Sporulation efficace de Saccharomyces cerevisiae Dans un 96 Multiwell Format

Résumé

Ici, la sporulation de Saccharomyces cerevisiae est réalisée dans un format multipuits 96.

Résumé

Pendant les périodes de stress nutritionnel, Saccharomyces cerevisiae subit une gamétogenèse, connue sous le nom de sporulation. Les cellules de levure diploïdes qui sont privées d’azote et de carbone initieront le processus de sporulation. Le processus de sporulation comprend une méiose suivie de la formation de spores, où les noyaux haploïdes sont emballés dans des spores résistantes à l’environnement. Nous avons développé des méthodes pour la sporulation efficace de levures bourgeonnantes dans 96 plaques multipuits, afin d’augmenter le débit de criblage des cellules de levure pour les phénotypes de sporulation. Ces méthodes sont compatibles avec le criblage avec des plasmides contenant des levures nécessitant une sélection nutritionnelle, lorsque des milieux minimaux appropriés sont utilisés, ou avec le criblage de levures avec des altérations génomiques, lorsqu’un régime de présporulation riche est utilisé. Nous constatons que pour cette méthode, l’aération pendant la sporulation est essentielle à la formation des spores, et nous avons mis au point des techniques pour assurer une aération suffisante qui sont compatibles avec le format de plaques multipuits 96. Bien que ces méthodes n’atteignent pas le niveau typique de sporulation de ~80 % qui peut être atteint dans des expériences basées sur des flacons de grand volume, ces méthodes permettront d’atteindre de manière fiable un niveau de sporulation d’environ 50 à 60 % dans des plaques multipuits de petit volume.

Introduction

La sporulation chez la levure en herbe a été étudié pour donner un aperçu de nombreux aspects de la biologie, y compris le contrôle de la ségrégation des chromosomes lors de la méiose ^1, les mécanismes de recombinaison génétique ^2, le contrôle du développement par la cellule de signalisation ^3, contrôle nutritionnel du développement ^4, la transcription régulation du développement ^5, et l'examen de la formation de spores ^6. La formation de spores comprend un événement de division cellulaire nouvelle impliquant la formation de nouveaux compartiments à l' intérieur de la membrane de la cellule mère , suivie par le dépôt d'une paroi protectrice ⁶ spores. Ces études qui examinent les cellules sporulantes profitent souvent de la souche de levure sporulation rapidement SK1, qui peut subir le processus de sporulation dans environ 24 heures de façon relativement efficace ^7,8. Bien que l' optimisation des conditions de sporulation de la levure bourgeonnante ont été décrits ^13/09, ces expériencess examiné sporulation sur des supports solides ou dans les grandes cultures liquides à grande échelle où sporulation est effectuée en utilisant des tubes de culture ou flacons.

Nous décrivons ici un procédé pour la sporulation de la levure dans un format de plaque multipuits 96. Nous constatons que, pour ce procédé, l'aération est essentielle pour la sporulation synchrone et efficace, et ont mis au point des techniques pour assurer une sporulation suffisante d'un format multi-puits de faible volume. Sporuler dans un format de plaque multipuits 96 permet de cellules devant être criblés en utilisant des techniques à haut débit et des réactifs optimisés pour un format de plaque multipuits, un tel criblage pour des suppresseurs de copies élevé en utilisant une bibliothèque de tuiles ^14-16.

Protocole

1. Préparation de sporulation

Remarque:. Les milieux décrits dans ce protocole sont réalisés en utilisant des recettes et des méthodes standard ^13,17 Le tableau 1 donne la formulation pour 1 L des différents médias utilisés dans ce protocole.

	bactopeptone	Extrait de levure	gélose Bacto	Dextrose	L'acétate de potassium	Glycérol	ddH 2 O
plaques GPJ	20 g	10 g	20 g	-	-	30 ml	970 ml
des boîtes de YPD	20 g	10 g	20 g	20 g	-	-	1000 ml
liquide YPD	20 g	10 g	-	20 g	-	-	1000 ml
liquide YPA	20 g	10 g	-	-	20 g	-	1000 ml
médias sporulation	-	-	-	-	10 g	-	1000 ml

Tableau 1:. Formulations des médias Les montants sont donnés pour 1 L de médias. Spécificités sur les médiasles ingrédients peuvent être trouvés dans la table des matières.

1. Si toutes les cellules sporulantes sera le même Génotype, suivez cette procédure:
   1. la souche de levure Thaw à utiliser sur un (YPGlycerol) plaque GPJ. Cultivez levure pour 12-16 heures à 30 ° C. Fait important, les cellules SK1 sont également prêts à sporuler, donc les souches SK1 ne doivent pas être laissés trop longtemps sur des plaques de GPJ, ou ils peuvent sporuler sur la plaque.
      Remarque: Une souche fraîchement décongelé cultivée sur YPG est préféré, que l'utilisation du glycérol comme source de carbone nécessite la phosphorylation oxydative, et sélectionne ainsi les cellules qui ont l'ADN mitochondrial fonctionnel. les cellules SK1 ont tendance à perdre de l'ADN mitochondrial fonctionnel et devenir petites. L'ADN mitochondrial fonctionnelle est nécessaire pour la sporulation.
   2. Streak levure à partir de la plaque de GPJ sur un YPD (YPDextrose) plaque pour des colonies isolées. Cultiver la levure sur la plaque YPD 24-28 h à 30 ° C.
   3. Après environ 36-48 h de la croissance sur YPD milieux solides, démarrer une culture YPD 25 ml en utilisant une seule coloniede la plaque YPD. Cultivez cette culture jusqu'à ce que les cellules sont sur ​​DO ₆₀₀ = 4,0 à 7,0. Effectuez cette étape à 30 ° C pendant la nuit dans un incubateur à agitation, en agitant à 220 tours par minute.
   4. De la culture YPD, utiliser une quantité appropriée de cellules pour démarrer 1000 ml de YPA (YPAcetate) culture qui est DO ₆₀₀ = 0,1 pour chaque besoin plaque à 96 puits dans la section 2. Cultiver la levure dans un incubateur agitateur à 30 ° C (agitation à 220 rpm) jusqu'à ce que la _DO600 de la culture est compris entre 1,3 et 1,5.
      Note: inoculer 100 ml de culture LPJ pour chaque plaque multipuits 96 à cribler dans la section 2. Par exemple, si le dépistage quatre 96 plaques multipuits, 400 ml de culture LPJ seront nécessaires. A partir de 10% du volume supplémentaire dans la culture LPJ est nécessaire pour protéger contre la perte de volume par évaporation. En règle générale, il faudra compter entre 12-16 h pour les cellules pour atteindre la DO appropriée _600; la durée peut varier en fonction du génotype de la souche de levure. LPJ est le média de présporulation. préculturedans de l' acétate aide induire l' expression des gènes (comme IME1) nécessaire pour efficace et synchrone sporulation ^6.
   5. Spin à 1.800 xg dans une centrifugeuse de table pendant 5 min pour sédimenter les cellules cultivées dans LPJ. Laver les cellules 1x avec 0,5 volume d'eau désionisée autoclavée stérile. Spin à nouveau, et jeter laver. Resuspendre les cellules dans les médias 1x volume de sporulation. Continuer à la section 2.
2. Si l' utilisation de cellules pour sporulation qui sont des génotypes différents, (c. -à- transformées avec des plasmides différents ou contenant différentes mutations, généralement obtenues et stockées sous forme de stocks congelés), des cellules de tableau des différents génotypes dans un format 96 multipuits. Ensuite, suivez cette procédure:
   1. Utilisez un 96 broches frogger stérile pour transférer des cellules à partir de stocks congelés décongelés dans 96 plaque (s) multipuits sur YPG milieux solides. Cultiver la levure pendant la nuit à 30 ° C.
   2. Utilisation d'un 96 broches frogger stérile, transférer les cellules de YPG milieux solides sur YPD milieux solides ou sélectiveun milieu solide ( par exemple, un milieu minimal synthétique dépourvu des acides aminés, si les cellules contiennent des plasmides qui nécessitent une sélection). Cultiver la levure à 30 ° C jusqu'à ce que les colonies sont formées pour chaque souche, typiquement 1 jour sur YPD et 2 jours si des milieux sélectifs est nécessaire.
   3. Aliquoter 1,2 ml de milieu liquide YPD ou des milieux liquides sélectifs dans chaque puits d'une plaque multipuits 96 profondeur de 2 ml. Transfert des cellules à partir de supports solides dans des milieux liquides en utilisant un frogger, couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban, et de croître pendant une nuit dans 30 ° C shaker, agitation à 220 rpm.
      Remarque: Pour minimiser la contamination, des plaques de couverture en utilisant les couvercles en plastique à partir d'une boîte de Pétri rectangulaire. Tenir les paupières en place au moyen d'un morceau de ruban adhésif, de sorte que la circulation de l'air est très peu limité.
   4. plaques centrifuger à 1800 xg pendant 5 min, en utilisant un seau centrifuge oscillant avec des adaptateurs pour accueillir plaques à 96 puits. Décanter médias de cellules; ajouter 500 ul LPJ à chaque puits et resuspendre cellules sédimentées dans la LPJ. Couvertureavec couvercle en plastique maintenu en place par un ruban.
   5. Cultiver les cellules pendant 15 heures à 30 ° C dans un incubateur à agitation, en agitant à 220 tours par minute. Continuer à la section 2.

2. Les cellules sporulantes dans un 96 Multiwell Format

1. Ajouter un ou l'autre de 3 mm perle de verre solide stérile ou un stériles 5 mm x 2 mm barre d'agitation magnétique dans chaque puits d'une plaque de 96 puits avec 1,3 ml de puits. (Voir résultats représentatifs ci - dessous pour une discussion sur l' opportunité d'utiliser un cordon ou d' une barre d'agitation.)
2. Si toutes les cellules à cribler sont du même génotype, aller à 2.2.1. Si les cellules à cribler sont de différents génotypes, aller à 2.2.2.
   1. Prenez des cellules de l'étape 1.1.5 et aliquote de 500 pi de cellules plus les médias dans chaque puits de la plaque multipuits 96. Couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. Passez à 2.3.
   2. les cellules de spin qui sont LPJ de 1.2.4 à 1800 g pendant 5 min, en utilisant une centrifugeuse à godet oscillant avec des adaptateurs pour recevoir des plaques à 96 puits. verser def support de cellules. Ajouter 500 ul de milieu de sporulation dans chaque puits et les remettre en suspension les cellules sédimentées dans le milieu de sporulation. Couvrir avec un couvercle en plastique maintenu en place par un ruban. Passez à 2.3.
3. Si vous utilisez une perle de verre, placer les échantillons dans un incubateur sous agitation à 30 ° C et agiter à 220 rpm pour la sporulation. Si vous utilisez une barre d'agitation magnétique, placer les échantillons sur une plaque d'agitation à l'intérieur d'un 30 ° C incubateur pour sporulation.
   Remarque: La vitesse d'agitation exacte pour les barres d'agitation magnétique est pas très important, aussi longtemps que toutes les barres se déplacent énergiquement et la culture est aéré.
4. Pour surveiller la progression à travers la sporulation, prélever des échantillons de la culture sporulée pour la visualisation, Ajouter 6 ul de cellules à partir des cultures sporulées à 24 pi de milieu de sporulation dans une plaque à 96 puits lamelle couvre-objet (1: 5 de dilution). Laisser les cellules se contenter de 5 minutes avant d'examiner les cellules en utilisant un microscope inversé.
   Remarque: Dans les cellules SK1 de type sauvage, les spores matures compacts formeront par 36 heures après le transfert aux médias de sporulation. La progression à travers la sporulation peut être contrôlée par microscopie en utilisant des marqueurs fluorescents, comme un marqueur nucléaire (c. -à -HTB2 mCherry ¹⁸⁾ pour examiner la méiose ou un marqueur de la membrane ProSpore (c. -à- G20 ¹⁹⁾ pour examiner la morphogenèse des spores. En variante, la formation de spores réfringents peut être vu à l'aide de DIC Nomarski microscopie à partir d'environ 12 heures après le transfert au milieu de sporulation.

Résultats

Pour évaluer ce protocole, l' efficacité de sporulation obtenus à partir de cellules sporulantes dans des plaques multipuits (comme décrit ci - dessus) ont été comparées à des cellules sporulées en utilisant des volumes plus importants dans des flacons (tableau 2). L'utilisation de plaques multipuits n'a pas atteint le rendement élevé vu quand sporulation dans des flacons, où ~ 80% d'efficacité peut être régulièrement vu. Sporulation dans des plaques multipuits avec une ...

Discussion

Nous présentons ici un protocole de sporulation SK1 levure dans un format de 96 multipuits. Aération est la clé pour la sporulation efficace, ce qui nécessite l'utilisation soit d'un barreau d'agitation ou une perle de verre dans chaque puits. Lorsque les cellules sont sporulés dans une plaque multipuits 96 dans un incubateur à agitation sans soit une perle ou une barre d'agitation, les cellules ne sporulation pas efficacement. Seule une petite augmentation de l'efficacité de la sporulation est obser...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nunc 1,3 ml DeepWell Plates ThermoScientific		260251	Utilisé pour la sporulation
Nunc 2,0 ml Plaques DeepWell	ThermoScientific	278743	Utilisé pour la croissance par présporulation, étape 1.2.3
Bille de verre de 3 mm	Fisher	11-312A	Utilisé pour la sporulation
Barre d’agitation de 5 mm x 2 mm, paquet de 12	Fisher	14-511-82	Utilisée pour la sporulation
96 bien frogger	V& P Scientific	VP407	nécessaire pour l’étape 1.2
copieur de bibliothèque	V& P Scientific	VP381	nécessaire pour l’étape 1.2 ; à utiliser avec la
boîte de Pétri rectangulaire	ThermoScientific	264728	nécessaire pour l’étape 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	nécessaire pour les milieux
Extrait de levure	BD	212750	nécessaire pour les milieux
Bacto Agar	BD	212750	nécessaire pour les milieux
Dextrose	Fisher	D16-3	nécessaire pour les milieux
Acétate de potassium	Fisher	P171-500	nécessaire pour les milieux
Glycérol	Fisher	G33-500	nécessaire pour les milieux
Plaque inférieure en verre noir à 96 puits	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	nécessaire pour l’étape 2.4