Microglies comme un biocapteur Surrogate pour déterminer Nanoparticules neurotoxicité

Résumé

Les microglies (cellules immunitaires du cerveau), sont utilisées comme biocapteur de substitution pour déterminer comment les nanoparticules influencent la neurotoxicité. Nous décrivons une série d’expériences conçues pour tester la réponse microgliale aux nanoparticules et l’exposition des neurones hypothalamiques au surnageant de la microglie activée afin de déterminer la neurotoxicité.

Résumé

Les nanoparticules présentes dans les polluants atmosphériques peuvent modifier les profils de neurotransmetteurs, augmenter la neuroinflammation et modifier la fonction cérébrale. Par conséquent, le test décrit ici aidera à élucider le rôle de la microglie dans la neuroinflammation et les maladies neurodégénératives. L’utilisation de la microglie, cellules immunitaires résidentes du cerveau, comme biocapteur de substitution fournit de nouvelles informations sur la façon dont les réponses inflammatoires médient les agressions neuronales. Ici, nous utilisons une lignée de cellules microgliales murines immortalisées, désignée BV2, et décrivons une méthode d’exposition aux nanoparticules utilisant des nanoparticules d’argent (AgNP) comme standard. Nous décrivons comment exposer la microglie aux nanoparticules, comment éliminer les nanoparticules du surnageant et comment utiliser le surnageant de la microglie activée pour déterminer la toxicité, en utilisant la survie des cellules hypothalamiques comme mesure. Après l’exposition à l’AgNP, l’activation microgliale de la BV2 a été validée à l’aide d’un test immuno-enzymatique (ELISA) du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Le surnageant a été filtré pour éliminer l’AgNP et permettre aux cytokines et autres facteurs sécrétés de rester dans le milieu conditionné. Les cellules hypothalamiques ont ensuite été exposées au surnageant de la microglie activée par AgNP et la survie des neurones a été déterminée à l’aide d’un test fluorescent à base de résazurine. Cette technique est utile pour utiliser la microglie comme biomarqueur de substitution de la neuroinflammation et déterminer l’effet de la neuroinflammation sur d’autres types de cellules.

Introduction

Pollutions environnementales, en particulier celles de la nanoparticule (NP) Plage (1 - diamètre 20 nm), ont été liés à l' obésité et d' autres maladies neurodégénératives en raison de la capacité à traverser la barrière hémato - encéphalique ^1-3. Exposition élevée à la pollution peut induire une inflammation dans le système nerveux central , y compris l'hypothalamus ^1. Un mécanisme potentiel dans lequel cela se produit pourrait être par nanoparticule induite par l' activation de la microglie (cellules immunitaires du cerveau) ^4. Des études antérieures ont utilisé des modèles in vivo pour étudier les effets des IP sur la santé du cerveau qui sont de temps, coûteux, et ne répond pas directement à la question de la façon dont les IP influencent la microglie. Les microglies jouent un rôle multiple dans le système nerveux central, y compris la maintenance du microenvironnement du cerveau et de communiquer avec entourant les neurones via la libération de facteurs sécrétés et cytokines. En fonction des stimuli microglie peut être activé pour une pr M1o-inflammatoire ou un état anti-inflammatoire M2. Par exemple, M1 activé microglie libèrent des cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), alors que la microglie activée M2 libèrent des cytokines anti-inflammatoires, y compris l'interleukine-4 (IL-4). Pour valider notre substitut en biocapteur vitro pour déterminer la neurotoxicité des polluants atmosphériques, nous avons mesuré la réponse microgliale 20 nanoparticules d' argent nm (de AGNPS). Le but de cet article est de décrire comment une lignée de cellules microgliales in vitro peut être utilisé comme un marqueur de biocapteur de substitution pour tester la réponse microgliale murine aux IP et comment la microglie activation affecte les cellules hypothalamiques. Le long terme destiné application de ce modèle validé est de tester les effets des polluants du monde réel sur la santé du cerveau et les maladies neurodégénératives. Nous fournissons une description détaillée d'un in vitro essai de 96 puits de format pour mesurer l' activation de la microglie et la survie des cellules hypothalamique suite à l'exposition des micro roglial milieu conditionné.

activation microgliale a été déterminée après une exposition AGNP utilisant une enzyme TNF-α linked immunosorbent assay (ELISA). Pour déterminer l'effet de la microglie activée sur les cellules hypothalamiques, les AGNPS ont été retirés du surnageant microgliales (milieu conditionné) en utilisant un dispositif de filtration. Le dispositif de filtration retient les cytokines tout en excluant les AGNPS en fonction de leur taille. En bref, le surnageant de cellules microgliales traitées avec ou sans AGNPS a été recueilli, ajouté aux filtres et centrifugée à 14 000 xg pendant 15 min. Nous étions alors en mesure de déterminer l'influence de cytokines sécrétées microgliales sur la viabilité des cellules hypothalamique. Toxicité cellulaire après une exposition à des milieux conditionnés (contenant des cytokines) a été déterminée par un dosage à base de résazurine, comme décrit précédemment ^5,6. Cellules métaboliquement actives réduisent résazurine et de produire un signal fluorescent proportionnel au nombre de cellules viables ^7.

nt "> Il y a plusieurs avantages de l' utilisation de cette technique par rapport à d' autres (comme co-culture, les configurations trans puits, ou dans des expériences in vivo). Notre modèle offre la possibilité d'activer directement les microglies et de déterminer si les facteurs sécrétés sont toxiques pour les neurones ⁸ . Le protocole actuel utilise immortalisé microglie de BV2 stimulée avec des nanoparticules de 20 nm de diamètre, et cellules immortalisées hypothalamiques murins (désigné mHypo-A1 / 2) ⁹ pour la détermination de la réponse ultérieure. Bien que ce protocole a été optimisé pour ces conditions spécifiques, les méthodes peuvent être modifiées pour être utilisées dans d'autres modèles de la mort cellulaire induite par la microglie, ou avec d'autres types de cellules, y compris les microglies et les neurones primaires.

Protocole

1. microglial Maintenance Cell Culture

1. Milieu de culture cellulaire chaude (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine / néomycine (PSN) à 37 ° C.
2. Obtenir stock congelé des cellules microgliales BV2 au passage 18 - 25 de stockage à -80 ° C. Rapidement décongeler les cellules dans 37 ° C bain d'eau.
3. Le transfert en douceur les cellules dans un flacon de 75 ^cm2 ventilé contenant 10 ml de milieux de culture cellulaire.
4. Incuber flacon à 5% de CO ₂ à 37 ° C. Aspirer les médias après 24 h et le remplacer par du milieu frais. Cultiver les cellules jusqu'à environ 70 - 80% de confluence.

2. Comptage et Cellules Placage

1. Dans un bain-marie à 37 ° C, DMEM chaude et une solution 1x-trypsine-EDTA.
2. Aspirer le milieu de cellules et ajouter 500 pi de trypsine. Incuber à 37 ° C pendant 2 à 5 min.
3. À l'aide d'une raclette, d'éliminer les cellules de la fiole et mettre en suspension dans 5 mlde DMEM. Passer les cellules à travers un tamis de 70 um dans un tube de 50 ml à trois reprises.
4. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et épépiner 8000 cellules / puits dans un noir murées plaque de fond clair dans un volume final de 200 ul DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% PSN. Incuber plaque dans 5% de CO ₂ à 37 ° C pendant 24 heures.
5. Enlevez le vieux DMEM et le remplacer par 200 ul de DMEM réchauffé additionné de 1% PSN au sérum de faim microglie. Incuber plaque dans 5% de CO ₂ à 37 ° C pendant 24 heures.

3. Activation Microglia

1. Dans des tubes séparés, on dilue AGNPS (0,01, 0,05 ou 0,1 pg / ml) et un véhicule / contrôle neutre (citrate de sodium, 0,04 mM) dans du milieu DMEM sans sérum supplémenté avec 1% PSN à une concentration de travail finale.
2. Retirer 100 ul de milieu de chaque puits et les remplacer par 100 ul de composé de traitement approprié.
3. Incuber plaque dans 5% de CO ₂ à 37 ° C pendant 24 heures.

4. Filtrage Médias Conditionné

1. Recueillir 200 pl de surnageant de chaque puits de support et de transfert dans un filtre (coupure de masse moléculaire de 10 kDa) avec un tube de collecte (de 1,5 à 2 ml de capacité).
2. Centrifuger à 14000 xg à la température ambiante pendant 15 min.
3. Jeter l'écoulement (surnageant avec des particules) et placer le filtre à l'envers dans un nouveau tube de collecte.
4. Centrifuger à 1000 xg à température ambiante pendant 2 min.
   NOTE: Les médias filtré résultant (contenant des cytokines sécrétées) est concentrée par six fois.
5. Amener le volume du concentré à 400 ul avec du DMEM frais complété avec 10% de FBS et 1% PSN et de stocker de la glace.
   REMARQUE: Pour AGNPS résiduels sont éliminés des médias filtrés, générer une concentration AGNP sur la base du pic caractéristique à environ 390-420 nm ^10. En bref, préparer des aliquotes de AGNPS non filtrés (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, et 0,2 pg / ml comme décrit dans l'étape 3.1) et filtrécontrôle du véhicule (citrate de sodium, 0,04 mM) dans du milieu DMEM sans sérum. Aliquoter 50 ul d'échantillons et les étalons filtrés dans un noir murées plaque de fond clair. L'utilisation d'un spectrophotomètre, mesurer l'absorbance à 390-410 nm et comparer les lectures à la courbe de concentration AGNP. Si les échantillons filtrés ont la même valeur que l'absorbance de l'échantillon témoin du véhicule, on peut supposer AGNPS résiduels sont éliminés.
6. Utilisez la moitié des médias filtrés pour déterminer le TNF-α sécrétion instructions suivantes à partir d'un kit disponible dans le commerce.

5. hypothalamo Entretien de culture cellulaire

1. Chaud DMEM milieu de culture cellulaire supplémenté avec 10% de FBS et 1% PSN à 37 ° C.
2. Obtenir stock congelé de hypothalamique cellules au passage 18 (mHypo-A1 / 2) - 25 stockées à 80 ° C. Rapidement décongeler les cellules dans 37 ° C bain d'eau.
3. Le transfert en douceur les cellules dans un flacon de 75 ^cm2 ventilé contenant 10 ml de milieux de culture cellulaire.
4. Incuber ballon à 5% de CO ₂ à 37 ° C. Aspirer les médias après 24 h et le remplacer par du milieu frais. Cultiver les cellules jusqu'à environ à 70 - 80% de confluence.

6. Détermination de la toxicité cellulaire hypothalamique

1. DMEM chaud et une solution 1x-trypsine-EDTA dans un bain d'eau à 37 ° C.
2. Aspirer le milieu de cellules hypothalamiques et ajouter 500 pi de trypsine. Incuber à 37 ° C pendant 2 à 5 min. Retirer les cellules du flacon à l'aide d'un grattoir tel que décrit ci-dessus à l'étape 2.
3. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et plaque cellules hypothalamiques à 5000 cellules / puits dans un noir murées plaque de fond clair dans un volume final de 200 ul DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% PSN et incuber une nuit à 5% de CO ₂ à 37 ° C .
4. Prélever 100 ul d'anciens supports en utilisant un pipetteur multi-canal et ajouter 100 ul de milieu conditionné concentré filtré, jusqu'à une concentration finale de 1 x.
5. Incuber plaque dans 5% de CO ₂ à 37 ° C pendant 24 heures.
6. Ajouter 221; l de réactif de résazurine et incuber la plaque pendant 20 min dans 5% de CO ₂ à 37 ° C.
7. À l'aide d'un spectrophotomètre multimodes, fiche fluorescence (560 nm EX / 590 nm EM) pour mesurer la viabilité cellulaire. Rapport des résultats comme des unités de fluorescence relative (RFU).

Résultats

Nous montrons que la fonction microglies comme un biocapteur de substitution pour la réponse du cerveau à des nanoparticules en utilisant le protocole ci-dessus. Nos résultats incluent la mesure des effets toxiques de l' activation de la microglie sur la mort des cellules neuronales en aval. La figure 1 montre un flux de travail du protocole pour activer la microglie et de déterminer si les cytokines sécrétées réduisent la viabilité des neurones hypothalamiques. TNF-α la...

Discussion

Des études récentes soutiennent que l’exposition environnementale contribue à l’obésité et à d’autres maladies neurodégénératives ^11,12. Cependant, les techniques utilisées dans les études précédentes prennent du temps et sont coûteuses. Des considérations économiques, des systèmes d’administration physiologiquement pertinents, des problèmes éthiques liés à l’utilisation intensive de modèles animaux in vivo et la difficulté à traduire les résultats en avis de santé significatifs sont quelques-uns des ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cells/Reagents
Lignée cellulaire microgliale de souris (BV2)	Collection de lignées cellulaires Interlab (Gênes, Italie)	ATL03001
Lignée cellulaire d’hypothalamus de souris adulte mHypoA-1/2  ;	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium	Invitrogen	10313-039
Sérum fœtal bovin  ;	PAA Labs	A15-751
Pénicilline/Streptomycine/Néomycine	Thermo Fisher Scientific	15640-055
Trypsine-EDTA	Thermo Fisher Scientific	d’argent
(20 nm)	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	A13262
Souris TNF- et alpha ; ELISA Max Delux	Biolegend	430904
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	L4391
Citrate de sodium	Sigma-Aldrich	S4641
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Equipment
96 W, polystyrène noir, traité pour culture cellulaire, avec couvercle,	Thermo Fisher Scientific	165305
Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-0.5 avec membrane Ultracel-10	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5	Dispositifs moléculaires	M5
Falcon 50 ml Centrifugeuse conique Tubes	Corning, Inc	14-432-22
Falcon Cell Strainers 70 &mu ; m	Corning, Inc	08-771-2
Centrifugeuse de table 5430	Eppendorf	22620560