Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine

Résumé

Les interactions protéiques sont au cœur de la fonction d'une cellule. techniques calorimétriques et spectroscopiques sont couramment utilisés pour les caractériser. Nous décrivons ici anisotropie de fluorescence comme un outil pour étudier l'interaction entre la protéine mutée dans le syndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) et le facteur Allongement-like 1 GTPase (EFL1).

Résumé

interactions protéine-protéine jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement d'un organisme vivant. Une fois que l'interaction a été identifié et validé, il est nécessaire de caractériser au niveau structurel et mécaniste. Plusieurs méthodes biochimiques et biophysiques existent à cette fin. Parmi eux, l'anisotropie de fluorescence est une technique puissante utilisée notamment lorsque l'intensité de la fluorescence d'une protéine marqué par un fluorophore reste constant lors d'une interaction protéine-protéine. Dans cette technique, une protéine marqué par un fluorophore est excité avec une lumière polarisée verticalement, d'une longueur d'onde appropriée qui excite sélectivement un sous-ensemble des fluorophores en fonction de leur orientation par rapport au faisceau entrant. L'émission résultant a également une directivité dont la relation dans les plans verticaux et horizontaux définit anisotropie (r) comme suit: r = (I _VV -I _VH) / (I _VV + 2I _VH), où je _VV et je

Introduction

Les cellules contiennent une multitude de macromolécules biologiques qui interagissent en permanence les uns avec les autres. Cette association donne naissance à des complexes qui participent aux mécanismes cellulaires responsables de leur fonctionnement dans la transduction du signal, la régulation de l'expression génique et la migration cellulaire, entre autres. Toutes les interactions protéine-protéine qui se produisent dans une cellule comprennent un réseau connu sous le nom intéractome. Dans Saccharomyces cerevisiae plus de 70% de ses protéines se sont révélées avoir des partenaires qui interagissent ^1. Comprendre l'interactome d'....

Protocole

1. SBDS-Flash tag Protein Expression et purification

Remarque: Pour les expériences d'anisotropie, un flash-étiquette correspondant à la séquence Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys a été ajouté à l'extrémité C-terminale des séquences codantes humaines SBDS par PCR. Cette construction a été sous - cloné dans le vecteur d'expression présets-A et transformé en cellules C41 Escherichia coli pour exprimer une protéine codant pour une étiquette hexahistidine N-terminal (His-tag), les SBDS humaines séquence et une extrémité C-terminale ÉCLAIR étiquette ¹⁰ codage.

1. SBDS-FlAsH expression de la protéine <....

Résultats

Pour effectuer toutes les expériences d'anisotropie, il est important d'éliminer les fortes variations dans l'intensité de fluorescence du fluorophore étant donné que l'anisotropie observée d'un mélange d'espèces est représenté par l'équation 5:

où F _i re.......

Discussion

La plupart des expériences biochimiques avec les protéines ne nécessitent pas de protéine pure, mais aussi de grandes quantités d'entre eux, quelle que soit la technique utilisée. Pour cette raison, les protéines utilisées pour ce type d'expériences sont obtenues par expression hétérologue, comme ce fut le cas présenté ici. La spectroscopie de fluorescence nécessite la présence d'un fluorophore dans la molécule étudiée. des résidus aromatiques constituent les fluorophores intrinsèques d'une protéine, tou.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,5 mm Perles de verre	Biospec Produits	11079105
Tris Base	Formedium	TRIS01
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516
colorant 4',5'-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescéine	ThermoFischer Scientific	LC6090	Ce kit contient le colorant pour étiqueter un tag FlAsH
Ampiciline	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-Glucose anhydre	pour le	GLU03
D(+)-Galactose	pour le moyen	GAL03
L-Leucine	pour	DOC0157
le L-tryptofan.	Formedium	DOC0189
Chlorhydrate de bézamidine	Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	Fluorure de phénylméthylsulfonyle
NaCl	Formedium	NAC02	Chlorure de sodium  ;
Glycérol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	Chlorure
de magnésium Imidazole Sigma-Aldrich		I2399-500G
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	Phosphate de potassium dibasique
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	Phosphate de sodium monobasique
Base azotée de levure sans acides aminés	Formedium	CYN0410
Extrait de levure	Formedium	YEM03	Micro granulé
L-Tyroisne	Formedium	DOC0193
Sulfate	d’adénineFormedium	DOC0230
Casamino acids	Formedium	CAS03
Tryptone	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
Unités de filtration	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10  ; Filtre à membrane kDa
	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	Filtre à membrane, esters de cellulose mixtes, hydrophile, 0,22 et micro ; m, 47  ; mm, blanc, uni
Ni2+ colonne d’affinité	QIAGEN	30760	Cartouche pré-remplie de 5  ; ml Ni-NTA Superflow
Strong Sulfopropyl cation cation exchanger	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Colonne d’exclusion de taille	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Cellule de fluorescence	Hellma Analytics	111-057-40
Spectrophotomètre	Agilent Technologies	G6860AA	Cary 60 Agitateur UV-Vis
	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 Plage de température de paillasse Ambiant-15° ; à 60° ; C
Centrifugeuse	ThermoFischer Scientific	75004271	Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Conductivité	système FPLC abandonné Moniteur UV-MM II P500
Spectrofluorimètre	Olis	Non applicable	Olis DM 45 avec boîte à outils de polarisation

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