Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine

Les cellules contiennent une multitude de macromolécules biologiques qui interagissent en permanence les uns avec les autres. Cette association donne naissance à des complexes qui participent aux mécanismes cellulaires responsables de leur fonctionnement dans la transduction du signal, la régulation de l'expression génique et la migration cellulaire, entre autres. Toutes les interactions protéine-protéine qui se produisent dans une cellule comprennent un réseau connu sous le nom intéractome. Dans Saccharomyces cerevisiae plus de 70% de ses protéines se sont révélées avoir des partenaires qui interagissent ^1. Comprendre l'interactome d'une cellule et leurs fonctions de fournir des informations pertinentes sur la complexité et la diversité des organismes vivants. Plusieurs méthodes ont été décrites pour identifier et caractériser les interactions protéine-protéine. Différent haute grâce à des méthodes telles que mettre deux hybrides de levure ^2, protéine fragment complémentation essais ^3, la purification par affinité ⁴ couplée à la spectrométrie de masse et de protéines microarrays sont utilisés pour identifier une interaction ^5,6. Une fois identifié, il est nécessaire de le valider et cela peut varier au cas par cas. En règle générale, ces essais impliquent perturber l'interaction elle - même au niveau des membres individuels de la paire d'interaction, par exemple par délétion du gène ou de la surexpression d'une des protéines, puis la recherche de changements dans les propriétés ou la fonction de l'autre élément à la niveau cellulaire. Par la suite, des techniques biophysiques ⁷ sont utilisées pour caractériser les interactions protéine-protéine au niveau moléculaire. A cet effet, la structure des complexes de protéines sont déterminées par cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire et de cryo-microscopie électronique tandis que la calorimétrie et la spectroscopie de fluorescence sont utilisés pour décrire quantitativement et mécaniquement entre eux.

Dans ce travail, l'anisotropie de fluorescence a été utilisé comme une technique pour caractériser l'interaction entre la GTPase EFL1 et le SBDprotéine S. Ces protéines participent à la synthèse des ribosomes en favorisant la libération du facteur d'initiation eucaryote 6 à partir de la surface de la sous - unité 60S du ribosome ^8. La protéine SBDS est muté dans la maladie connue sous le nom maladie de shwachman ⁹ et agit comme un facteur d'échange de nucléotide guanine pour EFL1 diminuant son affinité pour le guanosine diphosphate ^10,11. mutations de la maladie dans SBDS abolissent l'interaction avec EFL1 et empêchent ainsi son activation.

L'anisotropie de fluorescence est couramment utilisé dans des applications biologiques pour étudier les interactions protéine-acide nucléique-protéine ou un peptide. Elle est basée sur le principe selon lequel un fluorophore excité avec les résultats de la lumière polarisée dans une émission polarisée partiellement. L'anisotropie de fluorescence est définie par l'équation 1:

où je _VV et je _VH sont laintensités de fluorescence de la verticale _(VV) et horizontalement _(VH) polarisés émission lorsque l'échantillon est excité par la lumière polarisée verticalement ^12. L'anisotropie de fluorescence est sensible à des facteurs qui affectent la vitesse de diffusion du fluorophore de rotation et dépend de la température, la viscosité de la solution et la taille moléculaire apparent du fluorophore ainsi. La taille apparente d'une protéine contenant un fluorophore augmente quand il interagit avec une autre protéine et un tel changement peut alors être évalué en tant que changement dans l'anisotropie. Plus précisément, un fluorophore qui tourne lentement dans la solution par rapport à sa durée de vie de fluorescence aura une grande valeur I _VV et une petite valeur I _VH et ne seront donc présenter une anisotropie relativement importante. Pour fluorophores qui dégringolent rapidement par rapport à leur durée de vie de fluorescence, je _VV et je _VH serai semblable et leur valeur d'anisotropie sera faible ¹² (Figure 1). En outre, pour un bon signal d'anisotropie à la mesure du bruit, il est nécessaire d'avoir un fluorophore avec une durée de vie de fluorescence similaire au temps de corrélation de rotation de la molécule d'intérêt. Dans le cas contraire, il est impossible d'enregistrer avec précision la différence entre l'anisotropie de la protéine libre et que, dans le complexe. Par exemple, l'anisotropie d'une sonde fluorescente à une durée de vie proche de 4 nsec tels que la fluorescéine ou la rhodamine attachés à un composé de faible masse moléculaire de 100 Da est de 0,05. La liaison à une molécule de 160 kDa va augmenter sa valeur d'anisotropie à 0,29; une différence qui peut être mesuré avec précision. En revanche, la même sonde fluorescente impliquée dans une réaction de liaison dont l'augmentation de la taille moléculaire varie de 65 à 1000 kDa ne permettra d'obtenir un changement d'anisotropie de 0,28 à 0,3, ce qui est trop faible pour être mesurée avec précision. Dans ce scénario, une sonde avec une durée de vie de 400 nanosecondes serait plus approprié ^12.

les applications de fluorescence nécessitent la présence d'un fluorophore dans une quelconque des molécules étudiées. Pour étudier les interactions protéine-protéine, il existe trois types de fluorophores: 1) les résidus tryptophane présents dans les protéines, 2) des fluorophores attachés chimiquement et 3) les partenaires de fusion fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses derivatives. La plupart des protéines ont des résidus de tryptophane dans sa structure, donc la meilleure façon de mesurer l'interaction est en surveillant les changements dans les spectres de fluorescence correspondants ou par la surveillance des changements dans l'intensité de fluorescence des résidus tryptophane. Cependant, les résidus tryptophane peuvent être présents dans les deux protéines qui compliquent l'analyse. D'autre part, pour un fluorophore pour modifier ses propriétés de fluorescence due à une interaction dont il a besoin d'être situé sur ou à proximité du site de liaison et il pourrait interférer avec l'interaction elle-même. Cela nécessite une attention particulière lors de l'utilisation de fluorophores volumineux tels que la GFP. Si aucune de ces fluorophores peut être utilisé pour des études de liaison, il est donc nécessaire d'introduire des fluorophores extrinsèques à l'une des protéines impliquées. De nombreux fluorophores synthétisés chimiquement existent et peuvent être fixés de manière covalente à des protéines par l'intermédiaire de leurs groupes réactifs tels que les groupes amine (chaîne latérale de résidus lysine ou N-terminale) et les groupes thiol dans la cystéine. Fles dérivés de luorophore avec de l' isothiocyanate et des esters de succinimidyle réagissent avec des groupes amide tandis que l' iodoacétamide et le maléimide sont des groupes thiol réactifs ^13. Les colorants les plus courants utilisés dans les applications de fluorescence sont des dérivés de la fluorescéine et les colorants verts rhodamine, les coumarines, les fluorophores BODIPY et colorants Alexa Fluor. Une liste détaillée des fluorophores disponibles dans le commerce et leur utilisation peut être trouvé dans les références ^14,15. Pour le marquage avec succès, le groupe réactif doit être exposée sur la surface de la protéine, mais en raison du grand nombre de groupes fonctionnels réactifs présents dans les polypeptides en général, il est très difficile d'obtenir une modification spécifique d'un site. La protéine d'intérêt dans cette étude, SBDS, contient 5 cysteines libres et 33 lysines qui peuvent résulter dans l'étiquetage des sites multiples. étiquetage non uniforme peut affecter la liaison et va compliquer l'analyse des données différentes molécules fluorophores peuvent provoquer différents signaux d'intensité fluorescente lors de la liaison. Pour overcome ce problème, nous avons utilisé le fluorophore FlAsH, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine à l'étiquette du site directement la protéine SBDS. Ceci est un colorant arsenoxide avec une forte affinité pour les quatre cysteines espacées dans un motif connu sous Flash tag comprenant le CCXXCC de séquence où X est un acide aminé autre que la cystéine ^16,17. Ce motif tétracystéine est ajouté à l'extrémité N- ou C-terminale de la protéine par génie génétique conjointement avec un agent de liaison approprié pour empêcher la rupture du pli général de la protéine. La paire composée de FlAsH colorant et FlAsH-tag a été initialement conçu pour les protéines d'étiquettes spécifiques au site dans les cellules ¹⁷ vivant , mais il peut aussi être utilisé pour marquer des protéines purifiées in vitro comme il est illustré ici. En outre, les stratégies enzymatiques ont également été mis au point pour permettre la fonctionnalisation spécifique au site des protéines ^18.

Dans ce manuscrit, nous décrivons l'utilité de l'anisotropie de fluorescence d'unoutil sa pour étudier les interactions protéine-protéine. Reliure peut être évaluée par une simple inspection de la forme de liaison de la courbe tandis que l'information quantitative peut être obtenue à partir de l'ajustement des données expérimentales.

1. SBDS-Flash tag Protein Expression et purification

Remarque: Pour les expériences d'anisotropie, un flash-étiquette correspondant à la séquence Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys a été ajouté à l'extrémité C-terminale des séquences codantes humaines SBDS par PCR. Cette construction a été sous - cloné dans le vecteur d'expression présets-A et transformé en cellules C41 Escherichia coli pour exprimer une protéine codant pour une étiquette hexahistidine N-terminal (His-tag), les SBDS humaines séquence et une extrémité C-terminale ÉCLAIR étiquette ¹⁰ codage.

1. SBDS-FlAsH expression de la protéine
   1. Transformer E. compétente cellules coli C41 avec le plasmide présets-HisSBDS-flash en utilisant un protocole de choc thermique standard ^19. Plaque les cellules de Luria-Bertani (LB) milieu solide complété avec 100 pg / ml d'ampicilline. La composition des milieux LB solides est constituée de 10 g de NaCl, 5 g d'extrait de levure, 10 g de tryptone et 20 g d'agar à 1 L de volume.
   2. La culture des bactéries transformées à 37 ° C jusqu'à ce queabsorbance à 600 nm ₍₆₀₀₎ atteint 0,5 à ,7 dans 1 L de milieu LB liquide additionné de 100 pg / ml d' ampicilline.
   3. Induire l'expression de la protéine en ajoutant 0,5 mM d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside à la culture et poursuivre l'incubation pendant encore 5 heures.
   4. Recueillir la suspension bactérienne par centrifugation à 3800 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. A ce stade, soit stocker le culot cellulaire à -20 ° C ou à utiliser immédiatement pour la purification des protéines.
2. SBDS-FlAsH purification des protéines
   Remarque: Toutes les étapes chromatographiques sont effectuées à l'aide d'un système de chromatographie en phase liquide (FPLC), la protéine rapide ou une pompe péristaltique. La chromatographie de Ni ²⁺ utilise une colonne à écoulement rapide de 5 ml. chromatographie par échange anionique utilise une colonne échangeuse de cations sulfopropyl forte 5 ml. Un débit de 3 ml / min a été utilisé pour toutes les étapes chromatographiques.
   1. Remettre en suspension les cellules dans 35 ml de SBDS b Lysisuffer (50 mM de phosphate tampon à pH 7,5, 300 mM de NaCl, 20 mM d'imidazole) supplémenté avec du fluorure 1 mM de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et Lyse par sonification pendant une durée totale de 4 minutes en utilisant des cycles de 10 s ON et 30 s OFF à 4 ° C.
   2. Centrifuger l'échantillon à 9000 xg pendant 50 min à 4 ° C.
   3. Gardez le surnageant et jeter le culot pour éliminer les débris cellulaires.
   4. Equilibrer la colonne d'affinité Ni2 ⁺ avec 3 volumes de colonne (CV) de tampon de lyse SBDS et introduire l'ensemble de surnageant clarifié sur la colonne.
   5. Retirer la protéine non liée par lavage avec 3 CV de tampon Lysis SBDS et éluer avec 3 CV de tampon SBDS Elution (tampon phosphate 50 mM pH 7,5, 300 mM de NaCl, 250 mM imidazole).
   6. Diluer la protéine de 6 fois en éluant avec un tampon phosphate 50 mM pH 6,5 et éliminer les agrégats éventuels, par filtration à travers une membrane de 0,22 um de cellulose.
   7. Equilibrer la colonne échangeuse de cations de sulfopropyle avec 3 CV de faible sel S colonneun tampon (tampon phosphate 50 mM pH 6,5, NaCl 50 mM) et d'introduire l'échantillon de protéine à partir de l'étape précédente.
   8. Lavage la matière non liée avec 3 CV de tampon de colonne S faible teneur en sel et éluer la protéine en une seule étape avec 50 mM de tampon phosphate pH 6,5, 1 M de NaCl.
   9. Diluer la protéine de 3,3 fois en éluant avec un tampon phosphate 50 mM pH 6,5. Concentrer la protéine avec des dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation à 3 800 xg pendant 15 min. Flash geler la protéine dans de l'azote liquide et le stocker à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
   10. Vérifier la pureté de la protéine par l' analyse par SDS-PAGE et coloration au Coomassie ^20.

2. EFL1 Protein Expression et purification

NOTE: EFL1 a été exprimée sous la régulation du Gal 1/10 promoteur divergent ²¹ et le Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR dans le pRS426 vectoriel. La protéine recombinante codant l'isoforme EFL1 humaine 1 fusionné à un virus protease Tobacco Etch (TEV) site de reconnaissance et d'une étiquette hexahistidine à l'extrémité C-terminale.

1. EFL1 expression de la protéine
   1. Transformer S. cellules cerevisiae BCY123 avec le plasmide pRS426-EFL1TevHis en utilisant un protocole standard au lithium acétate ^22. Plate toutes les cellules transformées dans des milieux à goutte synthétique sans uracile (URA SD) supplémenté avec 2% (p / v) de glucose. Composition du milieu SD-URA est composé de 8 g de base azotée de levure sans acides aminés, 11 g d'acides casamino, 55 mg de sulfate d'adénine, 55 mg de tyrosine, 60 mg de leucine et de tryptophane 60 mg pour 1 litre de volume.
   2. La culture de levure transformée à 30 ° C jusqu'à _A600 atteint 1,8 dans 1 litre de milieu SD-URA supplémenté avec 0,5% (p / v) de glucose.
   3. Induire l'expression de protéine par addition de 2,8% (p / v) de galactose à la culture et poursuivre l'incubation pendant encore 18 heures à 30 ° C.
   4. Recueillir la suspension de levure par centrifugation à 3800 xg pendant 10 min à 4 ° C. Retirer le surnageant.A ce stade, soit stocker le culot cellulaire à -20 ° C ou à utiliser immédiatement pour la purification des protéines.
2. EFL1 purification des protéines
   Remarque: Toutes les étapes chromatographiques sont effectuées à l'aide d'un système FPLC ou une pompe péristaltique. La Chromatographie de Ni ²⁺ utilise une colonne à écoulement rapide de 5 ml à un débit de 3 ml / min de débit. Chromatographie d'exclusion de taille utilise une colonne de 125 ml préalablement garnie de résine Superdex 200 à un débit de 1 ml / min.
   1. Remettre en suspension les cellules dans 50 ml de EFL1 de tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl pH 8, 300 mM de NaCl, 20 mM d' imidazole, 5 mM de _MgCl2, 10% de glycerol) supplémenté avec 1 mM de PMSF et 1 mM de benzamidine et de perturber les cellules par frottement sur un batteur à billes utilisant des billes de verre (Ø = 0,5 mm) pour une durée totale de 6 min à l'aide des cycles de 2 min et 15 min OFF, à 4 ° C.
   2. Centrifuger l'échantillon à 9000 xg pendant 50 min à 4 ° C.
   3. Gardez le surnageant et jeter le culot pour éliminer les débris cellulaires.
   Equilibrer la colonne d'affinité Ni2 ⁺ avec 3 CV de tampon Lysis EFL1 et introduire la totalité du surnageant clarifié sur la colonne.
3. Éliminer la protéine non liée par lavage avec 3 CV de tampon de lyse EFL1 et éluer avec 3 CV de tampon d' élution EFL1 (50 mM de Tris-HCl , pH 8, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM, MgCl2 ₅ mM, glycerol à 10%).
4. Équilibrer la colonne d'exclusion de taille avec 1,5 CV de tampon d' anisotropie (Tris-HCl 50 mM , pH 7,5, 300 mM de NaCl, 5 mM de _MgCl2, 10% de glycerol, 5 mM de β-mercaptoéthanol).
5. On concentre à 1 ml de la protéine EFL1 élue de la colonne d'affinité Ni2 ⁺ avec des dispositifs d'ultrafiltration par centrifugation à 3 800 x g pour le volume désiré. Introduire l'échantillon sur la colonne d'exclusion de taille.
6. Recueillir la protéine éluée et on concentre par ultrafiltration à une concentration finale d'environ 30 uM. Flash geler la protéine dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Vérifiez ee pureté de la protéine par analyse SDS-PAGE et coloration au Coomassie ^20.

3. Étiquetage des SBDS-avec le flash Fluorescent Dye 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine

1. Mélanger 3 nmol de la protéine SBDS-FlAsH avec 3 nmol de la 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine dans un volume de 5 pi de tampon anisotropie.
2. Laissez la réaction se déroule pendant 8 heures à 4 ° C. Dialyser l'échantillon contre un tampon anisotropie pendant la nuit pour enlever le colorant libre.
3. Utilisez la loi de Beer-Lambert pour quantifier le% de protéine marquée. Mesurer l'absorbance à 280 nm et 508 nm dans un spectrophotomètre en utilisant une cuvette en quartz de volume approprié. NOTE: Considérons les coefficients d'absorption molaires suivants (M ^-1 cm ^-1):
   
4. Calculer la concentration de protéine marquée SBDS Flash en utilisant l'équation 2.
   
5. Calculer la concentration de protéine totale SBDS en utilisant l' équation 3 en remplaçant la calculé C _SBDS-FlAsH de l' étape précédente.
   
6. Calculer le pourcentage de protéine marquée en utilisant l'équation 4.
   

4. Les expériences Fluorescence anisotropie

REMARQUE: Les expériences ont été effectuées d'anisotropie dans un spectrofluorimètre équipé d'un ensemble de boîtes à outils de polarisation et des données a été effectuée en utilisant le programme d'anisotropie fourni dans le logiciel de l'équipement. La longueur d'onde d'excitation a été réglée à 494 nm avec une largeur de bande spectrale de 8 nm et l'émission a été enregistrée à l'aide d'un filtre passe-bande de 530 ± 25 nm. Les mesures ont été effectuées à 25 ° C dans une cuvette de 200 ul d'une 5 mm de longueur de trajet ^10.

1. Dans une cuvette de fluorescence, placer 200 pi de 30 nM SBDS clignotements de tampon anisotropie et titrez 2 pl de 30 uM EFL1. Bien mélanger et laisser reposer la réaction pendant 3 minutes avant de mesurer la valeur d'anisotropie.
2. Répétez l'étape 4.1 jusqu'à un volume total de 40 pi de EFL1 a été ajouté.

Analyse 5. Données

1. Monter les données sur le modèle de liaison approprié à l'aide d'un algorithme non linéaire des moindres carrés de régression. Les équations pour les modèles de liaison les plus courants sont présentés dans le tableau 1.
2. Évaluer le meilleur modèle qui décrit l'interaction entre les protéines en inspectant les résidus de l'ajustement ^23. Soutenir le modèle choisi avec des expériences supplémentaires.

Tableau 1 : Modèles de liaison commun interaction protéine-protéine et des équations mathématiques qui les décrivent.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

Pour effectuer toutes les expériences d'anisotropie, il est important d'éliminer les fortes variations dans l'intensité de fluorescence du fluorophore étant donné que l'anisotropie observée d'un mélange d'espèces est représenté par l'équation 5:

où F i représente la fraction de fluorescence de chaque composant , et r i est l'anisotropie correspondant. La fluorescence de chaque composante fractionnaire dépend à la fois, de sa concentration et de sa fluorescence relative, qui est définie par l'équation 6:

où X i représente la fraction molaire du ièmee i ème espèce et Ø i est le rendement quantique de la i ème espèce.

Ainsi, si l'intensité de la fluorescence change radicalement le long du titrage, il est préférable de non plus de mesurer la formation du complexe en fonction de la variation du signal de fluorescence, et non du signal d'anisotropie, ou de corriger la valeur d'anisotropie observée en ajustant à la fois l'intensité de fluorescence et de l'anisotropie données. La fluorescence de SBDS-FlAsH ne change pas perceptible lors de la liaison à EFL1 (Figure 2) suggérant que l' anisotropie de fluorescence est adéquate pour mesurer la liaison entre les deux protéines.

Figure 2. L' émission de fluorescence de SBDS-FlAsH lors de la titration de concentrations croissantes de EFL1. Les changements dans l'émission de fluorescence du fluorophore sont negligible et aléatoire le long de la titration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Un exemple de la fluorescence de la courbe obtenue à partir du titrage de EFL1 TGC-flash de liaison anisotropie est représentée sur la figure 3. Qualitativement, la forme du graphique montre clairement que les deux protéines interagissent en évidence par une augmentation du signal d'anisotropie lors de l' addition de EFL1. En outre, les valeurs d'anisotropie ont atteint un plateau qui suggère que, à la fin du titrage toutes les protéines SBDS-FlAsH était présent dans un complexe avec EFL1. Il est donc possible, pour décrire quantitativement l'interaction entre ces protéines et ajuster les données en utilisant non linéaire régression des moindres carrés à un modèle de liaison présumée et obtenir la dissociation correspondante constante d'équilibre. Montage à un seul modèle site de liaison n'a pas approdécrire diatement les données expérimentales (Figure 3A). Cela est évident non seulement à partir du tracé de montage de la courbe de liaison, mais aussi des écarts des résidus de l'ajustement (la différence entre les données théoriques et expérimentales) qui sont appréciables et non aléatoire. Cela correspond bien au fait qu'un seul modèle de site de liaison est décrit mathématiquement par une courbe hyperbolique plutôt que d' une courbe sigmoïde que celle observée pour les données expérimentales présentées dans la figure 3. D'autre part, des modèles tels que les deux identiques ou deux de liaison différent les sites décrivent mieux les données expérimentales et les résidus de l'exposition en forme aucune dérogation systématique soutenant un modèle d'association à deux sites (figure 3B-C). En l'absence de toute autre information expérimentale est difficile d'établir lequel des deux modèles correspondent au mécanisme de liaison entre EFL1 et SBDS. Néanmoins, SBDS et EFL1 sont les deux protéines monomères, il est donc difficult d'envisager deux identiques modèle de sites de liaison.

. Figure 3. Fluorescence anisotropie isothermes de liaison de l'interaction entre EFL1 et SBDS-FlAsH La ligne continue dans chacune des parcelles supérieures correspond à l'ajustement des données à différents modèles de fixation: (A) seul site, (B) deux sites identiques et (C) , deux sites non identiques. Parcelles inférieures représentent les résidus de l'ajustement du modèle correspondant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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