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DOI :

10.3791/54592

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8 décembre 2016

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1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons un modèle murin in vitro de la barrière hémato-encéphalique qui utilise la spectroscopie cellulaire d’impédance, en mettant l’accent sur les conséquences sur l’intégrité et la perméabilité des cellules endothéliales lors de l’interaction avec les cellules T activées.

Résumé

La rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) est une étape critique dans le développement de maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques (SEP) et son modèle animal expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE). Ce processus est caractérisé par la transmigration des lymphocytes T activés à travers les cellules endothéliales cérébrales (CE), les principaux constituants de la BHE. Cependant, les conséquences sur la fonction cérébrale de l’interaction avec ces lymphocytes T sont largement inconnues. Nous décrivons ici un test qui permet d’évaluer la fonction microvasculaire primaire de l’EC cérébrale de souris (MBMEC) et l’intégrité de la barrière lors de l’interaction avec les lymphocytes T au fil du temps. Le test utilise la spectroscopie cellulaire d’impédance, un outil puissant pour étudier l’intégrité et la perméabilité des monocouches EC, en mesurant les changements de résistance électrique transendothéliale (TEER) et de capacité de la couche cellulaire (Ccl). En contact direct avec les CE, les lymphocytes T stimulés mais non naïfs sont capables d’induire un dysfonctionnement de la monocouche EC, comme le montre une diminution de TEER et une augmentation de Ccl. Le test enregistre les changements dans l’intégrité de la monocouche EC de manière continue et automatisée. Il est suffisamment sensible pour distinguer les différentes forces de stimuli et les niveaux d’activation des lymphocytes T et il permet d’étudier les conséquences d’une modulation ciblée de l’interaction lymphocytes T-EC à l’aide d’un large éventail de substances telles que des anticorps, des réactifs pharmacologiques et des cytokines. La technique peut également être utilisée comme contrôle de la qualité de l’intégrité de la CE dans les essais de transmigration in vitro des lymphocytes T. Ces applications en font un outil polyvalent pour l’étude des propriétés de la BHE dans des conditions physiologiques et physiopathologiques.

Introduction

La barrière hémato-encéphalique sépare la circulation systémique du système nerveux central (SNC) 1 - 3. Il fournit une barrière physique qui empêche la libre circulation des cellules et la diffusion des molécules solubles dans l'eau et protège le cerveau contre les agents pathogènes et des substances potentiellement nocives. En plus de sa fonction de barrière, la BHE permet l'apport d'oxygène et de nutriments pour le parenchyme du cerveau, ce qui assure le bon fonctionnement du tissu neuronal. Propriétés fonctionnelles du BBB sont très réglementés par ses composants cellulaires et acellulaires, avec CEs hautement spécialisé étant son principal élément structurel. CEs de la BHE sont caractérisés par la présence de jonctions serrées (TJ) de complexes, le manque de fenestrations, très faible activité pinocytaire, et les mécanismes de transport actives en permanence. D'autres composantes du BBB La membrane basale CE, péricytes enrobage de l'endothélium, astrocytaires pieds d'extrémité et = par associémembrane basale de enchymal contribuent également au développement, la maintenance et le fonctionnement du BBB 2,4 - 6 et, de concert avec les neurones et les microglies, forment l'unité neurovasculaire (NVU), qui permet le bon fonctionnement du CNS 7-9.

Dans une variété de maladies neurologiques, telles que la neuro - dégénératives, des maladies inflammatoires ou infectieuses, la fonction de la BHE est compromise 2,5,10. Dysrégulation de TJ complexes et les mécanismes de transport moléculaire entraîne une augmentation de la perméabilité BBB, leucocytaire extravasation, l'inflammation et des lésions neuronales. Afin d'étudier les propriétés BBB dans de telles conditions physiopathologiques, divers modèles in vitro de BBB ont été établies 9,11,12. Ensemble, ils ont fourni des indications précieuses sur les changements de l'intégrité de la barrière, la perméabilité ainsi que des mécanismes de transport. Ces modèles utilisent des cellules endothéliales humaines, de souris, de rat, de porc ou de borigine ovine 13 - 18; les cellules endothéliales primaires ou de lignées de cellules sont cultivées soit en monoculture ou conjointement avec les péricytes et / ou des astrocytes dans le but d'imiter plus étroitement la BHE in vivo 19-25. Ces dernières années, la mesure de la résistance électrique transendothéliale (TEER) est devenu un outil largement accepté pour évaluer les propriétés de barrière endothéliale 26,27.

TEER reflète l'impédance au flux d'ions à travers la monocouche cellulaire et sa diminution fournit une mesure sensible de l'intégrité de la barrière endotheliale compromise et par conséquent une plus grande perméabilité. Divers systèmes de mesure de TEER ont été mis au point, y compris épithéliale Voltohmmeter (EVOM), Cell-substrat électrique Impedance Sensing (ECIS), et analyse en temps réel des cellules 15,28 - 30. TEER reflète la résistance au flux d'ions entre CEs adjacentes (voie paracellulaire) et est directement proportionnelle à laintégrité de la barrière. En impédance spectroscopie 27,31, impédance totale complexe (Z) est mesurée, qui fournit des informations supplémentaires sur l'intégrité de la barrière en mesurant Ccl. Ccl se rapporte au courant capacitif à travers la membrane cellulaire (transcellulaire passage): la couche cellulaire se comporte comme un condensateur dans le circuit électrique équivalent, la séparation des charges sur les deux côtés de la membrane et est inversement proportionnelle à l'intégrité de la barrière. Lorsqu'il est cultivé sur des inserts perméables, CEs adhèrent, prolifèrent et étalée sur la membrane microporeuse. Résiste à ce courant capacitif de fond de l'insert (qui lui-même agit comme un condensateur) et conduit à une baisse de la capacité jusqu'à ce qu'elle atteigne son niveau minimal. Elle est suivie par la mise en place de TJ complexes qui joint l'espace entre CEs adjacents. Cela restreint le flux d'ions à travers la voie paracellulaire et TEER augmente jusqu'à ce qu'il atteigne son plateau. Dans des conditions inflammatoires, cependant, le endothelial barrière est compromise: TEER diminue à mesure que les complexes TJ se perturbé et Ccl augmente à mesure que la composante capacitive de l'insert augmente à nouveau.

Notre mesure TEER utilise la surveillance automatisée des cellules 32 du système: il suit le principe de la spectroscopie d'impédance et étend ses applications précédentes. Ici, nous décrivons un modèle in vitro BBB qui permet l'étude des propriétés de barrière, y compris l'interaction de l' endothélium cérébral avec les cellules immunitaires; en particulier les lymphocytes T activés. De telles conditions physiopathologiques sont observées dans les maladies auto - immunes du système nerveux central, telles que la sclérose en plaques et de son modèle animal expérimental encéphalomyélite auto - immune 33-37. Ici, une étape cruciale est la transmigration des cellules T spécifiques de la myéline encéphalitogéniques à travers la BHE. Ceci est suivi par leur réactivation dans l'espace périvasculaire et l'entrée dans le parenchyme du cerveau, où ils recrutent d'autres cellules immunitaires et mel' inflammation diate et démyélinisation ultérieure 1,35,38. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'interaction entre les cellules T et les cellules endothéliales, les principaux constituants de la BHE, ne sont pas bien comprises. Notre protocole vise à combler cette lacune et donner de nouvelles perspectives sur les conséquences sur les cellules endothéliales ( par exemple, l' intégrité de la barrière et de perméabilité) lors de leur contact direct et interaction complexe avec les cellules T activées.

Le protocole décrit ici utilise des cellules du cerveau endothéliales microvasculaires de souris primaires, cultivées en monocouche sur des inserts perméables avec des membranes microporeuses. Les cellules endothéliales sont co-cultivées avec des cellules T CD4 +, qui peut être pré-activé soit polyclonale ou d'une manière spécifique de l' antigène. Co-culture de cellules T avec MBMECs pré-activé, mais pas naïf induit une diminution de la TEER et une augmentation de la CCl, qui fournit une mesure quantitative du dysfonctionnement et la rupture de la barrière MBMEC. La techniqueest non-invasive: il utilise intégré à la place d'électrodes de baguettes, qui empêchent perturbation majeure de la monocouche CE; il peut être utilisé pour surveiller la fonction de barrière sans l'utilisation de marqueurs cellulaires. Il effectue des mesures continues de manière automatisée et permet une évaluation indépendante des deux paramètres de barrière (TEER et Ccl) simultanément au fil du temps. Le procédé est également suffisamment sensible pour faire la distinction entre les différents niveaux d'activation des lymphocytes T et les effets de ces cellules T sur CEs.

Il peut être utilisé dans une large gamme de dosages fonctionnels: les différentes cytokines et / ou chimiokines impliquées dans les processus inflammatoires peuvent être ajoutés à la co-culture de MBMECs et les lymphocytes T; blocage des anticorps dirigés contre des molécules d'adhésion cellulaire de chaque côté de la CE, ou des cellules T peuvent être utilisées; et des inhibiteurs de marqueurs d'activation des lymphocytes T ou de leurs propriétés cytolytiques peuvent être ajoutés au cours de l'amorçage des cellules T ou de leur co-culture avec CEs. L'essai est également utile pour la transmigration des cellules Tdes essais, car il peut servir de contrôle de la qualité de l'intégrité de la monocouche MBMEC avant l'addition des cellules T. Tout cela fait de cette méthode un outil polyvalent et fiable pour étudier la BHE in vitro, avec un accent sur l'effet des lymphocytes T activés sur l' intégrité de la monocouche CE. Ceci est d'une importance particulière pour la compréhension des mécanismes de la perturbation BBB dans la pathogenèse des maladies auto-immunes, telles que MS et son modèle animal EAE, où, les cellules T encéphalitogéniques autoréactives traversent la BHE et provoquent une inflammation et des lésions neuronales.

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Protocole

Pour toutes les expériences, les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques dans l'animalerie centrale à l'Université de Münster, selon les directives allemandes pour le soin des animaux. Toutes les expériences ont été réalisées selon les directives du comité d'éthique des animaux expérimentaux et approuvés par les autorités locales de Rhénanie du Nord-Westphalie, Allemagne (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).

1. MBMEC Isolement et culture

NOTE: Isoler MBMECs comme précédemment décrit en détail 14 avec les modifications suivantes:

  1. Sacrifiez 20 adultes C57BL / 6 (6-8 semaines) par inhalation de CO 2 et confirmer leur mort en constatant l' arrêt cardiaque et respiratoire.
  2. Rincer la souris avec 70% d'éthanol et décapiter l'aide de ciseaux; retirer le cuir chevelu à l'aide de pinces et ciseaux. Faire des incisions sur le côté gauche et à droite du crâne, à partir du foramen magnum. Soulevez le crâne de son côté caudale et take sur le cerveau avec une pince.
  3. Sous une hotte à flux laminaire, utiliser des pinces stériles pour placer le cerveau dans une boîte de Pétri et retirer le tronc cérébral, le cervelet et le thalamus, ne conservant que le cortex.
    NOTE: L'utilisation d'un microscope est pas nécessaire pour l'une de ces étapes.
  4. Placez le cortex sur un morceau de papier buvard Western stérile et le rouler délicatement avec une pince jusqu'à ce meninges ne sont plus visibles.
  5. Après digestion enzymatique et mécanique (suivant le protocole 14), collecter des cellules endotheliales à partir du gradient de densité à l'aide d' une longue aiguille stérile et 5 ml de piston. Les cellules endothéliales apparaissent comme une couche sombre au-dessus de l'anneau rouge avec des érythrocytes. Transfert de 20 à 25 ml de cette couche dans un nouveau tube de 50 ml d'une centrifugation; recharger le tube avec DMEM.
  6. Après deux tours de lavage 14, remettre en suspension les cellules dans 6 ml de milieu MBMEC contenant Puromycin (4 pg / ml) et épépiner sur six puits recouverts d'une plaque de 24 puits; les laisser dans un tissuincubateur de culture à 37 ° C et 5% de CO 2 (dénommé «incubateur» à partir d' ici) pendant trois jours.
    NOTE: Pour plus de détails de la solution de revêtement MBMEC, voir le tableau des matériaux.
  7. Changer le support en ajoutant 1 ml à chaque puits de milieu MBMEC frais sans puromycine; mettre la plaque arrière à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant deux jours.

2. La récolte MBMECs

  1. Sur cinq jours après MBMEC isolement, pré-manteau inserts perméables avec une solution de revêtement MBMEC: ajouter 80 pi de solution par insert et les laisser à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 3 heures.
  2. pipette avec précaution la solution de revêtement et laisser inserts sécher à l'air pendant 30 minutes. Ajouter 2 ml de la température ambiante (RT) PBS dans chaque puits de la plaque, à l'aide MBMECs pour laver le support; répétez cette étape. Ajouter 0,05% trypsine-EDTA (300 pi par puits) et laisser la plaque dans l'incubateur pendant 5-10 min.
  3. Ajouter 2 ml de milieu MBMEC à chaque puits pour arrêtertrypsinisation. Transférer les cellules recueillies dans un tube de centrifugation de 15 ml et les centrifuger à 700 g pendant 8 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu MBMEC sans puromycine.
  4. Compter les cellules; mélanger 10 ul de suspension cellulaire avec 90 ul de 0,04% de Bleu Trypan (10x) de cellules de dilution. Pipette 10 pi de ce mélange entre le couvercle de verre et la chambre de comptage de cellules (hémocytomètre). Count TRYPAN cellules Blue-libres dans les quatre quadrants de la chambre (N) et déterminer le nombre moyen de cellules comptées (N ') comme suit: N' = N / 4.
  5. Calculer la concentration de cellules (dans 10 6 cellules / ml) en utilisant la formule suivante: C = N x 10 4 x 10 où 10 4 est donnée par les dimensions de l'hémocytomètre et 10 est le facteur de dilution de l' étape 2.4.
  6. Semences 2 x 10 4 cellules dans un volume de 260 ul par insertion. Ajouter 810 ul de milieu MBMEC dans le compartiment inférieur de chaque puits. Placer la plaque avec des inserts dans l'incubateur jusqu'à ce prêt à procéder à l'article 4.
    NOTE: Les volumes pour le compartiment supérieur et inférieur sont insert spécifique et ne fonctionnent pas pour tous les formats de 24 puits.

3. T CD4 + Isolement cellulaire et stimulation

  1. CD4 + lymphocytes T Isolation
    1. Sacrifiez une souris adulte (6-8 semaines) par inhalation de CO 2 et de confirmer sa mort en constatant l' arrêt cardiaque et respiratoire.
    2. Placez la souris sur le dos sur une planche de dissection propre et le rincer à l'éthanol à 70%; utiliser des ciseaux et des pinces stériles pour ouvrir le péritoine et enlever la rate et les ganglions lymphatiques (inguinale, axillaire, brachial et cervicales); Enfin, le transfert du tissu dans un tube de centrifugation de 15 ml contenant 5 ml de PBS sur de la glace.
    3. Sous la hotte à flux laminaire, transférer le tissu décante le PBS avec le tissu dans un tube de centrifugation de 50 ml avec un tamis cellulaire de 70 pm sur le dessus; homogénéiserle tissu en le pressant avec un piston de 1 ml à travers le tamis.
    4. Ajouter 30 ml de tampon FACS et centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de tampon FACS. On filtre la suspension à travers un tamis cellulaire de 40 pm, ajoute encore 20 ml de tampon FACS au tube.
    5. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 500 pi de tampon FACS.
    6. Ajouter 20 ul de microbilles magnétiques souris CD4, bien mélanger et laisser incuber pendant 15 min à 4 ° C. Ajouter 25 ml de tampon FACS et centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C.
    7. Entre-temps, placer une colonne de séparation de LS dans l'aimant et le rincer avec 3 ml de tampon FACS. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 3 ml de tampon FACS.
    8. Ajouter des cellules dans la colonne. Laver la colonne avec 3 ml de tampon FACS à trois reprises. Retirer la colonne de l'aimant et le placer sur un nouveau 15 ml centritube fugation. Ajouter 5 ml de tampon FACS, débusquer les cellules marquées avec le piston de la colonne et centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C.
    9. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 3 ml de milieu de lymphocytes T. Compter les cellules comme décrit dans 2.4 et semences 1 x 10 5 cellules dans 100 ul de milieu par puits.
  2. CD4 + lymphocytes T Stimulation
    1. La stimulation polyclonale des cellules T CD4 +
      1. Prérevêtement une plaque à 96 puits à fond rond avec de l'anticorps purifié anti-souris CD3 (clone 145-2C11) dans du PBS à une concentration finale désirée. Par exemple, pour une pré-enduire la plaque complète avec α-CD3 à 1 pg / ml, mélanger 10 pi de l'anticorps (concentration du stock = 0,5 mg / ml) avec 5 ml de PBS, vortex et ajouter 50 ul du mélange à chaque puits avec une pipette à canaux multiples.
      2. Laissez la plaque dans l'incubateur pendant 3 heures. Après avoir isolé les cellules T, laver la plaque pré-enduit deux fois avec PBS. Ajouter un anticorps anti-CD28 purifié (clone37,51) à des lymphocytes T isolés à une concentration finale désirée (par exemple à 1 pg / ml); bien mélanger. Ensemencer les cellules T et les laisser dans l'incubateur pendant deux à trois jours.
    2. Stimulation des lymphocytes T CD4 + spécifiques de l' antigène avec des cellules dendritiques (DCs)
      NOTE: Si les PED sont utilisées comme cellules présentatrices d'antigène (CPA), suivre le protocole pour l'isolement des cellules T, avec ces exceptions:
      1. Avant l'homogénéisation de la rate, injecter 1 ml de collagénase type IA dans du PBS à 0,5 mg / ml et la transfère dans un tube de 15 ml par centrifugation.
      2. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Après un lavage avec du PBS, resuspendre le culot dans du tampon pour FACS et ajouter 20 ul de microbilles magnétiques CD11c de souris, au lieu de microbilles de CD4.
      3. Utilisez une colonne de séparation MS et les volumes appropriés: rincer la colonne avec 1 ml de tampon FACS; Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon FACS et laver la colonne avec 1 ml de tampon FACS à trois reprises.
      4. Un dd ' antigène de choix pour les PED (par exemple, la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG) aa 35-55 à 20 pg / ml), bien mélanger et de graines 5 x 10 4 cellules dans 100 pi de T milieu de culture cellulaire par 96 tour-bottom bien.
      5. Ajouter 1 x 10 5 cellules T dans 100 ul de milieu de culture T de cellules par 96 fond rond de puits à la fin, comme décrit dans le protocole d' isolement pour des cellules T.
    3. Stimulation des lymphocytes T CD4 + spécifiques de l' antigène avec les cellules B
      NOTE: Si les cellules B sont utilisées comme APC, suivre le protocole pour l'isolement des cellules T, avec ces exceptions:
      1. Utilisez la rate de souris transgéniques dont les cellules B sont spécifiques de l' antigène (par exemple, IgH MOG (Th) des souris, dont les cellules B reconnaissent spécifiquement MOG 35-55).
      2. Utiliser les cellules T spécifiques de l' antigène (par exemple de TCR MOG (2D2) chez la souris). Ajouter 20 ul de microbilles magnétiques CD19 de souris au lieu de microbilles de CD4.
      3. Ajouter l'antigène de choix pour le cel Bls (par exemple, MOG 35-55 à 20 pg / ml), bien mélanger et de graines 5 x 10 4 cellules dans 100 ul de B milieu de culture cellulaire par 96 à fond rond-bien.
      4. Ajouter 1 x 10 5 cellules T dans 100 pi de T milieu de culture cellulaire par 96 à fond rond-bien, tel que décrit dans le protocole pour l' isolement des cellules T.

4. Configuration et exécution TEER Mesure

  1. Placer le module 24 puits de l'instrument TEER sous la hotte à flux laminaire. Retirez les couvercles et placer les inserts avec MBMECs dans l'instrument en utilisant une pince.
  2. Pipeter 810 ul de milieu frais dans le compartiment inférieur du puits de modules: l'ajouter soigneusement entre l'insert et la paroi du module ainsi.
  3. Fermez les couvercles et placer l'instrument dans l'incubateur. Connecter l'appareil à son ordinateur; tourner sur le contrôleur de l'instrument et ouvrir le logiciel.
  4. Sélectionnez 'nouvelle mesure "dans la fenêtre pop-up. Check 'show TEER' et boîtes 'show Ccl'; puis appuyez sur «start». Après avoir terminé la première mesure, sélectionnez "vérifier tous les puits» dans l'onglet «résultats pour voir toutes les valeurs TEER et Ccl.
  5. Enregistrez le fichier: Fichier> Enregistrer sous> 'le nom de votre fichier'.
    NOTE: Comme TEER et Ccl sont continuellement mesurés de façon automatisée, de surveiller leurs valeurs sur une période de trois à cinq jours. Changer le milieu soit pas nécessaire, à moins que la viabilité des cellules est sous-optimale, telle que visualisée par l'absence d'augmentation de la TEER.
  6. Choisissez le point de co-culture avec des cellules T MBMECs quand Ccl est stable et inférieure à 1 pF / cm 2 et TEER a atteint son niveau maximum de temps.
  7. Inspectez soigneusement les valeurs absolues TEER et Ccl et excluent les puits dans lesquels MBMECs ont pas développé suffisamment confluentes monocouches en décochant ces puits.
  8. Groupe le reste des puits: un clic droit sur un puits et sélectionnez 'ajouter ainsi à nouveau puits moyen ». Name dans la fenêtre pop-up; faire la même chose pour tous les puits individuels pour être regroupés.
  9. Vérifiez tous les puits moyens pour confirmer que tous ont les mêmes conditions initiales avant la co-culture. Si certains ont significativement différentes valeurs absolues TEER ou TEER de ski, ou les erreurs types sont trop grandes, refaire le groupement.
    NOTE: Le regroupement optimal des puits fournit une variation minimale des valeurs TEER, à la fois au sein et entre les groupes expérimentaux.
  10. Dans l'onglet «expérience», appuyez sur 'pause', débranchez l'appareil et de le sortir de l'incubateur. Retirez les couvercles sous la hotte à flux laminaire.
  11. Préparer pré-activé et / ou les cellules T naïves, avec ou sans cytokines spécifiques, des anticorps ou d'autres substances, comme souhaité: Par exemple: mélanger purifié NA / LE rat anticorps anti-souris IFN-γ (clone XGM1.2) avec prêt T cellules à 20 ug / ml par puits de l'instrument TEER.
    NOTE: Si des substances telles que l'inhibiteur de granzyme B sont utilisés, ils sontdded à la culture des cellules T au début de la stimulation des cellules T: par exemple, granzyme B Inhibiteur II (Calbiochem) est mélangé avec des cellules T isolées à une concentration finale de 10 uM dans du DMSO. Voir matériaux et équipements pour plus de détails.
  12. Retirez une partie du milieu de l'insert (le compartiment de puits supérieur): par exemple, la pipette soigneusement 150 pi ( en retirant tout le milieu doit être évitée car elle pourrait perturber la monocouche MBMEC).
  13. Ajouter lymphocytes T à MBMECs par pipetage soigneusement 150 pi de milieu contenant 2 x 10 5 cellules / insert.
    NOTE: Lors de la récolte des cellules T pré-activé, compter que le dynamitage, les cellules Trypan Blue-libres.
  14. Fermez les couvercles et placer l'instrument à l'incubateur. Rebranchez l'instrument et appuyez sur "de reprendre la mesure. Après 24 heures, appuyez sur «stop» dans l'onglet «expérience» et enregistrez le fichier (Fichier> Enregistrer).

5. Les données d'exportation et d'analyse statistique

  1. Exporter les résultats en choisissant Fichier> Exporter.
  2. Dans l'onglet "Paramètres" de la fenêtre pop-up, sélectionnez ".dot" dans l'option "séparateur décimal" et "tabulator" dans l'option "champ delimiter".
  3. Dans l'onglet "Résultats de l'exportation", le nom du fichier, vérifier tous les puits à exporter, et cochez la case "TEER" et des boîtes "Ccl" dans l'option "choisir des données".
  4. Appuyez sur "Données à l'exportation," ouvrir le fichier exporté, et copier les données vers un tableur.
  5. Normaliser les données exportées (triées par chaque répétition, avec TEER et Ccl valeurs données pour chaque essai (mesure)): les valeurs Set TEER et Ccl du dernier point de temps avant la co-culture à 100% et modifier en conséquence les valeurs pour tous les autres courses, par rapport à la course '100%'.
  6. Copier des données normalisées à un logiciel de choix pour générer un graphique, en utilisant des puits individuels et l'affichage de l'erreur-type de la moyenne pour chaque groupe de traitement.
  7. PDeux voies a performance ANOVA test statistique avec une correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples, en utilisant le logiciel statistique de choix.

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Résultats

La figure 1 donne un aperçu général du modèle BBB in vitro utilisé pour étudier l'interaction entre les cellules T et les cellules endothéliales. L'expérience consiste en trois étapes principales. La première étape est l'isolement des MBMECs primaires provenant corticales du cerveau, et leur culture pendant cinq jours. Lorsqu'ils atteignent la confluence de la plaque de culture cellulaire, MBMECs sont trypsinisées et réensemencées sur des inserts...

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Discussion

Plusieurs étapes du protocole décrit sont essentiels pour une expérience réussie. Pendant l'isolement de MBMEC initial et de la culture, il est crucial que le travail est effectué dans des conditions stériles, autant que possible, afin d'éviter la contamination de la culture cellulaire avec des spores fongiques ou bactéries. Afin d'obtenir une culture pure de CEs, il est recommandé d'utiliser un milieu contenant Puromycin pour les trois premiers jours, ce qui permet la survie des CEs, mais pas les autres...

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Déclarations de divulgation

I. Kouzmanov, A. M. Herrmann, S. G. Meuth, H. Wiendl et L. Klotz n’ont rien à divulguer. H.-J. Galla est conseiller scientifique de nanoAnalytics GmbH, le fabricant du moniteur cellulaire automatisé.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Annika Engbers et Frank Kurth pour leur excellent soutien technique et Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) pour des discussions utiles concernant les mesures de TEER. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projet A03 HW et LK, CRC TR128, projets A08; Z1 et B01 à LK et HW, et le Centre interdisciplinaire pour la recherche clinique (Faculté de médecine de Münster) numéro de subvention Kl2 / 2015/14 à LK.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
cellZscopenanoAnalytics GmbH www.nanoanalytics.comcomprenant : module de cellule 24 puits, contrôleur, PC avec logiciel cellZscope v2.2.2  ;
UltracentrifugeuseThermo Scientificwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+ ; rotor F21S-8x50y ; pour cytomètre de flux d’isolement MBMEC
Beckman Coulterwww.beckmancoulter.compour l’analyse de la transmigration des lymphocytes T
Logiciel FlowJo7.6.5 TreeStarwww.flowjo.compour l’analyse de la transmigration des lymphocytes T
Tubes à centrifuger Oak Ridge, PCThermo Fisher Scientific3118-005050 ml ; pour l’isolation MBMEC
Inserts de membrane Transwell - taille des pores 0,4 & micro ; mCorning3470pour la mesure TEER comme lecture principale
Inserts de membrane Transwell - taille de pores 3 & micro ; mCorning3472pour la mesure TEER comme contrôle qualité avant l’essai de transmigration des cellules T
Plaque de culture cellulaire 24 puitsGreiner650 180à fond plat ; pour la culture MBMEC
Plaque de culture cellulaire à 96 puitsCostar3526à fond rond ; pour la culture de cellules immunitaires
Séparateur QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976pour l’isolement des cellules T et des cellules B ; supports Colonnes MACS LS
OctoSéparateur MACSMiltenyi Biotec130-042-109pour l’isolement des cellules dendritiques ; supporte les colonnes MACS MS
Chambre de comptage NeubauerMarienfeldMF-0640010pour le comptage de cellules
Passoire de cellules, 70 & micro ; mCorning352350pour l’isolement des cellules immunitaires
Passoire à cellules, 40 & micro ; mCorning352340pour l’isolement des cellules immunitaires
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303pour l’isolement des cellules immunitaires
Colonnes de séparation MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401pour l’isolement des cellules T et des cellules B
Colonnes de séparation MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201pour l’isolement des cellules dendritiques
MicrobillesCD4 de sourisMiltenyi Biotec130-049-201pour l’isolement des cellules CD4+
Souris MicroBeads CD19Miltenyi Biotec130-052-201pour l’isolement des cellules B
MicroBeadsde souris Miltenyi Biotec130-052-001pour l’isolement des cellules dendritiques
Collagène de type IV du placenta humainSigmaC5533pour la solution d’enrobage MBMEC
Fibronectine de plasma bovinSigmaF1141-5MGpour solution d’enrobage MBMEC
Collagenase 2 (CSL2)WorthingtonLS004176pour l’isolement MBMEC
Collagenase/Dispase (C/D)Roche11097113001pour l’isolement
MBMEC DNase ISigmaDN25pour l’isolement MBMEC
Sérum de veau fœtal (FBS)SigmaF7524pour l’isolement MBMEC
Albumine sérique bovine (BSA)Amresco0332-100Gpour l’isolement MBMEC
PercollSigmaP1644-1Lpour l’isolement
MBMEC DMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021pour l’isolement MBMEC et milieu de culture MBMEC
Pénicilline/StreptomycineSigmaP4333pour l’isolement MBMEC et milieu de culture MBMEC
Tamponné phosphate Saline (PBS)SigmaD8537pour MBMEC et isolement des cellules immunitaires
HéparineSigmaH3393pour milieu de culture MBMEC
Facteur de croissance des fibroblastes de base humain (bFGF)PeproTech100-18Bpour milieu de culture MBMEC
PuromycinSigmaP8833pour milieu de culture MBMEC ; uniquement pendant les trois premiers jours
0,05 % Trypsine-EDTAGibco25300-054pour la récolte de MBMECs
Collagénase de type IASigmaC9891pour l’isolement des cellules dendritiques
Solution de Trypan Blue, 0,4Thermo Fisher Scientific15250061pour le comptage des cellules
EDTASigmaE5134pour l’isolement des cellules immunitaires
IMDM + 1 % L-GlutaminGibco21980-032pour milieu de culture de cellules T
X-VIVO 15LonzaBE04-418Qprotéger de la lumière ; pour milieu de culture de cellules B
&bêta ;-mercaptoéthanolGibco31350-010pour milieu de culture de cellules B
L-Glutamine (100x Glutamax)Gibco35050-061pour milieu de culture de cellules B
souris MOG35&mdash ; 55 peptideBiotrendBP0328pour l’activation des lymphocytes T spécifiques de l’antigène
Clone 100302 CD3 Ab purifié anti-sourisBioLegend145-2C11 ; pour l’activation des lymphocytes T polyclonaux
Clone NA/LE anti-souris CD28 AbBD Pharmingen553294clone 37.51 ; pour l’activation des lymphocytes T polyclonaux
Souris recombinantes IFN-&gamma ;PeproTech315-05pour les essais de transmigration des lymphocytes T
: TNF-&alpha murin recombinant ;PeproTech315-01Apour les tests de transmigration des lymphocytes T
NA/LE purifié anti-souris IFN-&gamma ; anticorpsBD Biosciences554408clone XMG1.2 ; concentration finale recommandée : 20 & micro ; g/ml
Inhibiteur de Granzyme B IICalbiochem368055concentration finale recommandée : 10 & micro ;
Anticorps anti-souris CD4 M PEBiolegend116005clone RM4-4 ; pour l’analyse de la transmigration des lymphocytes T
 %

Références

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