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Article de méthode

Techniques de calcul empirique et métagénomique éclairent les mécanismes de fongicides compromis Bee santé

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DOI :

10.3791/54631

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9 octobre 2017

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1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

Dans cet article

Résumé

Les consortiums microbiens dans les ruches de bourdons enrichissent et conserver le pollen pour les larves d’abeilles. Prochaine génération séquençage, ainsi que le laboratoire et les expériences sur le terrain, ce manuscrit décrit les protocoles utilisés pour vérifier l’hypothèse que des résidus de fongicide modifient le microbiome du pollen et la démographie de colonie, conduisant finalement à la colonie perte.

Résumé

Les producteurs utilisent souvent les pulvérisations pendant la floraison pour protéger les cultures contre les maladies, qui expose les abeilles à des résidus de fongicide. Bien que considéré comme « abeille-safe », il y a des preuves grandissantes que des résidus de fongicide dans le pollen sont associés à des déclins d’abeille (pour les espèces d’abeilles de miel et de bourdons). Alors que les mécanismes restent relativement peu connus, les chercheurs ont émis l’hypothèse que symbioses abeille-microbe sont impliqués. Microbes jouent un rôle essentiel dans la conservation et/ou de transformation de pollen, qui sert de nutrition pour les abeilles larvaires. En altérant la communauté microbienne, il est probable que les fongicides perturbent ces services induite par le microbe et ainsi compromettent la santé des abeilles. Ce manuscrit décrit les protocoles utilisés pour étudier les mécanismes indirects par lequel fongicides peuvent être responsables de déclin de la colonie. Expériences de cage exposition des abeilles aux fleurs traitées par des fongicides ont déjà fourni la première preuve que fongicides causent des pertes de colonies profonde dans un natif bourdon (Bombus impatiens). À l’aide de champ les doses de fongicides, une série d’expériences ont été développés afin de fournir une description plus fine de la dynamique des communautés microbiennes de pollen exposés au fongicide. Changements dans la composition structurelle des assemblages fongiques et bactériennes dans le microbiome du pollen sont étudiés par séquençage de prochaine génération et analyse métagénomique. Expériences élaborées dans cet article ont été conçues pour fournir une interprétation mécaniste de l’incidence des fongicides sur le microbiome du pollen-dispositions. En fin de compte, ces résultats devraient faire la lumière sur la voie indirecte, à travers lequel fongicides peuvent être responsables de déclin de la colonie.

Introduction

Géré et espèces d’abeilles sauvages connaissent des baisses généralisées, avec des implications majeures pour les deux systèmes naturels et agricoles1. Malgré les efforts concertés pour comprendre les causes de ce problème, les facteurs à l’origine de miel abeille baisses ne sont pas encore bien compris2,3,4. Pour certaines espèces d’abeilles sauvages, indigènes, la situation est devenue grave5,6. Si les populations d’abeilles ne saurait être maintenues lorsqu’elles se croisent avec l’agriculture industrielle, leurs populations continuent de baisser et les cultures nécessitant des pollinisateurs (35 % de la production mondiale7) durera réduit les récoltes.

Alors que de nombreux facteurs potentiels tels que l’exposition aux pesticides, maladies et habitat perte1,4,8,9,10 ont été impliqués en déclin d’abeille miel, On connaît assez l’effet interactif de ces facteurs de stress sur la santé des abeilles indigènes, au sein ou à proximité des systèmes agricoles. De nombreux efforts de recherche actuels continuent de se concentrer sur les insecticides, (p. ex., néonicotinoïdes11,12), bien que des recherches antérieures indiquent que fongicides peuvent également jouer un rôle dans le déclin de l’abeille en altérant la formation de la mémoire, réception olfactive13, nid reconnaissance14, l’activité enzymatique et fonctions métaboliques15,16,17. Dans le monde, fongicides continuent de s’appliquer aux cultures de floraison pendant la floraison. Des études récentes démontrent que les abeilles ramener couramment des résidus de fongicide à la ruche18, en effet, des études ont montré une forte proportion des ruches testés contenaient des résidus fongicide19,20. Poursuite des travaux a révélé que les résidus fongicide sont associée à des taux élevés de miel abeille la mortalité larvaire21,22,23 et la présence de « pollen enseveli » au sein de colonies, qui bien que non toxique, est dépourvu d’activité microbienne et nutritionnellement compromis24. Malgré le fait que fongicides ont longtemps été considérés comme « abeille-safe », il est désormais établi que l’exposition aux fongicides seul peut causer des pertes sévères colonie dans une espèces de bourdons native, Bombus impatiens25.

Pour établir le lien de causalité entre l’exposition de fongicide et colonie de mortalité, modus operandi de ces produits chimiques doivent être déterminées. Comme en témoigne les sols26, sédiments27et28de milieux aquatiques, en ciblant les champignons, fongicides probables modifient fongique abondance et la diversité au sein de pollen-dispositions, invoquant ainsi une très importante communauté shift qui peut fortement favoriser les bactéries. Sans concurrents fongiques ou antagonistes, certaines bactéries pathogènes peuvent proliférer relativement non coché, facilitant la détérioration des dispositions en matière de pollen. Recherches antérieures a démontré que les microorganismes, en particulier les levures et les champignons, servent de symbiotes nutritionnels pour abeilles29,30,31, protéger contre les parasites et agents pathogènes32 ,33et prévoir la conservation à long terme du pollen magasins. Fongicides, par conséquent, peuvent nuire indirectement abeilles immatures en perturbant la communauté microbienne qui est nécessaire pour fournir ces services, et/ou en augmentant la sensibilité aux agents pathogènes et parasites opportunistes12. Avec l’augmentation des demandes sur la production alimentaire, les cultures dans le monde entier sont à peindre chaque année avec des fongicides pendant la floraison, soulignant la nécessité de comprendre l’ampleur de ces effets induits par le fongicide.

À ce jour, les lacunes de connaissances primaires relatives aux abeilles indigènes microbienne écologie peut être représenté par les questions suivantes : dans quelle mesure le fongicide modifie-t-elle la communauté microbienne au pollen d’abeille-dispositions ? Quels sont les impacts en aval de la consommation de pollen avec une communauté microbienne profondément altérée ? En gardant ces questions pertinentes sur le plan écologique, des expériences ont été élaborés avec les principaux objectifs de révéler 1) que seuls les résidus fongicide peuvent causer la colonie grave déclin dans une espèce d’abeilles indigènes ; 2) le degré auquel des communautés microbiennes dans les dispositions en matière de pollen sont altérées par fongicides et 3) Comment la santé des abeilles est affectée par une communauté microbienne gravement altérée. Les objectifs expérimentaux ont été définies pour répondre aux questions ci-dessus en utilisant une combinaison d’expériences de laboratoire - et sur le terrain. À l’aide d’état-of-the-art métagénomique et techniques moléculaires avec les méthodes traditionnelles d’observation sur le terrain, cette recherche vise à reconstituer les effets potentiels des fongicides sur la santé des abeilles.

Le premier objectif de cette étude est de démontrer que l’exposition fongicide seule peut entraîner des pertes de colonie importante parmi les espèces d’abeilles indigènes. Une étude portant sur les cages de grand champ a été utilisée pour étudier les effets de l’exposition de fongicide sur la croissance de la colonie Bombus impatiens, une abeille indigène omniprésente et abondante aux États-Unis (Figure 1, Figure 2, Figure 3). L’hypothèse a été que les ruches traitées par des fongicides présentera une aptitude inférieure et démographie atypique par rapport aux ruches non exposés. Données tirées de cette expérience appuient cette hypothèse, en démontrant que des résidus de fongicide dans le pollen peuvent être la seule cause des pertes de colonie profonde dans un natif bumble bee espèces25. Le deuxième objectif de cette étude est d’étudier la réponse du microbiome du pollen à l’exposition de fongicide. Il est possible que la composition de la communauté des microbes dans pollen-dispositions exposées aux fongicides sera différente de celle du pollen non traitée. Alors que la diversité et l’abondance de champignon devraient diminuer considérablement, bactéries ou une seule espèce fongique dominante augmentera probablement incontrôlée en l’absence d’autres champignons concurrentes. Grâce à une série d’essais in vivo , ces changements dans la composition des communautés microbiennes seront analysées à l’aide de métagénomique.

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Protocole

1. examiner l’effet de l’exposition au fongicide sur Bumble Bee Colony succès à l’aide de Cage expériences sur le terrain

  1. Set up dix cages en treillis dans un domaine planté d’avoine. Creuser une tranchée autour de chaque cage et creusez tous les quatre bords de la cage de maille dans le sol pour s’assurer que les abeilles ne peuvent pas s’échapper. Les cages avec des plantes à fleurs en pot, qui sont connus pour être attractive pour les abeilles (p. ex. sarrasin, bourrache, alyssum, cosmos et tournesol) en stock ( Figure 2).
  2. Supplément les cages avec un seul plateau (36 x 42 cm) du trèfle en fleurs. Regrouper les ressources florales dans un coin de la cage, occupant un espace environ 2,5 m x 1 m. végéter la surface restante de la cage de l’avoine.
  3. Attribuer au hasard le bourdon, colonies, chaque contenant les travailleurs et une seule reine, un traitement (fongicide présent/absent, N = 5 colonies par traitement, totales 10 colonies), ensuite les placer dans une cage de champ (N = 1/cage) pendant 29 jours (23 juin -21 juillet 2014).
  4. Orienter les cases de la colonie telle que la colonie ' ouvertures s pointent vers le sud pour fournir les abeilles avec des conditions optimales de navigation. Subventionner les colonies avec les réservoirs d’eau de sucre, placées dans les cases de la ruche pour compléter la disponibilité de nectar.
  5. Appliquer axée sur le chlorothalonil fongicide au niveau champ pertinent (20 g/L) pour plantes à fleurs dans les cages de traitement cinq fongicide, à l’aide d’une main tenue pulvérisateur de pesticide, deux fois au cours de l’étude (jour 0 et 13). Enduire les fleurs uniformément tels qu’aucun autre liquide n’adhère aux surfaces florales ( Figure 3).
  6. À l’issue de l’étude de cage sur le terrain, enlever les colonies b. impatiens de cages à la main, refroidir les ruches en plaçant dans le congélateur -20 ° C pendant 20 min.
  7. Enlever les abeilles à l’aide de la pince stérile et noter le nombre de larves, les nymphes, les femelles adultes (je. e. butineuses) et les mâles adultes. À l’aide d’une balance analytique enregistrer le poids sec de la Reine mère, larves, nymphes, femelles adultes (c.-à-d. les fouilleurs de poubelles) et les mâles adultes.

2. Examiner les effets de l’exposition fongicide sur les communautés microbiennes dans les passages de Pollen de Bumble Bee nids à l’aide de laboratoire selon des essais In Vivo

  1. Pulverize acheté dans le commerce pollen à une poudre fine à l’aide d’une norme ball-Moulin de laboratoire. Stériliser en poudre pollen par trempage dans l’éthanol à 70 %, ce qui lui permet de s’évaporer du jour au lendemain sous la lumière UV. Vérifier la stérilité du pollen en ensemençant ~0.5 mg sur milieux gélosés polyvalent.
    1. à la sec, pollen stérile, à l’aide de pipettes stérilisés, ajoutez dosage pertinent de champ de fongicide : propiconazole à 14,3 % ; azoxystrobine à 22,9 % pour les traitements (0,74 µL et 0,65 µL respectivement / jour / la ruche). Mélangez bien à l’aide de bâtons en bois stérilisés.
  2. Place 6 ruches expérimental (n = 3 chaque de contrôle et de traitement) dans un laboratoire propre et hygiénique de benchtop maintenu à température ambiante. Chaque jour environ 4,27 g de pollen 34 , 35, mélangé avec des fongicides (pour les traitements) ou d’eau stérile (pour contrôle) à l’intérieur d’une hotte à l’aide de la technique d’asepsie standard.
    1. à l’aide des trappes fournis par le côté de la boîte en carton renfermant des ruches, introduire le pollen à l’intérieur de la ruche. Compléter les ruches avec une solution stérile de sucre chaque semaine. Continuer l’alimentation régime pendant quatre semaines.
  3. à la fin de l’étude en laboratoire, refroidir les ruches en plaçant dans le congélateur-20 ° C pendant 20 min. gratter le pollen-application des dispositions contenues dans les chambres de couvée à l’aide de forceps stérilisé et spatules et en place dans des tubes stériles de stockage. Conserver à-80 ° C. comte et enregistrer le poids des travailleurs et de la Reine-mère au début et fin de l’expérience (étape 1.7).
  4. Kits d’isoler l’ADN d’échantillons de pollen-disposition en utilisant l’isolement d’ADN disponible dans le commerce (voir Table des matières pour plus de détails).
    1. Ajouter 0,25 g de pollen-disposition d’extraction tubes, brièvement vortex mixer.
    2. Faire un 200 mg/mL solution de lysozyme dans l’eau distillée désionisée, suffisant pour 50 µL/échantillon. Agiter vigoureusement à la solution entièrement forme.
    3. Ajouter 50 µL de la solution de lysozyme aux tubes d’extraction avec échantillon dedans et bien mélanger en retournant plusieurs fois. Incuber le tube pendant 10 min à 37 ° C dans un bain d’eau. Si précipité a formé, chauffer la solution à 60 ° C jusqu'à dissolution avant utilisation.
    4. Ajouter 70 µL de solution de lyse aqueuse aux tubes d’extraction, fixer horizontalement sur un socle de vortex à plat avec du ruban adhésif et vortexer pendant 10 min. centrifuger les tubes à 10 000 g pendant 30 s à température ambiante.
    5. Transférer le surnageant dans un tube de prélèvement propre de 2 mL. Ajouter 250 µL de solution de précipitation de protéine et vortex pour 5 s. Incuber à 4 ° C pendant 5 min dans un bain de glace.
      Remarque : Attendez entre 400 µL à 500 µL de liquide surnageant. Surnageant peut encore contenir certaines particules.
    6. Centrifuger les tubes à température ambiante pendant 1 min à 10 000 x g et transférer jusqu'à 600 µL du surnageant dans un tube de prélèvement propre de 2 mL. Ajouter 200 µL de solution de suppression d’inhibiteur aqueux, brièvement, vortex et incuber à 4 ° C pendant 5 min. centrifuger les tubes à température ambiante pendant 1 min à 10 000 x g. transférer jusqu'à 750 µL de liquide surnageant dans un tube de prélèvement propre de 2 mL.
    7. Ajouter 1200 µL de solution aqueuse de lier le surnageant et vortexer pendant 5 s. charger environ 675 µL du liquide surnageant sur un filtre de spin et centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min à température ambiante. Jeter le débit par.
    8. Répéter 2.4.7. deux fois par.
      Nota : Un total de trois charges pour chaque échantillon traité sont nécessaires.
    9. Ajouter 500 µL éthanol et centrifuger à température ambiante pendant 30 s à 10 000 x g. jeter le débit à travers et centrifuger à nouveau à température ambiante pendant 1 min à 10 000 x g. Place spin filtre dans un tube de prélèvement propre de 2 mL.
    10. Ajouter 100 µL d’élution tampon au centre de la membrane filtrante. Centrifuger à température ambiante pendant 30 s à 10 000 x g. jeter le filtre de l’essorage. Magasin prélevés ADN entre-20 ° C et -80 ° C
  5. usage isolé ADN pour l’ordonnancement de.
    1. Quantifier et de normaliser l’ADN isolé à 2 ng/µL par analyse fluorimétrique. Réactions
      1. Prepare en trois exemplaires pour chaque échantillon prélevé comparer les quantités relatives de 28 s (plante), analyser sa (champignons) et 16 s (bactérienne) composants de chaque échantillon de pollen-disposition 36. S’assurer que chaque réaction contienne 10 ng d’ADN total x 2 du mélange principal de colorant à base de cyanine asymétriques et 2,5 µL de chaque des amorces et inverses paires 28KJ/28, b 37 pour plante et ITS1/ITS5.8R pour l’ADN fongique 38 .
    2. Amplifier l’ADN en utilisant les paramètres suivants : dénaturation préalable 2 min à 50 ° C, dénaturation initiale de 2 min à 95 ° C, 40 cycles de (15 s à 98 ° C, 15 s à 58 ° C, 60 s à 72 ° C), suivie par une courbe fonte.
    3. Préparer un protocole PCR 2-step, imbriqué à l’aide de bibliothèques de séquençage de prochaine génération ciblant l’ARNr 16 s région variable V3/V4 et STI / 5,8 s espaceur ARNr.
      1. Ajouter 12,5 µL d’ADN à 5 pmol de chaque amorce et 2 x mélange principal. Faire des réactions distinctes pour chaque région (16 s ou STI ; voir tableau 1). Modifier des amorces spécifiques de région comme décrit précédemment 39 ,, 40, d’ajouter des séquences nucléotidiques spécifiques séquenceur Adaptateur porte-à-faux pour les séquences de gène-spécifique.
      2. Exécuter amplification initiale en utilisant les paramètres suivants : dénaturation initiale de 3 min à 95 ° C, 25 cycles de (30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C, 30 s à 72 ° C), extension finale 5 min à 72 ° C.
      3. Qui suit initial d’amplification, vérifiez la taille de la bibliothèque et la quantité de mobilité électrophorétique et nettoyer à l’aide d’un 1 x volume en phase solide réversible immperles d’obilization pour enlever les amorces résiduels et les réactifs de la réaction. Piscine de 16 ans et les amplicons quantitativement pour créer un pool de l’amplicon unique pour chaque échantillon.
      4. Ajouter des adaptateurs spécifiques séquenceur et dégustez duals spécifiques utilisant les amorces suivantes (voir tableau 1). Ajouter 2,5 µL d’ADN amplifié à 5 pmol de chaque amorce et 2 x mélange principal. Effectuer l’amplification de bibliothèque en utilisant les paramètres suivants : dénaturation initiale de 3 min à 95 ° C, 8 cycles de (30 s à 95 ° C, 30 s à 55 ° C, 30 s à 72 ° C), extension finale 5 min à 72 ° C.
    4. PCR suivant, bibliothèques propre finis à l’aide d’un volume de 1 x de billes d’immobilisées réversible en phase solide. Évaluer la qualité et la quantité des bibliothèques finis à l’aide de mobilité électrophorétique et fluorimétrie, respectivement. Normaliser les bibliothèques à 2 µM et piscine avant séquençage.
    5. Effectuer le séquençage de nouvelle génération sur une plate-forme analogue aux cartes ajoutées dans la PCR secondaire, avec une longueur adaptée pour couvrir l' amplicon ensemble 41.
  6. Séquence annotation et l’analyse de la composition microbienne.
    1. Moissonneuses paire-fin les données du séquençage (R1 et R2) en contigs unique pour les bibliothèques tout séquencées. Après la fusion des fichiers fois R1 et R2, format fasta unique pour chacune des bibliothèques est produite.
      Remarque : Cette étape et les processus décrits ci-dessous (sauf indication contraire) sont effectuées en Mothur version 1.38.0 38.
    2. D’écran chaque fichier fasta pour supprimer des bases ambiguës et inattendu de longues séquences long homopolymères.
      Remarque : Les paramètres pour le dépistage et le retrait de la séquence sont maxambig = 0, maxlength = 600 et maxhomop = 8 pour les deux gènes. Supprimer des séquences identiques, mais garder une table menace séparément pour toutes les bibliothèques (alias comte table Mothur).
    3. Alignement des séquences uniques de la bibliothèque du gène 16 s contre la version de base de données SILVA 123 et la STI génothèque contre la de base de données unir ses 42.
      Remarque : Les séquences doivent être annotées au niveau du Royaume au niveau du genre.
      1. Par la suite, cluster alignés séquences avec la fonction pre.cluster à l’aide de diff = 5 et supprimer les chimères.
    4. Classer les séquences à l’aide de la méthode Wang 43 basé sur les unir ses (pour le gène ITS) taxonomie fichiers (valeur seuil de 80 %) et SILVA (pour le gène 16 s).
    5. Charger dans R 44 les tableaux de menace (un par gène) générés lors du processus de classification en Mothur. À chaque niveau taxinomique, obtenir l’abondance relative par bibliothèque pour une analyse plus approfondie des changements de population microbienne.
      Remarque : À chaque niveau taxinomique, fusionner les groupes taxonomiques lorsque l’abondance relative est inférieure à 2 % pour toutes les répétitions expérimentales.

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Résultats

Étude de terrain de cage :

Données obtenues à partir des expériences de cage a montré que les colonies d’abeilles de bourdon avaient une réponse significative à l’exposition de fongicide. Les ruches traitées par des fongicides produit beaucoup moins de travailleurs (12,2 ± 3.8, moyenne ± et) que les ruches de contrôle (43,2 ± 11.2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (Figure 4). ...

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Discussion

Recherches sur les effets des fongicides sur la santé des abeilles sont restées un aspect peu étudiée de stratégies de lutte antiparasitaire. Notre étude vise à combler cette lacune à l’aide d’un ensemble de techniques complémentaires qui isolent explicitement les facteurs possibles baisses de l’abeille. La planification, la justification et le rendu de ces expériences sont détaillées ci-dessous.

Il est important de s’assurer qu’aucune abeille n’est autorisés à s’échapper le maillage des expér...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

L’auteur remercie l’installation de séquençage ADN Université du Wisconsin Biotechnology Center permettant l’amplification et installations de séquençage et de services, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto et Max Haase pour fournir une assistance technique avec analyse moléculaire. Ce travail a été soutenu par les fonds de l’USDA-Agricultural Research Service ouvert (Current Research Information System #3655-21220-001). A été confortée par la National Science Foundation (sous le Grant No. DEB-1442148), le centre de recherche de bioénergie DOE Great Lakes (DOE Bureau des sciences DE BER-FC02-07ER64494) et l’USDA National Institute of Food et Agriculture (Hatch projet 1003258). C.T.H. est un érudit de Pew en Sciences biomédicales et Alfred Toepfer Faculté Fellow, appuyé par le Pew Charitable Trusts et la Fondation Alexander von Humboldt, respectivement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Natupol RucheKoppertUSRESM116 ruches
Propiconazole 14.3Quali-Ppro60207-90-1Propiconazole 14.3 %
AboundSyngenta4033540Azoxystrobin 22.9 %
ChlorothalonilSyngenta3452Fongicide utilisé pour les essais
Granules de pollenAbeille sauvéeB004D5650C3X 16oz bouteilles, pollen pour essais
Souches bactériennes pour l’inoculationCurrie Lab
Souches de levure pour l’inoculationHittinger lab
Paires d’amorcesUW Biotech Center
Kit d’isolement de l’ADNMo Bio12830-50Kit d’isolement de l’ADN commercial
Qubit dsDNA HS Kit de dosageThermo FisherQ32851DNA Outil de quantification
Sélectionnez Master Mix pour CFXThermo Fisher4472952Utilisé pour effectuer une PCR en temps réel à l’aide du colorant SYBR GreenER.
Système de détection PCR en temps réelBio Rad1855196Instrument utilisé pour l’amplification PCR
Kit de nettoyage PCR,Axygen10159-696Utilisé pour l’élimination efficace des dNTP, sels et enzymes non incorporés
DNA 1000 KitAgilent5067-1504Utilisé pour le dimensionnement et l’analyse des fragments d’ADN
Séquenceur MiSeqIlluminaUtilisé pour la prochaine génération Séquençage Verrerie
assortie (bécher, flacons, pipettes, tubes à essai, repietters)VWR

Références

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