Une procédure mécanique simple pour créer Limbal Carence de cellules souches dans la souris

Résumé

L'article suivant fournit, une technique reproductible facile de créer efficacement un modèle de souris durable de la carence en cellules souches limbiques (LSCD). Ce modèle animal est utile pour tester et comparer l'efficacité des traitements pour les maladies de cellules souches limbiques.

Résumé

carence en cellules souches limbiques (LSCD) est un état de dysfonctionnement ou de perte de cellules souches épithéliales limbiques, après quoi l'épithélium cornéen est remplacé par conjonctive. Les patients souffrent de défauts récurrents de la cornée, la douleur, l'inflammation et la perte de vision.

Auparavant, un modèle murin de LSCD a été décrite et comparée aux deux autres modèles. L'objectif était de produire un modèle de souris cohérente de LSCD que les deux imite le phénotype chez l'homme et dure assez longtemps pour permettre d'étudier la physiopathologie de la maladie et d'évaluer de nouveaux traitements. Ici, la technique est décrite plus en détail.

Un outil motorisé avec une fraise rotative a été conçu pour enlever les anneaux de rouille de la surface de la cornée ou de lisser le lit de ptérygion chez les patients. Il est un dispositif approprié pour créer le modèle de LSCD souhaité. Il est un outil facile à utiliser facilement disponibles avec une pointe fine qui le rend approprié pour travailler sur de petits yeux, commechez la souris. Son application empêche les traumatismes inutiles à l'œil et il ne donne pas lieu à des blessures non désirées, comme cela est souvent le cas avec les modèles de lésion chimique. Par opposition à un grattoir émoussé, il élimine l'épithélium de la membrane basale. Dans ce protocole, la zone limbique a été abrasée deux fois, puis l'ensemble de l'épithélium cornéen a été rasée de limbe à limbe. Pour éviter les blessures de stroma, on a pris soin de ne pas brosser la surface de la cornée, une fois l'épithélium a déjà été supprimé.

Introduction

L'épithélium cornéen est nécessaire pour maintenir la clarté et l'intégrité de la cornée. Il est sans cesse renouvelée tout au long de la vie par les cellules souches épithéliales résidant dans la-un limbe zone étroite à la jonction de la cornée et la conjonctive. Ces cellules souches limbiques auto-renouvellement jouent un rôle crucial dans la régénération de l'épithélium cornéen, à la fois normalement et après une blessure. déplétion partielle ou complète de ces cellules souches se traduira par des érosions cornéennes récurrentes, la douleur, la cicatrisation de la cornée et de la néovascularisation, l'apparition de cellules caliciformes, et l'absence de traitement, la cécité cornéenne. Cette condition est connue comme la déficience limbique de cellules souches (LSCD) et peut être idiopathique; héréditaire; ou acquis en raison de blessures chimiques ou thermiques, des lentilles de contact à long terme portent, et l' inflammation chronique ^1-6.

La recherche sur LSCD nécessite un modèle animal approprié qui, non seulement imite la maladie chez les humains, mais est reproductible et durable, avec le moinsmontage de blessures à d'autres structures cornéennes et oculaires. Ce modèle est nécessaire pour évaluer les traitements et de clarifier les mécanismes de la maladie au niveau moléculaire et cellulaire. ¹ comme décrit précédemment, avec l'utilisation d'une fraise rotative, on peut aisément développer un modèle murin de LSCD qui présente les avantages précités et persiste pendant au moins trois mois. Le but de cette étude est de présenter un modèle simple, reproductible et durable souris LSCD.

La fraise rotative est un outil pratique qui élimine uniformément l'épithélium sans blesser le stroma sous - jacent ^1. Il a été utilisé pour induire une érosion de la cornée centrale ^{7, 8} dans les études de cicatrisation des plaies. La technique de la présente-présenté pour créer LSCD dans une souris n'a pas été signalée auparavant. Auparavant introduit des méthodes de grattage de l'épithélium avec un résultat de spatule contondant dans un moins uniforme blessure particulièrement au niveau du limbe et un phénotype plus variable ^{1, 9,} avec plus de restauration of épithélium de la cornée normale ^1. A la différence du racleur émoussé, la fraise rotative retire la membrane basale epitheliale et ^{7, 8, 10.} D'autres méthodes rapportées pour sectionner les cellules souches comprennent l'utilisation de produits chimiques tels que l'hydroxyde de sodium, le n-heptanol et le chlorure de benzalkonium, qui non seulement peut induire des lésions indésirables aux structures de l'œil sous-jacentes, mais peut aussi conduire à une inflammation significative et opacification de la cornée postérieure ou épithéliale métaplasie squameuse ^11-15. La fraise rotative est pas associée à ces complications graves. Enlever chirurgicalement l'épithélium limbique, seul ou avec l'utilisation de produits chimiques ^{10, 11, 16,} est plus difficile à réaliser et est pas la meilleure option chez les animaux avec de petits yeux et un épithéliums limbique mince (comme des souris). En outre, de manière surprenante, limbectomy peut encore laisser une partie de l'épithélium limbique derrière ^10.

La technique décrite ci-dessous se traduira par LSCD avec néovascularisation uned conjunctivalization qui imite la présentation LSCD complète chez les patients et dure pendant au moins trois mois ^1. Il est adapté pour ceux qui visent à étudier LSCD ou physiopathologie de la cicatrisation des plaies, l'immunologie et les traitements potentiels chez la souris. Éventuellement, avec quelques modifications, cette procédure peut être effectuée chez des rats ou des lapins ^10. Comme fraise rotative élimine efficacement l'épithélium, il peut être utilisé dans toute recherche se rapportant à l'épithélium de la cornée à l'abrasion / blessures et dans tous les traitements liés ou des études de biologie moléculaire.

Protocole

Toutes les procédures effectuées sur les animaux sont conformes à l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie déclarations pour l'utilisation des animaux dans la recherche de vision. Quatorze de quatre à / / 6J mâles de six mois vieilles femelles C57BL sauvages de type ont été utilisés: dix souris pour le modèle de lésion et quatre comme animaux témoins (cornées non blessés).

1. Préparation d'un animal

1. Anesthésier une souris avec une injection intrapéritonéale de 100 mg / kg de kétamine et / kg de xylazine mélange de 5 mg. Après l'anesthésie a pris effet, pincer la pointe pour confirmer la profondeur de l'anesthésie; l'animal ne doit pas réagir.
2. Inspecter l'œil sous une lampe à fente avant d'effectuer les expériences afin de vérifier l'absence de toute lésion de la cornée précédente.
3. Instiller une goutte de 1% de chlorhydrate de tétracaïne sur l'oeil. Après 60-90 secondes, tester le réflexe cornéen pour confirmer l'absence de sensation. Proparacaine chlorhydrate de 0,5% peut être utilisé à la place.
4. Lorsque la perte de sensibilité cornéenne estcertains, placez doucement une goutte de 5% de povidone-iode sur l'oeil et sur les cheveux autour de l'oeil. Essuyer la goutte après 1 min ou l'étaler sur les cheveux autour de l'œil pour empêcher les cheveux d'interférer avec la pointe de l'outil.

2. abraser l'épithélium cornéen

1. Porter des gants chirurgicaux et une robe. Préparer les outils nécessaires: une fraise rotative stérile et une paire de pinces stériles. Pour un meilleur contrôle, utiliser des pinces courbées. Placez les outils sur une feuille stérile pendant la procédure.
2. À l'aide des pinces courbées, stabiliser l'œil en saisissant les couvercles du côté nasal et proptosing doucement l'œil. Évitez d'utiliser trop de pression.
3. Sous un microscope chirurgical, raser 360 ° autour de la zone limbique deux fois en utilisant la fraise rotative stérile. Faites le tour du limbe avec une vitesse de 5-6 secondes par tour.
   NOTE: Le trépan a une vitesse fixe. Cependant, pour le faire tourner à la vitesse établie, le "écrou de fin" doit être complètement serré.
4. Enlever l'ensemble de l'épithélium cornéen limbique à limbe avec la meule en rotation. Pour de meilleurs résultats, déplacer l'outil de façon circulaire et maintenez-le peu parallèle à la surface de la cornée à travailler avec le côté latéral de la pointe. Prenez soin de ne pas blesser le stroma en ne re-brossant les zones où l'épithélium a déjà été supprimé. Ne pas appliquer de pression sur l'œil. Nettoyez la pointe du pinceau, au besoin.
5. Instiller une goutte de solution saline tamponnée au phosphate stérile sur la cornée et essuyer les feuilles épithéliales détachées avec un tissu de nettoyage doux.
6. Raser l'épithélium restant, le cas échéant.
7. Faites attention à la queue de la souris pendant la chirurgie.
   NOTE: Si un mouvement se produit, la profondeur de l'anesthésie a disparu et injection supplémentaire est nécessaire. Un tiers à deux tiers du volume injecté primaire devrait être suffisante. Ne pas surdoser l'animal avec le médicament anesthésique.
8. Stériliser tous les outils avant de les utiliser sur un autre œil.

3. Confirmer complète Retrait épithéliale

1. Appliquer une goutte de 1 mg / ml de fluorescéine sodique sur la cornée. Nettoyer la cornée après 30 secondes et l'examiner sous un microscope avec un filtre bleu de cobalt pour vérifier le retrait complet de l'épithélium.
   REMARQUE: Les zones cornéennes avec des défauts épithéliales sont visualisés en vert.

4. Post-opération de soins

1. Mettez l'animal sur une couverture chauffante et le garder dans un endroit sûr (par exemple, dans sa cage) , tandis que dans la récupération. Ne pas garder un animal inconscient en compagnie de ceux conscients.
2. Appliquer 1% érythromycine pommade ophtalmique. Cela permettra également de prévenir la sécheresse oculaire. Poursuivre l'application du quotidien antibiotique pendant une semaine.
3. Injecter 0,1 mg / kg par voie sous-cutanée buprénorphine après la procédure et à nouveau après 12 heures. Continuer l'injection deux fois par jour pendant deux jours.
4. Observez l'animal pour 30 - 45 min, jusqu'à la récupération complète de l'anesthésie.
   REMARQUE: Mouvement doux des muscles respiratoires sur la surface ventrale indique le bien-être des animaux tandis que sous la récupération.

Résultats

Moins d' un mois après avoir effectué cette technique, 100% des cornées a développé une néovascularisation superficielle (figure 1A. Les photos ont été prises avec un appareil connecté à une lampe à fente sous un champ lumineux et filtre bleu de cobalt). Dans 18/20 (90%) des yeux, la néovascularisation impliquait la totalité de la surface de la cornée (figure 1A). Dans 2/20 (10%), la néovascularisation a été observée dans trois des quatre quarts de c...

Discussion

Cet article décrit une technique reproductible et relativement simple pour créer un modèle de souris de LSCD. Il y a plusieurs aspects importants de ce modèle qui méritent d'être soulignées. Premièrement, les modèles à la différence qui utilisent des produits chimiques ^{11, 12,} la blessure implique principalement l'épithélium de surface (et membrane basale), avec un minimum de dommages à l'stroma cornéen sous - jacente ou à d' autres structures intraoculaires. Ainsi, il n'y a que l'infl...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Meule rotative : dissolvant d’anneaux antirouille AlgerBrush II  ;	Rumex International Co, Clearwater, FL	16-141	Bavure de 0,5 mm. Également disponible auprès d’autres sociétés.
Microscope chirurgical	Wild Heerbrugg, Suisse	Wild M691
Appareil photo numérique	Nikon, Thaïlande Nikon, Thaïlande
Nikon	, Japon
Anticorps polyclonal anti-CK12	Santa Cruz Blotechnology, CA,SC-17101		Concentration 1:100
Anticorps monoclonal anti-CK8	TROMA-I-s, Iowa City, IA	AB_531826	Concentration de 1:50