Isolement et activation de murins Lymphocytes

Jun Feng Lim; Heidi Berger; I-hsin Su

doi:10.3791/54596

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Article de méthode

Isolement et activation de murins Lymphocytes

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DOI :

10.3791/54596

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30 octobre 2016

Jun Feng Lim¹ , Heidi Berger¹ , I-hsin Su¹

¹School of Biological Sciences, College of Science, Nanyang Technological University

Dans cet article

Résumé

Les lymphocytes sont les principaux acteurs des réponses immunitaires adaptatives. Ici, nous présentons un protocole de purification des lymphocytes pour déterminer les fonctions physiologiques des molécules souhaitées dans l’activation des lymphocytes in vitro et in vivo. Les procédures expérimentales décrites conviennent pour comparer les capacités fonctionnelles entre les lymphocytes témoins et les lymphocytes génétiquement modifiés.

Résumé

Classe

cellules B et T, avec leurs répertoires antigènes-récepteurs extrêmement divers, ont la capacité de développer des réponses immunitaires spécifiques contre presque tous les agents pathogènes^{envahisseurs 1,2}. Naturellement, de telles capacités complexes sont contrôlées par un grand nombre de molécules impliquées dans divers processus cellulaires pour assurer^{des réponses} immunitaires opportunes et régulées dans l’espace3. Ici, nous décrivons des procédures expérimentales qui permettent d’isoler rapidement des lymphocytes murins hautement purifiés à l’aide de la technologie de tri cellulaire magnétique. Les lymphocytes purifiés qui en résultent peuvent ensuite être soumis à divers tests fonctionnels in vitro ou in vivo, tels que la détermination de la capacité de signalisation des lymphocytes lors de la stimulation par immunoblotting⁴ et l’étude des capacités prolifératives par incorporation de ³H-thymidine ou marquage^5-7 de l’ester succinimidylique de diacétate de carboxyfluorescéine (CFSE). En plus de comparer les capacités fonctionnelles des lymphocytes de contrôle et des lymphocytes génétiquement modifiés, nous pouvons également déterminer la capacité de stimulation des lymphocytes T des cellules présentatrices d’antigènes (APC) in vivo, comme le montrent nos résultats représentatifs en utilisant des cellules T OT-I transplantées marquées au CFSE.

Introduction

Les lymphocytes matures existent généralement à l’état de repos s’il n’y a pas d’infection ou d’inflammation préexistante chez l’individu. Par conséquent, il est important de conserver l’état naïf des lymphocytes pendant le processus d’isolement avant d’effectuer des tests fonctionnels in vitro ou in vivo. La clé pour garantir des résultats cohérents et reproductibles est de limiter toute manipulation inutile des cellules.

Le tri magnétique des cellules utilise des anticorps et des microbilles pour marquer les cellules afin d’enrichir la population cellulaire d’intérêt. Avec cette approche, il existe deux stratégies de pu....