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Article de méthode

Un modèle aigu rétinienne pour l'évaluation sanguin rétinien barrière Breach et potentiels médicaments pour le traitement

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DOI :

10.3791/54619

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13 septembre 2016

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1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

Dans cet article

Résumé

Un faible coût, système facile à utiliser et puissant est mis en place pour évaluer les traitements qui pourraient améliorer la violation du sang barrière rétinienne induite par l'histamine. navire de fuite de sang, l'activation des cellules Müller et la continuité des processus neuronaux sont utilisés pour évaluer la réponse aux dommages et son inversion avec un médicament potentiel, la lipoxine A4.

Résumé

Un système modèle peu coûteux, facile à utiliser et puissant est établi pour évaluer les traitements potentiels qui pourraient améliorer la brèche de la barrière hémato-rétinienne. Il a été démontré qu’un facteur inflammatoire, l’histamine, compromet l’intégrité des vaisseaux dans la rétine en culture par une coloration positive des IgG à l’extérieur des vaisseaux sanguins. Les effets de l’histamine elle-même et ceux des médicaments candidats à des traitements potentiels, tels que la lipoxine A4, sont évalués à l’aide de trois paramètres : la fuite des vaisseaux sanguins via l’immunocoloration IgG, l’activation des cellules de Müller via la coloration GFAP et la modification des dendrites neuronales par coloration pour MAP2. De plus, l’organisation en couches de la rétine permet une analyse détaillée des processus de Müller et des cellules ganglionnaires, tels que les changements de largeur et de continuité. Bien que les données présentées proviennent de la culture rétinienne porcine, le système est applicable à plusieurs espèces. Ainsi, le modèle fournit un outil fiable pour étudier les effets précoces de la compromission de l’intégrité des vaisseaux rétiniens sur différents types de cellules et également pour évaluer les candidats médicaments potentiels pour le traitement.

Introduction

Un nombre croissant de preuves soutient l'existence de la barrière de la rétine de sang (BRB) 1-5 et sa similitude avec la barrière hémato - encéphalique (BHE) 6,7. Compromission de la BHE a été étroitement liée causalement ou en tant que marqueur diagnostique pour les maladies neurodégénératives chroniques telles que la maladie d'Alzheimer (MA) et 8,9 aiguës des conditions telles que le délire 10. idées mécanistes dans ces pathologies et de découvertes pour les cibles potentielles de médicaments sont généralement entravés par l'accessibilité et réseau intrication limitée du cerveau. Des alternatives telles que l' imagerie in vivo 11, le cerveau organotypique culture 12, des cultures de cellules primaires 13,14 et des systèmes de co-culture 15 ont été générés. Cependant, la plupart de ces modèles nécessitent des instruments spéciaux, de longues périodes expérimentales ou plusieurs marqueurs pour identifier les cellules. similitudes structurelles et fonctionnelles entre BBB et BRB, ainsi qu'une corrélation entre l'dysfunctions des deux ont été soutenu 16-19. En outre, un accès plus facile, les types de cellules bien définies et une structure en couches ont permis à la rétine bien caractérisé comme une fenêtre dans le cerveau. Les identités structurales et fonctionnelles de la BHE et BRB restent à comparer en détail. Cependant, pathologies de la rétine, en particulier la violation BRB, ont également été étroitement associée à la progression de diverses maladies, y compris le diabète 18-19 et AD 21,22. Par conséquent, il est intéressant de mettre en place un système de dysfonctionnement BRB non seulement de délimiter le mécanisme, mais aussi pour cribler des médicaments potentiels. Dans ce rapport, un protocole permettant un dysfonctionnement BRB utilisant une culture rétinienne aiguë simple est élaboré et présenté.

Augmentation de la perméabilité BBB et des changements pathologiques AD-like ont été établis dans une culture du cerveau organotypique incubé avec de l' histamine, un médiateur pro-inflammatoire 12. Par conséquent, dans le système présenté, l'histamine a été applié à la culture ex vivo de la rétine à induire un dysfonctionnement BRB. Les rétines de plusieurs espèces, comme Mus musculus et Bos Taurus, ont été testés. En raison de leur disponibilité commerciale et de ressemblance avec les tissus humains, des globes oculaires du porc frais ont été utilisés pour fournir les données rapportées ici. Après incubation avec de l' histamine et / ou d' autres médicaments, les rétines ont été traitées pour l' évaluation par immunocoloration pour plusieurs protéines 12 telles que l' immunoglobuline G (IgG), l' un des principaux composants du sang; protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), un marqueur bien connu pour l'activation gliale; et la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2), une protéine du cytosquelette spécifique des neurones essentiels pour l'assemblage des microtubules. En outre, la structure en couches de la rétine permet une analyse détaillée des processus de cellules de Müller et les cellules ganglionnaires, tels que des changements dans la largeur et la continuité. Ainsi plusieurs paramètres supplémentaires sont disponibles pour évaluer les conséquences de laviolation BRB à un stade précoce et d'évaluer les effets d'inversion des traitements potentiels.

Dans ce protocole, les effets d'inversion potentiels des médicaments dépistés sont évalués à partir de trois perspectives: la fuite des vaisseaux sanguins (BVS), l'activation des cellules gliales et les dommages-réponse des cellules neuronales. Plusieurs méthodes de quantification sont utilisées, par exemple, le niveau d'expression représentée par l'intensité de l'immunocoloration, mesure de la largeur d'un processus et la continuité des processus neuronaux représentés par un filtre d'amélioration. Pour mieux illustrer la méthode et pour aider à interpréter les résultats, lipoxine A4 (LXA4), un composé synthétisé de manière endogène en réponse à une lésion inflammatoire et atténuer la dysfonction endothéliale 23, a été choisie à des fins de démonstration.

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Protocole

Tous les protocoles ont été effectués en conformité avec les politiques du Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels, le cas échéant.

1. Préparation

  1. Préparer le milieu de stabilisation avec 75% de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 25% de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS). Bien mélanger, aliquote et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Préparer le tampon phosphate salin (PBS) et stériliser par autoclavage. Conserver la solution à la température ambiante. Chauffer le PBS à 37 ° C avant l'expérience (5 ml par puits).
  3. Préparer 10%, 20% et 30% de saccharose dans du PBS. Filtrez toutes les solutions individuellement plus de 0,22 um filtres séparés pour la stérilisation. Enregistrer les solutions à 4 ° C.
  4. Préparer la solution d'histamine stock dans du PBS à une concentration de 90 mM. Stériliser la solution par filtration sur un filtre de 0,22 pm. Aliquoter et sauver la solution à -80 ° C. Évitez de multiples cycles de gel et de dégel.
  5. Faire frais paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS avant l'expérience. Placez-le sur la glace.
    Attention: Gardez PFA dans une hotte et porter un équipement de protection approprié.
  6. Décongeler le moyen de stabilisation (20 ml par rétine). Ajouter pénicilline- streptomycine à une concentration finale de 100 U / ml. partie chaude du milieu (15 ml par rétine) à 37 ° C dans l'incubateur avant l'expérience. Laissez le reste du milieu sur la glace.
  7. Placez le HBSS (10 ml par rétine) sur la glace.

2. Retinal organotypiques Culture

  1. Transférer les échantillons dans une hotte de culture tissulaire. Ouvrez l'œilleton en coupant autour de la lentille. Avec un pinceau, retirez délicatement l'humeur vitrée sans tirer sur la rétine. détacher délicatement la rétine à partir du bord de coupe avec une brosse pour exposer le disque optique. Sévère du nerf optique avec un rasoir et de libérer la rétine.
  2. Transférer la rétine dans une boîte de Pétri et rincer soigneusement la rétine une fois en utilisant HBSS froid. Placer l'échantillon dans HBSS sur ice. Disséquer autant rétines comme nécessaire en répétant l'étape 2.1 et cette étape.
  3. Couper en deux la rétine de manière symétrique avec un rasoir. transférer doucement échantillons sur une plaque de 6 puits avec 3 ml de milieu de stabilisation par puits. Permettre équilibration pendant 30 min à 37 ° C dans un incubateur avec l'atmosphère contenant 5% de CO 2.
  4. Préparer les réactifs suivants au cours de l'incubation à l'étape 2.3: Diluer la solution d'histamine des stocks à la concentration désirée (450 uM) dans un milieu chaud. Dissoudre la LXA4 (stocké sous argon) dans le milieu à une concentration finale de 250 ng / ml.
    REMARQUE: Lorsque l'on mesure l'effet de LXA4, une moitié d'une seule rétine est utilisée pour l'histamine seul, tandis que l'autre moitié est utilisée pour l'histamine avec la LXA4.
  5. Aspirer le milieu de stabilisation et ajouter soigneusement le moyen disposé à chaque puits (3 ml par puits). Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 heure dans un incubateur avec l'atmosphère contenant 5% de CO 2.
  6. Rincer leéchantillons une fois dans un endroit chaud, PBS stérile.

3. Préparer les échantillons pour immunocoloration

  1. Aspirer le PBS des plaques. Ajouter 4% de PFA (3 ml par puits) et incuber pendant 15 min à température ambiante.
  2. Aspirer rapidement la PFA. Rincer les échantillons une fois à l'aide de PBS. Transférer les échantillons à 10% de saccharose (5 ml par puits) et incuber pendant 2 à 4 heures à 4 ° C.
  3. Transférer les échantillons à une teneur en saccharose à 30% (5 ml par puits) et on incube pendant une nuit à 4 ° C. Mélanger une partie du milieu de congélation commercial avec deux parties de 20% de saccharose pour rendre le milieu de congélation de travail. Laissez-le à 4 ° C pendant une nuit ou plus jusqu'à ce que l'air des bulles disparaissent.
  4. Transférer les échantillons dans le milieu de congélation de travail et permettre équilibration pendant 5 min à température ambiante. Coupez chaque rétine en rectangles (environ 3 mm par 5 mm).
  5. transférer soigneusement les échantillons dans le milieu de congélation de travail contenu dans un récipient cylindrique (environ 1 cm de rayon x 2 cm de hauteur) devnisé de feuille d'aluminium. Veiller à ce que les tranches de la rétine sont verticales (orientées pour fournir une coupe transversale de la rétine sur sectionnant) et les congeler dans de l'azote liquide. Enregistrer les blocs à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  6. Section chaque bloc sur un cryostat en 14 um tranches épaisses et monter les sections sur des lames de verre. Stocker les diapositives à -80 ° C jusqu'à utilisation.

4. immunocoloration

  1. Laver les sections avec du tampon phosphate 5% de saccharose (SPB, 5% de saccharose dans du PBS, pH 7,4) une fois. Bloquer les sites de liaison non spécifiques par incubation des coupes dans un tampon de blocage (5% SPB avec 10% de sérum de chèvre normal et 0,5% de Triton X-100) pendant 1 h à température ambiante.
  2. Incuber les sections () sur des lames avec l'anticorps primaire approprié (GFAP ou MAP2, dilué à 1: 500 dans un tampon de blocage) pendant 1 h. Aspirer la solution. Laver trois fois dans 5% SPB. Pour la coloration de la IgG endogène, sautez cette étape.
  3. Incuber les sections avec le correspondant de secondeanticorps dary (Cyanine3 / FITC âne conjugué anti-souris / anti-IgG de lapin, dilué à 1: 800 dans le tampon de blocage) pendant 1 h.
  4. Laver les coupes à fond avec 5% SPB trois fois. Préparer les échantillons pour la microscopie par leur montage dans le montage milieu contenant DAPI et couvrant avec des lamelles.
  5. En utilisant un laser confocal, de capturer des images à travers un objectif 20X avec des paramètres identiques , tels que l' intensité du laser, la valeur de gain, le temps de séjour, etc. , entre les groupes. Définissez les longueurs d'onde d'excitation / émission pour le canal bleu (pour détecter DAPI) comme 408/447 nm, pour le canal rouge (pour détecter Cyanine3) comme 561/785 nm et pour le canal vert (pour détecter FITC) comme 488/525 nm .

5. Analyse de l'image

  1. Quantifier pourcentage de vaisseaux sanguins qui fuient selon les critères suivants 12: Inclure seulement les vaisseaux sanguins avec les noyaux des cellules endothéliales dans le plan de coupe dans le compte; envisager une leaky des vaisseaux sanguins si elle montre agradient de immunocoloration entourant le récipient.
  2. Pour déterminer le niveau d'expression, sélectionner des régions d'intérêt et de mesurer la valeur de gris moyenne en utilisant le logiciel d'analyse d'image.
  3. Pour mesurer la largeur du processus, pour choisir une zone de la section où les processus sont distinctes (la couche extérieure nucléaire, ONL, par exemple). Ensuite, choisissez un champ optique où ces processus sont visibles et continue. Réglez la barre d'échelle en fonction du réglage microscopique, tracer une ligne sur le processus et effectuer la mesure.
  4. Pour analyser la continuité du processus, certaines régions d'intérêt, appliquer le filtre appelé variance qui améliore les bords de l'image en remplaçant chaque pixel par sa variance de voisinage, ajuster automatiquement le contraste et la luminosité, compter les lignes et de normaliser le compte par le région.
  5. Calculer significations statistiques en utilisant ' t -test de Student bilatéral. * P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001. Pbeaucoup le résultat en moyenne ± SEM.

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Résultats

Nous présentons, un système de temps efficace et facile à utiliser à faible coût pour évaluer les traitements potentiels qui pourraient protéger contre la violation BRB induite par l'histamine. L' IgG est limitée dans les vaisseaux de la rétine témoin (figure 1A), mais les fuites hors des vaisseaux sanguins lors d'une exposition à l'histamine (figure 1B), ce qui confirme que le modèle est établi avec succès.

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Discussion

Dans ce rapport, nous présentons un puissant modèle rétinien aigu ex vivo de dysfonctionnement BRB en utilisant la rétine porcine. Ce modèle ne nécessite pas d’instruments spéciaux et peut être facilement adapté dans la plupart des environnements de laboratoire. Cependant, pour obtenir un résultat réussi, plusieurs étapes nécessitent une attention particulière. Après avoir obtenu les globes oculaires de la source, ils doivent être conservés à 4 °C ou sur de la glace et traités dès que possible. Lorsque l’effet d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Bringhurst Meats (Berlin, NJ) est reconnue pour son aide sincère en fournissant des globes oculaires aux porcs.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMLife Technologies  ;11965-092
HBSSLife Technologies  ;14170-112
SaccharoseJ.T.Baker4072-05
Histamine  ;SigmaH7125-1G
Pénicilline-Streptomycine  ;Invitrogen
PFAMicroscopie électronique Sciences15710
Milieux de congélation  ;Triangle Biomedical SciencesTFM-5
Sérum de chèvre normal  ;RocklandD104-00-0050
Triton X-100SigmaT8787
Anticorps GFAPMilliporeAB5804
Anticorps MAP2EMD MilliporeMAB3418
FITC Âne conjugué anti-lapinIgG Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-095-152
Cy3 Conjugué Donkey anti-souris IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-165-150
contenant DAPIVector Laboratories, Inc.H-1200
Microscope confocal laserNikonEclipse Ti ImageJ
National Institutes of Health1.45s
Support de montage

Références

  1. Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
  2. Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
  3. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
  4. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
  5. Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
  6. Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782(2013).
  7. Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
  8. Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
  9. Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
  10. Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).
  11. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
  12. Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).
  13. Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).
  14. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
  17. Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
  18. Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
  19. Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).
  20. Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
  21. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
  22. Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055(2010).
  23. Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
  24. Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
  25. Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).

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