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Article de méthode

Utilisation de l'électrophorèse capillaire à Quantifier acides organiques à partir de tissus végétaux: Un cas de test d'examen

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DOI :

10.3791/54611

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12 novembre 2016

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1Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University, OARDC, 2Department of Plant Pathology, The Ohio State University, OARDC, 3Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University, OARDC, 4OARDC Metabolite Analysis Cluster, The Ohio State University, OARDC

Dans cet article

Résumé

Cet article présente une méthode pour la détection et la quantification des acides organiques à partir de matériel végétal par électrophorèse libre capillaire zonale. Un exemple de l'application potentielle de cette méthode, la détermination des effets d'une fermentation secondaire sur les niveaux d'acides organiques dans les graines de café est fourni.

Résumé

Les acides carboxyliques sont des acides organiques contenant un ou plusieurs terminaux carboxyle (COOH), les groupes fonctionnels. les acides carboxyliques à chaîne courte (SCCAs; acides carboxyliques contenant trois à six atomes de carbone), tels que le malate et de citrate, sont essentiels au bon fonctionnement de nombreux systèmes biologiques, où ils fonctionnent dans la respiration cellulaire et peuvent servir d'indicateurs de la santé des cellules. Dans les aliments, la teneur en acide organique peut avoir un impact significatif sur le goût, avec une augmentation des niveaux SCCA résultant dans un goût «acide» aigre ou. Pour cette raison, des procédés pour l'analyse rapide des taux d'acides organiques présentent un intérêt particulier pour les industries alimentaires et des boissons. Malheureusement, la plupart des méthodes utilisées pour la quantification de SCCA dépendent des protocoles de temps et nécessite la dérivation d'échantillons avec des réactifs dangereux, suivis par Chromatographie coûteux et / ou des analyses de spectrométrie de masse. Cette méthode détaille une autre méthode pour la détection et la quantification des orgacides aniques de matériel végétal et des échantillons d'aliments à l'aide de libre électrophorèse capillaire de zone (CZE), parfois simplement appelés électrophorèse capillaire (CE). CZE fournit un procédé rentable pour la mesure SCCAs avec une limite inférieure de détection (0,005 mg / ml). Cet article détaille l'extraction et la quantification des SCCAs à partir d'échantillons de plantes. Bien que la méthode fournie se concentre sur la mesure de SCCAs des grains de café, le procédé proposé peut être appliqué à de multiples produits alimentaires à base de plantes.

Introduction

Les acides carboxyliques sont des composés organiques contenant un ou plusieurs groupes fonctionnels carboxyles terminaux, chacun attaché à un groupe R contenant un ou plusieurs carbones (R-C[O]OH). Les acides carboxyliques à chaîne courte et de faible poids moléculaire (acides carboxyliques à chaîne courte, SCCA) contenant entre un et six carbones, sont des composants essentiels de la respiration cellulaire et fonctionnent dans plusieurs voies biochimiques nécessaires à la croissance et au développement cellulaires. Les SCCA jouent un rôle essentiel dans le métabolisme cellulaire1, la signalisation cellulaire2 et les réponses de l’organisme à l’environnement (telles que l’antibiose3). Pour cette raison, les SCCA peuvent servir d’indicateurs utiles des perturbations du métabolisme cellulaire, des réponses au stress des plantes4,5 et de la qualité des fruits6,7. À ce jour, les SCCA ont été quantifiées principalement à l’aide de techniques chromatographiques telles que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ou la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie de masse (GC-MS). Bien que ces méthodes soient capables d’atteindre des limites de détection très basses, elles peuvent être coûteuses, nécessiter la dérivation des SCCA cibles à l’aide de réactifs caustiques et/ou toxiques, et inclure de longs cycles de séparation sur le GC ou la HPLC. Pour cette raison, l’intérêt pour l’utilisation de l’électrophorèse capillaire zonale libre (CZE), qui ne nécessite pas de dérivation d’échantillon, pour quantifier les acides organiques n’a cessé d’augmenter8.

L’électrophorèse capillaire zonale libre (CZE) est une méthode de séparation chromatographique qui, en raison de son grand nombre de plaques théoriques, de sa vitesse et de sa relative facilité d’utilisation, remplace de plus en plus la GC-MS et la chromatographie liquide à haute pression en tant que méthode analytique pour la quantification (en particulier à des fins de contrôle de la qualité) des anions, des cations, des acides aminés, des glucides et des acides carboxyliques à chaîne courte (SCCA)8,9,10. La séparation des petites molécules, y compris les SCCA, basée sur le CZE, repose sur deux principes principaux : le mouvement électrophorétique des ions chargés dans un champ électrique établi à travers le tampon remplissant le capillaire ; et le mouvement électro-osmotique de l’ensemble du système tampon d’un bout à l’autre du capillaire, généralement vers l’électrode négative. Dans ce système, les petites molécules se déplacent vers l’électrode négative à des vitesses variables, la vitesse de chaque molécule étant déterminée par le rapport entre la charge nette de la molécule et la masse moléculaire. Comme le mouvement de chaque molécule individuelle dans ce système dépend de l’état de charge de la molécule et du taux global de flux électro-osmotique (qui est lui-même basé sur la teneur en ions du tampon utilisé pour remplir le capillaire), le pH du tampon et la composition ionique ont un impact important sur le degré de séparation efficace des molécules à l’aide de CZE. Pour cette raison, les SCCA, avec leurs rapports charge/masse relativement élevés, sont des cibles idéales pour la séparation basée sur le CZE. Les métabolites séparés à l’aide de CZE peuvent être détectés à l’aide de diverses méthodes, notamment l’absorbance UV, l’absorbance spectrale (qui est généralement réalisée à l’aide d’un réseau de photodiodes [PDA]) et/ou la spectroscopie de masse (CE-MS ou CE-MS/MS)8. La diversité des méthodes de séparation et de détection fournies par CZE en fait une technique extrêmement flexible et adaptable. Pour cette raison, le CZE est de plus en plus utilisé comme méthode d’analyse standard dans les domaines de la sécurité et de la qualité des aliments11,12, de la recherche pharmaceutique13 et de la surveillance de l’environnement13,14.

L’électrophorèse capillaire est utilisée pour détecter et quantifier les acides carboxyliques à chaîne courte depuis près de deux décennies13. Le pouvoir de résolution (en particulier pour les petites molécules chargées), le temps d’exécution court et le faible coût par échantillon des analyses CZE font de CZE une technique idéale pour la séparation et la quantification des SCCA13. Cette méthode présente un protocole permettant d’utiliser le CZE pour mesurer la concentration d’acides organiques dans les tissus végétaux. Des exemples de données ont été générés grâce à la mise en œuvre réussie de ce protocole pour mesurer la variation des niveaux d’acide organique dans les graines de café après un traitement de fermentation secondaire. Le protocole détaille les étapes critiques et les erreurs courantes de la séparation des ACCC basée sur le CZE, et discute des moyens par lesquels ce protocole peut être appliqué avec succès pour quantifier les ACCC dans d’autres tissus végétaux.

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Protocole

Préparation 1. Echantillon

  1. Assembler des échantillons pour chaîne courte acide carboxylique (SCCA) extraction. Préparer 1,0 g de graines de café à la fois pour garantir que suffisamment échantillon restera après le traitement.
    1. Si les échantillons ont été congelés avant le processus de broyage, maintenir le tissu congelé tout au long du traitement pour éviter le gel / dégel des dommages et de l'oxydation de l'échantillon. Retirer l'échantillon du congélateur ou du sous-zéro de stockage qu'en cas de besoin pour le broyage.
    2. gel Flash échantillons frais dans l'azote liquide immédiatement avant l'échantillon de broyage. Pour réduire au minimum la manipulation des échantillons, des échantillons de flash de gel en les plaçant dans un mortier pré-rempli avec de l'azote liquide.
    3. Analyser les échantillons liquides immédiatement après génération, ou le gel flash dans de l'azote liquide et conserver à -20 ° C ou -80 ° C jusqu'à l'analyse. Avant l'analyse, prélever des échantillons congelés du stockage et laisser décongeler. Pour les échantillons liquides passez à l'étape (3.5) pour le traitement.
  2. Porter approéquipement de protection individuelle échéant (y compris des lunettes de sécurité, des gants et une blouse de laboratoire) avant de travailler avec de l'azote liquide.
  3. Des échantillons de tissus Triple-grind à une poudre fine et uniforme (ie, de la taille de particule uniforme) dans de l' azote liquide en utilisant un mortier et un pilon en céramique.
    NOTE: Parvenir une taille de particule uniforme est essentielle pour maximiser la SCCA efficacité de l'extraction.
    1. Pré-refroidir le mortier et le pilon avec de l'azote liquide avant l'addition de l'échantillon. Maintenir le mortier rempli avec un petit volume d'azote liquide que l'échantillon est ajouté.
    2. En utilisant une louche, ajouter suffisamment d'azote liquide au mortier pour immerger complètement l'échantillon.
    3. Ajouter des échantillons facilement broyés, tels que les feuilles ou le café torréfié, à l'azote liquide et écraser en utilisant un mouvement de broyage circulaire. Commencer à broyer des échantillons lorsque le niveau d'azote liquide a diminué au point où il couvre à peine les échantillons.
    4. Ajouter difficile à broyer les échantillons, une telles graines de café vert, à l'azote liquide et leur permettre de geler pendant 10-30 secondes (ou jusqu'à ce que l'azote liquide cesse de bouillir vigoureusement) avant broyage. Casser le tissu en fragments plus petits en utilisant un mouvement de broyage vertical, et le tissu, puis complète de broyage en utilisant un mouvement de broyage circulaire.
    5. Répéter les étapes 1.3.2-1.3.4 deux fois de plus, alors que les échantillons sont broyés au total trois fois. En règle générale, trois cycles successifs de broyage réduisent les échantillons pour obtenir une poudre ayant une consistance farineuse.
    6. Si une consistance farineuse ne soit pas atteinte, répéter les étapes 1.3.2-1.3.4 jusqu'à ce que les échantillons sont réduits en une poudre d'une taille uniforme de petites particules (rendement d'extraction est inversement proportionnelle à la taille des particules).
  4. Transférer la poudre dans des flacons de verre ou 1,5 ml microtubes. Initier le traitement en aval immédiatement après broyage (recommandé), ou conserver les échantillons à -80 ° C jusqu'à ce que les échantillons sont prêts pour l'extraction.
    1. Si les échantillons doivent être stockés avantanalyse, diviser l'échantillon en aliquotes de 500 mg (ou 500 aliquotes pour échantillons liquides) et répartis entre plusieurs tubes pour le stockage. Évitez de soumettre des échantillons à des cycles répétés de gel / dégel, car ceux-ci peuvent modifier la composition de l'échantillon et un impact négatif sur les futures mesures d'échantillons.

2. Préparation biologique standard Acid

  1. Assembler des normes authentiques pour les SCCAs d'intérêt. Ceux-ci seront utilisés pour créer des solutions standards externes et internes pour une utilisation dans la détermination des concentrations SCCA. Pour les échantillons de café comprennent l'acide citrique, l'acide malique, l'acide acétique, l'acide lactique sous forme d'acides d'intérêt et de l'acide adipique comme étalon interne.
    1. Assurez-vous que la norme interne sélectionnée ne se trouve pas naturellement dans l'échantillon, et que la norme n'a pas co-éluent avec d'autres pics dans le profil de l'échantillon.
    2. Exécuter des courbes standard pour chaque SCCA d'intérêt, et de déterminer la plage de réponse linéaire pour chaque SCCA (voir la section 4 pour l'exécution instructions). Assurez-vous d'exécuter des courbes standard pour chaque SCCA à mesurer dans l'échantillon.
      REMARQUE: Les courbes standard peuvent être exécutés soit dans le tampon ou l'arrière-plan de l'échantillon à doser. Dans le second cas ( "addition standard"), les valeurs de la surface du pic de chaque point de courbe standard sera déterminé en soustrayant de distance l'arrière-plan de l'échantillon.
    3. Pré-label tous les tubes et la verrerie nécessaires avec le nom SCCA acide, la concentration et la date de l'essai.
  2. Préparer des solutions mères pour chaque norme à une concentration connue (10 mg / ml) en utilisant un ballon volumétrique pour assurer la précision lors de la préparation standard.
    1. Dissoudre les normes SCCA solides (acide citrique et d'acide malique) dans l'eau ultrapure (18,2 MQ) pour obtenir la concentration souhaitée pour la solution de stock.
      1. Créer 10 mg / ml solution mère en ajoutant 100 mg de standard à une 10 ml fiole jaugée. Remplissez la fiole jaugée à la ligne de 10 ml avec de l'eau ultrapure à dissolve l'acide.
      2. Créer une concentration plus faible de la norme acide ou chauffer doucement les flacons à conduire dissolvent difficiles à SCCA normes, comme l'acide adipique, en solution.
    2. Diluer étalons d'acides en phase liquide (acide acétique et acide lactique) dans de l'eau ultra-pure pour obtenir la concentration désirée.
      1. Pré-remplir une fiole jaugée avec 5 ml d'eau ultrapure. Ajouter suffisamment d'acide pour préparer une solution à 10 mg / ml (calculée en utilisant la densité de l'acide fournie par le fabricant) dans le ballon, puis ajouter suffisamment d'eau pour porter le volume final de la solution à 10 ml.
  3. Transférer chaque solution mère dans un tube en verre de 15 ml propre, avec un polytétrafluoroéthylène (PTFE) doublée bouchon, et sceller avec un film de paraffine plastique. Les solutions mères peuvent être stockés dans des tubes scellés à 4 ° C pendant 1 semaine.
    1. Veiller à ce que les normes SCCA n'ont pas précipité hors de la solution avant d'utiliser si des solutions mères ont été réfrigérés après préparation. Entraînement précipite en solution par chauffage doux.
  4. Préparer la solution d'extraction SCCA. Inclure l'étalon interne à une concentration suffisante pour la détection dans des échantillons (0,05 mg / ml). Préparer assez de solution pour extraire tous les échantillons.
    1. Préparer 50 ml de solution d'extraction SCCA en diluant la solution mère étalon interne à 0,05 mg / ml dans de l'eau ultrapure. Ajouter 250 pi de la solution mère étalon interne (10 mg / ml) à 49,75 ml d'eau.
    2. Si l'extrait doit être dilué, ajuster la concentration de l'étalon interne dans la solution d'extraction de telle sorte que la concentration finale tombera dans les limites de quantification (donnant un détectable, mais pas trop saturé, pic, voir 5.2.2 ci-dessous) de la système CE après dilution (0,05 mg / ml).
    3. Préparer la solution d'extraction douce pour chaque série d'extractions (ie, pour chaque série expérimentale).
  5. Préparer des échantillons de courbe standards(Une série de dilutions appropriées) pour SCCAs d'intérêt, en utilisant un minimum d'au moins 5 points. Les concentrations de courbe standards utilisés devront être dans la plage de réponse linéaire pour une SCCA donnée et portent sur des concentrations SCCA attendues dans les échantillons.
    1. Inclure la norme interne sélectionnée dans les solutions de courbe standard pour permettre la quantification de l'étalon interne dans les échantillons. La norme interne sera utilisée pour aider à l'identification de pointe et en calculant l'efficacité d'extraction (section 6).
    2. Diluer chaque SCCA aux concentrations déterminées ci-dessus (0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 mg / ml; voir ci-dessus, 2.4.2) dans de nouveaux tubes de microcentrifugation (un pour chaque concentration / point de la courbe standard) en utilisant de l'eau ultrapure. Préparer 1 ml de solution pour chaque point de concentration de la courbe standard. Veiller à ce que chaque point de concentration contient les quatre étalons d'acides et l'étalon interne à la concentration correcte.
    3. Préparer de nouveaux points de courbe standard pour chaque ensembled'échantillons à exécuter sur le système d'électrophorèse capillaire. Tenez les échantillons standard courbe SCCA à 4 ºC jusqu'à l'analyse, qui aura lieu après l'extraction de SCCAs des tissus cibles (section 3).

3. Extraction acide organique

  1. tubes d'échantillons pré-étiquette, préparation d'au moins un tube pour chaque échantillon à extraire.
  2. Retirer les échantillons à extraire de stockage et placez-les sur la glace tout en pesant sur la matière pour l'extraction.
  3. Peser 100 mg d'échantillon pour l'extraction SCCA.
    1. Après avoir pesé chaque échantillon, transférer le tissu à un 1,5 ml tube propre. Mesurer une quantité d'échantillon proche de la masse cible que possible pour réduire la variabilité.
    2. Gardez une trace de la masse de chaque échantillon mesuré, que les quantités de SCCAs détectées seront normalisées en utilisant la masse de l'échantillon (voir 6.5.2 ci-dessous).
  4. Après avoir pesé tous les échantillons, ajouter 1 ml de solution d'extraction (le water + mélange étalon interne à l'étape 2.4), à chacun des tubes d'échantillon. Gardez le rapport de la solution d'extraction à la masse de la même dans toutes les extractions de tissu (dans ce cas, 1 ml pour 100 ± 5 mg de tissu). Bien mélanger par vortex pendant 10 sec.
  5. Laisser les échantillons reposer à température ambiante pendant 1 h. Pendant cette heure, mélanger chaque tube toutes les 15 min comme dans l'étape 3.4.
  6. Après 1 h d'extraction, mélanger les échantillons une dernière fois et de transférer des tubes échantillons à une microcentrifugeuse. Centrifuger les échantillons à 4 ° C, 10 000 g pendant 10 minutes pour précipiter la matière solide (parois cellulaires, les particules, etc.).
    1. Lors du traitement d'échantillons liquides, ajoutez la concentration appropriée de l'étalon interne, brièvement et centrifugeuse mélanger. Après centrifugation, le traitement des échantillons de liquide identique à l'extrait à partir d'échantillons solides.
    2. Vérifier le pH des échantillons pour confirmer qu'ils sont compatibles avec la gamme de pH du tampon en cours d'exécution dans le kit de détection (étape 4.6) ou d'un système tampon étant empLoyed. Étant donné que les volumes d'échantillon sont en général assez faible, le pH peut être contrôlé en utilisant du papier pH.
  7. Préparer pour filtrer les échantillons en utilisant des filtres à disques seringue monté (3.8).
    REMARQUE: Prévenir la perte de l'échantillon en veillant à ce que chaque filtre est correctement fixé à une seringue avant de transférer le surnageant. Préparer une seringue équipée d'un filtre à disque pour chaque échantillon à analyser (y compris les échantillons de la courbe standard).
  8. Après centrifugation des échantillons et la préparation des filtres de seringue, transvaser le surnageant de chaque échantillon dans une seringue de 3 ml, équipé d'un filtre à seringue de 0,2 um. Utilisez un nouveau filtre et la seringue pour chaque échantillon. Filtrer tous les échantillons, y compris des échantillons standards et de la courbe de contrôle de mémoire tampon, avant l'exécution sur le système CE.
  9. Filtrer l'échantillon directement dans un tube propre. Après filtration, fermer le tube contenant le filtrat et jeter l'appareil seringue / filtre.
  10. Immédiatement placer des échantillons filtrésdans le système de la CE pour la détection SCCA; ou conserver les échantillons à 4 ° C durant la nuit. Si les échantillons doivent être conservés pendant une nuit, sceller les tubes avec un film de paraffine en plastique pour éviter les échanges gazeux et évaporation des échantillons.
    1. Si les échantillons doivent être conservés plus d'un jour après le filtrage, des extraits de gel flash dans de l'azote liquide ou gel à -20 ºC. Après décongélation, cependant, veiller à ce que chaque échantillon est examiné pour la formation précipité et filtrer si nécessaire (comme dans l'étape 3.6).

4. Configuration de la détection Run SCCA

  1. Consultez le mode d'emploi de la CE pour les détails spécifiques au logiciel de programmation et de contrôle.
  2. Préparer l'électrophorèse capillaire (CE) flacons d'échantillons pour la détection SCCA. Veiller à flacons sont correctement étiquetés, propre et exempt de défauts.
  3. Laver et sécher les bouchons des flacons CE avant utilisation.
    1. Laver bouchons en les immergeant dans l'eau ultrapure et leur permettant de tremper toute la nuit. Après avoir trempé les bouchons, jeter le trempering solution et rincer les bouchons deux fois avec de l'eau ultrapure.
    2. Transfert rincée bouchons à une surface de séchage propre doublée avec un tissu non pelucheux et leur permettre de sécher à l'air. Veiller à bouchons sont complètement secs avant utilisation pour éviter les défaillances de pression.
  4. Transférer 1 ml d'échantillon à chaque flacon de la CE, en veillant à éviter les éclaboussures accidentellement l'échantillon dans le col du flacon. Après le transfert, placer un bouchon CE sur chaque flacon.
    1. Si une dilution est nécessaire de diluer les échantillons de graines de café ou de 1:10 à 1: 100 directement dans le flacon CE utilisant de l'eau ultrapure. Pour des dilutions supérieures à 1: 100, créer une dilution intermédiaire pour éviter les erreurs de pipetage.
  5. Préparer un flacon pour chaque point de courbe standard en transférant des solutions de courbe standard (1,0 ml) de l'étape 2.5 dans des flacons de CE. Cap chaque tube après le transfert.
  6. Préparer une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) 0,1 M par addition de 0,04 g de NaOH dans un bêcher contenant 90 ml d'eau ultra-pure et laisser les pastilles to dissoudre. Transférer la solution 0,1 M de NaOH à une fiole jaugée de 100 et de porter le volume total à 100 ml.
  7. Ajouter 1 ml de solution 0,1 M NaOH à un flacon de CE propre et bouchon.
  8. Préparer des flacons de tampons CE pour chaque lot d'échantillons à être exécuté sur le système de la CE. Kits de séparation sont disponibles ou personnalisés tampons peuvent être utilisés 13.
    1. Préparer 1 flacon avec 1 ml de solution de départ de la mémoire tampon et le bouchon.
    2. Préparer trois flacons avec 1 ml chacun exécutant une solution tampon et le bouchon. Remplacer le tampon en cours d'exécution avant chaque lot d'échantillons et des points de courbe standard, ou après 35 échantillons, selon la première éventualité.
    3. Remplissez trois flacons supplémentaires avec 1 ml d'eau ultrapure et boucher chaque flacon.
    4. Préparer 1 vide "déchets" flacon avec bouchon.
  9. Après avoir préparé les flacons décrites à l'étape 4.8, charger les flacons contenant les tampons et de l'eau, ainsi que les flacons de déchets (à partir des étapes 4.8.2-5) dans le bac tampon des systèmes d 'électrophorèse capillairesystème, selon les instructions du fabricant 15. Notez soigneusement la position de chaque flacon pour la programmation auto-échantillonneur.
  10. Charger les flacons contenant les points de la courbe standard et les flacons contenant les échantillons à doser dans le bac d'échantillon d'entrée, comme décrit dans les instructions du fabricant. Notez la position de chaque flacon pour la programmation auto-échantillonneur (voir les étapes 4.11.1 ci-dessous).
  11. Préparer le conditionnement et les méthodes de séparation échantillon (programmes pour ceux - ci sont fournis dans les tableaux 1 et 2, respectivement), et écrire un fichier de séquence d'échantillons selon l' instrument manuel d' utilisation. Utilisez la méthode de séparation détaillée dans le tableau 2: rincer la colonne avec l' initiateur (20 psi) pendant 0,2 min; rincer à l'accélérateur (20 psi) pendant 0,5 min, injecter des échantillons (0,5 psi) sur la colonne pour 0,09 min, des échantillons distincts à 20 kV pendant 12 minutes, rincer avec du NaOH (20 psi) pendant 0,5 min, et enfin rincer à l'eau ( 20 psi) pendant 0,5 min.
    1. Using le logiciel de contrôle de la CE, écrire la séquence d'échantillons en cours d' exécution (ie, le worklist; un fichier de liste détaillant l'ordre dans lequel les échantillons seront analysés, et la méthode à utiliser pour séparer chaque échantillon) en utilisant l'interface de tableur "séquence". Chaque ligne de la feuille de calcul correspond à un exemple d'exécution et de produire un seul fichier de données.
      1. Assurez-vous que lors de l'écriture du fichier de séquence, les échantillons sont identifiés en utilisant la bonne position dans le bac d'échantillonnage. Assurez-vous que chaque fichier de données a un nom unique pour empêcher le logiciel à partir d'écraser les fichiers précédents. CE du programme exécute capillaire de conditionnement comme une séquence distincte avant la course de séquence contenant la méthode de séparation de l'échantillon.
    2. Commencez la séquence d'échantillons de fonctionner avec les solutions de courbe standard, suivie d'échantillons SCCA, et se terminent par une deuxième série de solutions de courbe standard. Cela permettra un calcul du degré de perte de signal se produisant au cours des analyses d'échantillons.

    figure-protocol-1
    Tableau 1: Programme de conditionnement procédé utilisé pour préparer le capillaire pour la séparation à chaîne courte d'acide carboxylique par une électrophorèse capillaire.

    figure-protocol-2
    Tableau 2: Séparation programme de méthode d'analyse des acides carboxyliques à chaîne courte , par l' intermédiaire d' une électrophorèse capillaire.

    5. SCCA Détection Run Exécution et collecte de données

    1. Initier capillaires conditionnement pistes. Attendre pour conditionner le capillaire deux ou trois fois avant que la colonne est prête pour la séparation de l'échantillon. Conditionnement de la colonne doit être effectuée comme décrit dans le tableau 1. En bref, rincer colonne avec NaOH 0,1 M (20 psi) pendant 1 min, rincer à l' eau (20 psi) pour1 min, rincer à l'initiateur (20 psi) pendant 0,5 minutes, rincée à l'accélérateur (20 psi) pendant 0,5 min, un accélérateur séparé à 30 kV pendant 10 minutes, rincer la colonne avec 0,1 M de NaOH (20 psi) pendant 0,5 min, et enfin rincer la colonne avec de l'eau (20 psi) pendant 0,5 min.
      1. Conditionner le capillaire avant chaque cycle de séquence d'échantillons. Réaliser un conditionnement approprié en gardant la tension de séparation est constante tout au long de la course et l'observation d'une ligne de base à plat sur la trace de la matrice de photodiodes.
    2. Après conditionnement, initier la séparation de l' échantillon en ouvrant le menu "contrôle" dans le logiciel et la sélection (ie, en cliquant sur) " l' ordre d' exécution." Surveiller la trace réseau de photodiodes (PDA) pour assurer une bonne séparation.
      1. Observer la première trace et de veiller à ce qu'il présente une ligne de base plate et proprement résolu (résolution de base), les pics d'acide individuels. Plus chargé échantillons montreront une longue queue de pointe, ou traînée de pic, et devront être dilués (figure 1).

    figure-protocol-3
    Figure 1:. Une comparaison des PDA retrace mettant en évidence un échantillon surchargé Comme analyte concentration augmente, la géométrie de pointe individu peut commencer à devenir asymétrique. En (a) de 0,05 mg / ml, de l' acide acétique présente un pic bilatéralement symétrique bien défini. Que la concentration de l' acide acétique augmente à (b) 0,07 mg / ml et (c) 0,10 mg / ml, un pic de queue formes (flèches). Ce pic tailing est une bonne indication que l'échantillon est surchargé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    1. A l'issue de la course de séquence, ouvrez les fichiers de données une à la fois dans le logiciel d'analyse de la CE et d'intégrer les pics.
      1. Intégrer des pics d'échantillons.
        1. Ouvrez le premier fichieret régler automatiquement les étapes d'intégration pour exclure les trois premières minutes de l'essai (où la tension et donc le sens d'écoulement de la colonne, est inversé comme décrit dans le tableau 1). Dans le même menu, définir des critères de sélection de pointe à une largeur de crête minimum de 50 unités et la surface du pic de 100 unités (ou les paramètres par défaut du fabricant) pour fournir un niveau modérément élevé de sélectivité, la séparation des pics d'acide du bruit de fond dans la trace.
      2. Vérifier manuellement les limites de pointe et des lignes de base pour chaque trace de PDA pour assurer l'intégration de pointe correcte. Pics mal intégrés (ie, un pic SSCA légèrement asymétrique qui a été intégré en tant que deux pics séparés par le logiciel automatisé) devront être ré-intégré manuellement.
    2. Après l'intégration, voir le rapport de zone pour cent, puis mettez en surbrillance et copier le rapport de zone pour cent et le coller dans une feuille de calcul distincte. Répétez l'opération pour chaque échantillon pour construire la pleine course pic rapport à chaque rangée représentant un seul pic (ie., chaque pic doit contenir un composé unique si la séparation fonctionne bien).

    Analyse 6. Données

    1. Préparer des données pour l'analyse en utilisant la feuille de calcul construit (5.4). Commencer l'analyse par marquage des acides normes pour chacun des points de la courbe standard, y compris la norme interne.
    2. Calculer un indice de rétention de chaque pic en divisant le temps de rétention de chaque pic dans l'échantillon par le temps de rétention de l'étalon interne dans l'échantillon. Trier les fixées par l'indice de rétention résultant d'identifier les pics d'intérêt dans chaque échantillon de données.
    3. Après avoir identifié le pic pour chaque acide d'intérêt, construire des courbes standards pour chaque acide en utilisant les points de la courbe standard externe.
      1. Générer une courbe standard (concentration) pour chaque norme SCCA en déterminant l'aire de pic pour chaque concentration des normes SCCA, et en traçant la concentration sur le xaxis par rapport à l'aire du pic sur l'axe des ordonnées. Tracer la régression linéaire pour chaque courbe d'étalonnage SCCA et définir l'équation de la pente (y = mx + b).
      2. Veiller à ce que les valeurs de R 2 des régressions linéaires sont 0,90 ou plus que les quantifications sont effectuées le plus exactement dans la gamme linéaire de la courbe standard.
    4. Calculer la concentration d'acide pour un SCCA donné dans un échantillon en utilisant la zone de crête et l'équation de la pente de la droite de régression linéaire de la courbe standard (calculée à la section 6.3.2 ci-dessus). En bref, on divise la zone de pic observée pour un acide donné par la pente de la droite de régression de la courbe standard de cet acide.
      1. Corrigez les valeurs de concentration premières calculées à l'étape 6.4 pour la perte de l'échantillon pendant le traitement à l'aide du standard interne (étape 6.5).
    5. Calculer le facteur de correction pour chaque échantillon en utilisant l'étalon interne.
      1. Diviser la concentration réelle de l'étalon interne (ie, le knoquantité ajoutée au début de l'expérience) , la valeur observée de l'étalon interne dans l'échantillon (WN -à- dire, le montant calculé selon l'équation de la courbe standard pour l'étalon interne de la pente). Multiplier les valeurs de concentration de chacun des premières SCCA dans l'échantillon par ce facteur de correction.
      2. Divisez la norme interne corrigée concentration SCCA par la masse de l'échantillon utilisé pour l'extraction pour corriger toute variation de la masse de l'échantillon. Ce calcul donne la quantité d'analyte par unité de masse d'échantillon (mg SCCA par mg de café moulu dans cet exemple), qui peut ensuite être converti en unités appropriées pour l'étude donnée (mg / mg, mg / g g / g, etc. ).
    6. Après avoir calculé les concentrations SCCA (normalisée soit la masse [pour les échantillons solides ou liquides] ou en volume [pour les échantillons liquides]), utiliser ces valeurs pour l'analyse statistique selon les exigences de la conception et des questions d'intérêt expérimental.

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Résultats

Ce protocole a été utilisé avec succès pour mesurer les effets des traitements de semences sur le contenu SCCA des graines de café vert. Dans cette expérience, les six traitements étaient les suivants : une suspension microbienne saturée de Leuconostoc pseudomesenteroides souche GCP674 dans son milieu de croissance (1), une suspension aqueuse de GCP674 microbes dans l' eau (2), une solution aqueuse d'acide acétique et l' acide lactique (0,15 et 0,4 mg / ml) (3), un M...

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Discussion

Comme toute technique d'analyse, il y a plusieurs facteurs critiques qui peuvent influer de manière significative la qualité et la fiabilité des données générées. Tout d'abord, il est important de traiter les échantillons de manière efficace, avec un minimum de cycles de gel / dégel. congélation et décongélation répétée peuvent compromettre la composition chimique de l'échantillon avant le traitement ou l'analyse. Deuxièmement, il est essentiel d'appliquer les étapes de ce protocole à tous les échant...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à souligner le soutien financier de ce projet par la société J.M. Smucker.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Moarter et pilon en céramiqueCoorstek60310
Beckman Coulter P/ACE MDQ Ce système BeckmanCoulterDivers
flacons d’échantillons en verreFisher Inc.033917D
Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml  ;Fisher Inc.02-681-5
Eau de qualité LC/MSFisher Inc.W6-1Milli-Q eau (18,2 M&Omega ; · ; cm) est également acceptable
Tube en verre de 15 ml / capuchon doublé de téflon  ;Fisher Inc.14-93331A
Parafilm MFisher Inc.13-374-12
Kit de détection CElixirOA pH 5,4  ;MicroSolv06100-5.4
BD Seringues Safety-LokFisher Inc.14-829-32
Filtre à seringue cible de 17 mm, PTFEFisher Inc.
32 carats, V. 8.0 logiciel de contrôleBeckman Coulter285512
flacons d’échantillons d’électrophorèse capillaire (CE)  ;Beckman Coulter144980
bouchons pour flacons CE  ;Beckman Coulter144648
Liquid NitrogenN/AN/A L’azoteliquide est disponible auprès de la plupart des services d’installations
3377154

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Quantification des acides organiquesacides carboxyliques cha ne courteextraction de tissus v g tauxanalyse des graines de caflectrophor se capillaire zone libred tection des SCCAprotocole de pr paration des chantillonsd tection par barrette de photodiodespr paration de la courbe talon
Utilisation de l'électrophorèse capillaire à Quantifier acides organiques à partir de tissus végétaux: Un cas de test d'examen
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