dans un BSC , sauf indication contraire.

  1. Inoculer souris IP avec 2 x 10 4 CFU de l'agent pathogène en utilisant des procédures décrites dans la procédure 4.
  2. Au jour 3 après l'infection, préparer 1,5 ml microtubes stériles, chacun contenant 500 ul de la glace froide stérile à 0,1% de Triton X-100 dans du PBS 1X et de 0,2 - 0,3 g de 1,5 - billes de verre stériles de l'acide lavé 2 mm. Peser chaque tube.
    NOTE: Les billes de verre sont l' acide lavées par incuconfitage dans de l'acide acétique à 10% dans un bêcher sur un agitateur magnétique pendant 1 heure. Ces billes sont ensuite soigneusement lavées avec ddH 2 O pour éliminer l' acide, sont séchés à l' air, puis autoclavés avant l'utilisation.
  3. Euthanasier souris par CO 2 exposition.
  4. Pour la dissection des organes, de jeter les animaux sur le dos sur une planche de dissection et épingler les membres de la souris à la carte en utilisant 25 g d'aiguilles. Désinfecter la peau en mouillant avec 70% d'éthanol.
  5. Avec des ciseaux de coupe difficiles stériles, faire une incision médiane dans la peau de l'aine à la mi poitrine, puis de l'aine mi vers chaque genou et de la mi-poitrine vers chaque coude. disséquer Blunt et reflètent en arrière la peau, l'épinglant ouvrir à l'aide de 25 G aiguilles.
  6. Désinfecter couche musculaire en mouillant avec 70% d'éthanol, puis en utilisant des ciseaux fins stériles font une incision médiane dans la paroi péritonéale. Prenez le processus xiphoïde avec une pince. Puis, en utilisant les mêmes ciseaux fins, faire des coupes dans la paroi péritonéale de la procé xiphoidss latéralement de chaque côté, à la suite de la cage thoracique, juste au-dessous du diaphragme pour faire apparaître le foie.
  7. Découpez un morceau mg du foie ~ 100 (utiliser le même lobe pour toutes les souris) à l'aide de ciseaux stériles et le placer dans un tube de 1,5 ml pré-pesé à centrifuger.
  8. Utilisez une pince pour pousser doucement de côté les organes sur le côté gauche de la cavité péritonéale pour visualiser la rate. saisir délicatement la rate avec une paire de pinces et de le libérer de la cavité péritonéale en coupant le tissu conjonctif environnant.
  9. Placez la rate dans le tube de 1,5 ml pré-pesé microcentrifugeuse contenant des billes. Transport tissus au laboratoire dans un récipient contenant de la glace étanche. Peser les tubes contenant les organes pour déterminer les poids des tissus en mg.
  10. Homogénéiser les tissus en agitant les tubes en utilisant un broyeur homogénéisateur à billes pendant 3 min à la fréquence de 30 Hertz.
    REMARQUE: La méthode de broyeur à billes est préféré pour l' homogénéisation car il est susceptible de procès-chanter un grand nombre d'échantillons et crée moins de gâchis et l'exposition potentielle à l'agent pathogène. Cependant, des homogénéisateurs automatiques ou autoclavés 2 ml homogénéisateur de tissu de verre manuel pourrait être utilisé comme une alternative.
  11. Préparer une série de dilutions de 10 fois des homogénats de 0,1% de Triton-X-100 dans du PBS 1X, allant de (allant de 10 -7 non dilué).
  12. 100 ul de se propager chaque homogénat dilué sur une plaque de gélose BHI (en double) à l'aide d'une spatule stérile. plaques de transfert à un incubateur à 37 ° et incuber pendant la nuit.
  13. Gardez les plaques qui contiennent entre 30 et 300 colonies / plaque, jeter le reste. Compter les colonies sur chaque plaque et déterminer le nombre moyen de colonies pour les écarts en double.
  14. Calculer la CFU / mg, selon l'équation suivante:
    UFC / mg = UFC / ml dans le broyat, multiplié par le nombre ml d'homogénat préparé, divisé par le poids mg de tissus homogénéisés.
    NOTE: Par exemple, si une moyenne de 30 colOnies ont été comptées après étalement 100 ul de 10 -2 homogénat dilué préparé à partir d' un morceau de foie de 120 mg qui a été homogénéisé dans 0,5 ml, les calculs seraient les suivants:
    UFC (facteur de dilution) / ml = 30 x 100 colonies / 0,1 ml (volume de propagation) = 30 000 UFC / ml.
    UFC / mg = 30 000 UFC / ml x 0,5 ml d'homogénat / 120 mg de tissu = 125 UFC / mg.

8. Effets de L. monocytogenes sur les réponses IFN-y par CD4 + et CD8 +

NOTE: Cette procédure décrit comment mesurer la production d' IFN-γ par splénique CD4 + et les cellules effectrices CD8 + T récoltées au moment du pic de la réponse adaptative immunitaire (~ 7 d post-infection) en utilisant deux méthodes: (1) Flux cytométrie pour mesurer l' IFN-y par des cellules CD4 + et CD8 + par coloration des cytokines intracellulaires, et (2) ELISA pour mesurer les taux totaux d'IFN-γ par les splénocytes obtenus (y compris toutes les cellules T). Procéduressont effectuées dans le BSC.

  1. Infecter des souris par l' injection ip avec 2 x 10 4 UFC de l'agent pathogène en utilisant les procédures décrites dans le document 4.
  2. Le jour 7 post-infection, euthanasier les souris par inhalation de CO 2 selon les directives institutionnelles.
  3. Disséquer la rate (comme décrit ci-dessus) et placer dans un tube conique de 15 ml contenant stérile 1x PBS. Transporter les tubes au laboratoire dans un récipient contenant de la glace étanche.
  4. Traiter les rates dans une suspension cellulaire unique, lyser les globules rouges comme décrit dans la section 6, puis remettre en suspension les cellules dans un milieu complet RPMI contenant 10% de FCS. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
  5. Mettre en place des cultures pour la mesure des réponses IFN-y. Pour cette cellules distribution (4 x 10 6 dans 1 ml / puits) dans des plaques à 24 puits ensemble avec et nombre égal (4 x 10 6 ou 1 ml / puits) de décongelés L. monocytogenes tuées par la chaleur (préparé dans la procédure 5) . Transfert des cellules à un 37° C incubateur.
  6. Après 20 heures d'incubation, ajouter 0,66 ul / ml d'inhibiteur de transport de protéines à des puits et continuer incubations.
  7. Quatre heures plus tard, la plaque de transfert à BSC et de recueillir 500 pi de surnageant de culture et de gel (à -80 ° C) pour la mesure ultérieure de niveaux d' IFN-y en utilisant un dosage immuno-enzymatique commerciale (ELISA) kit 31. Recueillir ensuite les cellules dans un tube de 15 ml stérile. Laver les puits avec PBS 1x et mettre en commun ce lavage avec des cellules recueillies.
  8. Procéder à la coloration de la surface cellulaire et la coloration intracellulaire pour l' IFN-γ sur CD4 + et CD8 + comme décrit dans la procédure 6 , sauf utiliser le panneau de coloration décrit dans le tableau 3. Passez à cytomètre de flux acquisition (collecte de 200.000 événements / échantillon) et analyser les données 29 à l' aide de cytométrie de flux logiciel d'analyse 30.

9. Mesure de la souris de survie à Endpoints après L. monocytogenes Infection

NOTE: Cette procédure décrit l'effet d'un agent sur la survie de la souris pour terminaux post-infection par la DL 50 dose modifiée de l'agent pathogène. Toutes ces procédures sont menées dans le BSC dans l'animalerie.

  1. Injecter souris IP avec la DL 50 dose modifiée de L. monocytogenes comme décrit dans la procédure 4. Ceci a été déterminé à être de 10 5 CFU (pour les hommes) ou 1,5 x 10 5 CFU (pour femmes) 31.
  2. Suivez les souris deux fois par jour pour les signes cliniques et d'enregistrer ces signes et le poids corporel des animaux dans un cahier de laboratoire. Euthanasier souris si elles montrent une perte de 20% du poids corporel ou deux signes cliniques de listériose (léthargie, fourrure ébouriffée, une posture voûtée, respiration laborieuse, les yeux ternes ou enfoncés).
  3. Après 14 jours, euthanasier souris survivantes par inhalation de CO 2.
  4. Préparer des parcelles de Kaplan-Meier des données en traçant la survie pour cent de chaque groupe contre le temps 32.
    NOTE: Si les souris succombent à l' infection (rencontrer effets décrits dans la déclaration d' éthique), cela se produit habituellement par jour 5 post-infection (figure 7).

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Résultats

La figure 3 présente un certain écoulement typique cytométrie coloration de l' IFN-γ dans les cellules NK et NKT spléniques à 24 h post-infection avec 10 5 CFU de l'agent pathogène. Cette figure illustre également la stratégie de déclenchement pour le panneau de coloration décrit dans le tableau 2. La figure 4 montre une partie des données représentatives qui ont été obtenus dans une expérience où les souris mâles ont ...

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Discussion

Nous décrivons ici un protocole sur la façon de procéder à une infection expérimentale de base avec la souche EGD de L. monocytogenes 25 C57BL / 6J mâles ou femelles. Ce protocole a été mis en place dans le but d'étudier l'effet d'une nouvelle petite molécule IS001 sur la production d' IFN-γ par les lymphocytes innées et adaptatives in vivo 31. En surveillant la clairance bactérienne et la survie post-infection, des idées ont été acquises sur la façon dont ces chan...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

L’élaboration de ce protocole a été soutenue par une subvention de fonctionnement des IRSC (MOP97807) pour le SED.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bouillon de perfusion Cerveau-Cœur, ModifiéBD299070toute marque devrait être appropriée
AgarBD214010toute marque devrait être appropriée
Triton X-100Sigma-AldrichX100toute marque devrait être appropriée
1x PBSSigmaD8537toute marque devrait être appropriée
TissueLyser IIQiagen85300Chlorure
d’ammonium (NH3Cl)toute marque doit être appropriée
KHCO3toute marque doit être appropriée
Na2EDTAtoute marque doit être appropriée
RPMI 1640Gibco22400089toute marque doit être appropriée
Sérum de Bovin Fœtal  ;Gibco12483Avant utilisation, inactivation thermique à 56 ° ; C pour 30 min
L-glutamineGibco25030n’importe quelle marque doit être appropriée
Acides aminés non essentielsGibco11140n’importe quelle marque doit être appropriée
Pénicilline/StreptomycineGibco15140n’importe quelle marque doit être appropriée
Inhibiteur de transport des protéines GolgiStop (contenant du monensin)BD554724Utilisation 4 &mu ; l dans 6 ml culture cellulaire
16 % ParaformaldehyeMicroscopie électronique Sciences15710Diluer à 4 % PFA dans ddH2O ou 1x PBS
10x Tampon Perm/WashBD554723Diluer 1x dans ddH2O
Fc block, Anti-souris CD16/CD32 PurifiedeBioscience14-0161Dilué 1:50
Viabilité fixable Dye eFluor 506eBioscience65-0866Diluer 1:1 000 (nous avons également utilisé des colorants de viabilité provenant de sondes moléculaires)
anti-souris CD4-PE-Cy5 (GK1.5)eBioscience15-0041Le fabricant recommande une certaine taille de test ; cependant, celle-ci doit être titrée avant utilisation.
anti-souris CD8-FITC (53-6.7)eBioscience11-0081Le fabricant recommande une certaine taille de test, mais celle-ci doit être titrée avant utilisation.
PBS57/mCD1d tetramer-APCNIH Tetramer Core FacilityN/AObtenu en cadeau de l’installation
anti-Mouse TCR&beta ;-PE-Cy7 (H56-597)eBioscience25-5961Le fabricant recommande une certaine taille de test, mais celle-ci doit être titrée avant utilisation.
anti-souris NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)eBioscience47-3351Le fabricant recommande une certaine taille de test, mais celle-ci doit être titrée avant utilisation.
anti-souris CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)eBioscience25-0451Le fabricant recommande une certaine taille de test, mais celle-ci doit être titrée avant utilisation.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2)eBioscience12-7311Le fabricant recommande une certaine taille de test, mais celle-ci doit être titrée avant utilisation.
OneComp eBeadseBioscience01-1111Utiliser une goutte par coloration
Souris IFN gamma ELISA kiteBioscience88-7314Utilisé pour mesurer l’interféron gamma dans le surnageant de culture
Tubes ventilés de 50 ml pour la cultureUtilisé pour la culture des bactéries, toute marque doit être appropriée
Tubestoute marque doit être appropriée
de Pétri bactériennesToute marque devrait être appropriée
2 ml CyrovialsToute marque devrait être appropriée
SpectromètreToute marque devrait être appropriée
AiguillesToute marque devrait être appropriée
C57BL/6JJackson laboratoriesStock # 000664Commandez pour arrivée à 7 semaines
Eau de JavelPour la décontamination
70 % ÉthanolPour la décontamination
Perlestoute marque doit être appropriée
Rotor de centrifugeuse, seaux, couvercles de seau.
Microcentrifugeusen’importe quelle marque doit être appropriée
GlycérolN’importe quelle marque doit être appropriée
Pointes den’importe quelle marque doit être appropriée
Pipetten’importe quelle marque doit être appropriée
Instrumentsn’importe quelle marque doit être appropriée
70 microns crépines n’importequelle marque doit être appropriée
Seringue de 3 ml n’importequelle marque doit être appropriée
Pistoletn’importe quelle marque doit être appropriée
Unitésn’importe quelle marque doit être appropriée
Trypan BlueDiluer 1 à 9 dans ddH2O, toute marque doit être appropriée
Hémocytomètren’importe quelle marque doit être appropriée
à fond rond n’importequelle marque doit être appropriée
Tubes FACsFisher Scientific14-959-5
BD LSR IIBDTout cytomètre en flux pouvant être utilisé pour l’acquisition s’il dispose d’une configuration laser appropriée et d’un ensemble de filtres pour discriminer les fluorochormes
Flowjo logicielTreestarUtilisé pour l’analyse des données. D’autres types de logiciels d’analyse de données seront également appropriés
: pipette multicanaux (0 - 300 & micro ; l)EppendorfUtilisé pour laver les cellules et ajouter des anticorps lors de la coloration par cytométrie en flux
AcideUtilisé pour laver les billes de verre, toute marque doit être appropriée
Microbanque Système de préservation bactériennePro-lab DiagnosticsUtilisé comme alternative aux stocks de glycérol pour le stockage à long terme des bactéries
, de microcentrifugation de 1,5 ml boîtes UV de sécurité de verre stérile pipette chirurgicaux pipette de filtration Plaques acétique

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