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Article de méthode

Techniques for Imaging Prométaphase et Metaphase de méiose I fixe

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⸱

DOI :

10.3791/54666

⸱

31 octobre 2016

 , 
1Waksman Institute, Rutgers University, 2Department of Genetics, Rutgers University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons des protocoles pour la collecte, la préparation et l’imagerie d’ovocytes de drosophile matures. Ces méthodes permettent de visualiser le comportement des chromosomes ainsi que l’assemblage et la fonction du fuseau pendant la méiose.

Résumé

La ségrégation des chromosomes dans les ovocytes humains est sujette aux erreurs, entraînant une aneuploïdie, qui est la principale cause génétique de fausses couches et de malformations congénitales. L’étude du comportement des chromosomes dans les ovocytes à partir d’organismes modèles est très prometteuse pour découvrir la base moléculaire de la susceptibilité des ovocytes humains à l’aneuploïdie. Drosophila melanogaster se prête à la manipulation génétique, avec plus de 100 ans de recherche, de communauté et de développement de techniques. La visualisation du comportement des chromosomes et de l’assemblage du fuseau dans les ovocytes de drosophile présente cependant des défis particuliers, principalement en raison de la présence de membranes entourant l’ovocyte qui sont impénétrables aux anticorps. Nous décrivons ici des protocoles pour la collecte, la préparation et l’imagerie de l’assemblage du fuseau de la méiose I et du comportement des chromosomes dans les ovocytes de drosophile, qui permettent la dissection moléculaire de la ségrégation des chromosomes dans cet important organisme modèle.

Introduction

L’étude de la méiose est parfois décrite comme la « génétique de la génétique ». En effet, les propriétés fondamentales de l’hérédité chromosomique et de l’assortiment indépendant sont réalisées par la ségrégation des chromosomes lors de la production de gamètes. Une démonstration importante de la théorie chromosomique de l’hérédité est venue en 1916 des travaux de Calvin Bridges sur Drosophila melanogaster1. Cette étude et d’autres études génétiques classiques chez la drosophile ont grandement contribué à notre compréhension de la génétique. L’examen cytologique des chromosomes méiotiques dans les ovocytes de drosophile a toutefois été difficile. Cela s’explique principalement par le fait que l’immunofluorescence des ovocytes de drosophile à un stade avancé, lorsque le fuseau s’assemble et que les chromosomes sont orientés pour la ségrégation, est entravée par la présence de membranes qui rendent l’ovocyte impénétrable aux anticorps.

Malgré ce défi, les ovocytes de drosophile restent un modèle attrayant pour l’étude du comportement des chromosomes et de l’assemblage du fuseau. Cela est dû aux puissants outils génétiques disponibles chez la drosophile, mais aussi parce que les ovocytes s’arrêtent à la métaphase I, lorsque les chromosomes sont orientés et que le fuseau est complètement formé. Cela facilite la collecte et l’examen d’un grand nombre d’ovocytes à cette étape importante de la division cellulaire. De plus, un organisme modèle simple qui se prête à la manipulation génétique pour l’étude de la ségrégation des chromosomes des ovocytes peut apporter une contribution importante à notre compréhension de la santé reproductive humaine. Les erreurs dans le nombre de chromosomes sont la principale cause génétique de fausse couche et de malformations congénitales chez l’homme2. La majorité de ces erreurs peuvent être attribuées à l’ovocyte et sont corrélées à l’augmentation de l’âge maternel. L’âge moyen des mères aux États-Unis a augmenté, ce qui en fait un problème majeur de santé publique.

Nous décrivons ici des méthodes pour l’examen cytologique des ovocytes de drosophile, y compris une démonstration de la façon d’enlever les membranes ovocytaires. Ces méthodes sont des modifications de protocoles décrits pour la première fois par Theurkauf et Hawley3, Zou et al.4, et Dernburg et al.5. Nous incluons également des méthodes pour l’enrichissement des différents stades des ovocytes, basées sur un protocole décrit pour la première fois par Gilliland et al.6. Planche à voile Enfin, nous ajoutons des instructions pour le traitement médicamenteux des ovocytes de drosophile. Ensemble, ces méthodes permettent l’étude cytologique de la ségrégation des chromosomes de l’ovocyte et de l’assemblage du fuseau chez la drosophile.

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Protocole

Note: Les procédures sont effectuées à la température ambiante, sauf indication contraire. incubateurs à température contrôlée sont utilisés pour maintenir les températures de mouche d'élevage et des croix, sauf indication contraire.

1. Préparatifs

  1. Préparer les mouches.
    1. Prométaphase enrichi les collections ovocyte.
      1. Effacer les mouches adultes de jeunes, actions ou croisées cultures saines. bouteilles d'âge pour les deux jours à 25 ° C.
        NOTE: En général, deux bouteilles saines suffisent, bien que plus peut être nécessaire pour certaines cultures croisées.
      2. Après deux jours, recueillir ~ 100 à 300 femmes (qui sont âgés de 0 à 2 jours à ce stade) des bouteilles. Les femelles ne doivent pas être vierges. Ajouter un peu de pâte de levure sur le côté d'un flacon et placer 30 femelles et 10 à 15 hommes chacun dans les flacons à la levure. flacons d'âge pour les deux jours à 25 ° C.
    2. Metaphase enrichi ovocytes Collections.
      1. Collecter ~ 100 à 300 femelles en stock ou cross cultures. Ajouter un peu de pâte de levure sur le côté d'un flacon et placer 30 femelles chacune (sans mâles ajoutés) dans les flacons à la levure. flacons d'âge pour les trois à cinq jours à 25 ° C.
  2. Préparer Solutions.
    Nota: Les solutions peuvent être conservés indéfiniment à la température ambiante, sauf indication contraire.
    1. Préparer le tampon de modification de Robb (5x): 500 mM de HEPES, 500 mM de saccharose, l'acétate de sodium 275 mM, 200 mM d'acétate de potassium, du glucose 50 mM, du chlorure de magnésium à 6 mM et 5 mM de chlorure de calcium. Utiliser 10 N 11: 8 hydroxyde de sodium et d'hydroxyde de potassium pour amener le pH à 7,4. Stériliser par filtration; n'autoclave pas. Conserver à -20 ° C. Décongeler au besoin pour préparer ~ 200 ml de par ovocyte de préparation 1x Robb.
    2. Solutions de fixation.
      1. Option n ° 1: Préparer le formaldéhyde / heptane fixation. Préparer la fixation du tampon: solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS), ainsi que 150 mM de saccharose. Pour l'utiliser, faire frais avec 687,5 pi Fixation Buffer et 312,5 pi 16% de formaldéhydepar oocyte prép.
        ATTENTION: Porter des gants lors de l'utilisation des solutions de formaldéhyde dans une hotte. Éliminer les déchets selon les directives institutionnelles.
      2. Option n ° 2: Préparer le formaldéhyde / cacodylate fixation. Mélanger la préparation Fix: saccharose 250 mM, 100 mM d'acétate de potassium (pH 7,5), d'acétate de sodium 25 mM (pH 7,0) et 25 mM d'EGTA (pH 8,0). Pour l'utiliser, faire fraîche avec 400 ul Fix Mix, 100 cacodylate ul de potassium (1 M, pH 7,2), et 500 ul de 16% formaldéhyde par ovocyte prep.
        ATTENTION: cacodylate de potassium contient de l'arsenic.
    3. Préparer du PBS / Triton X-100: 1 x PBS + 1% ou 0,05% de Triton X-100. Conserver à 4 ° C.
    4. Préparer du PBS-Tween 20 sérum-albumine bovine (BSA) (TBP): 1 x PBS, BSA à 0,5% (p / v) et 0,1% de Tween-20. Peut être conservé à 4 ° C pendant une semaine.
    5. Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) Solutions.
      1. Préparer le chlorure de sodium-20X citrate de sodium (SSC): 3 M de chlorure de sodium et 0,3 M de citrate de sodium.
      2. Préparer 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC plus 0,1% de Tween-20. Faire frais, ~ 20 ml par ovocyte prep.
      3. Préparer des solutions de formamide: 2x SSC, 0,1% de Tween-20, ainsi que le formamide. Faire frais, 1 ml 20% de formamide, 0,5 ml 40% de formamide, et 2 ml 50% de formamide par ovocyte prep.
        ATTENTION: Porter des gants lors de l'utilisation de solutions de formamide dans une hotte. Éliminer les déchets selon les directives institutionnelles.
      4. Préparer une solution d'hybridation: 2 x SSC, formamide à 50% et 10% de sulfate de dextran (poids / volume). Conserver à 4 ° C.
    6. Sondes FISH.
      1. Ordre des oligonucléotides (voir le tableau 1 pour les séquences) avec une purification par HPLC et désiré 5 'modification fluorescente (par exemple, Cy3 ou Cy5). Remettre en suspension dans du Tris-EDTA (TE) à 50 ng / ul.
        REMARQUE: Protéger oligos d'exposition à la lumière en tout temps.

2. Collection de Late stade Drosophila Ovocytes

  1. Comme oocytes Drosophila avec des membranes intactes collera au plastique et le verre, pré-enduire l'intérieur d'un tube de 5 ml et une pipette Pasteur par ovocyte préparation avec TBP.
  2. Anesthésier toutes ~ 100 à 300 mouches à la levure avec du dioxyde de carbone et d'ajouter à un mélangeur contenant ~ 100 ml de tampon 1X Robb. Pulse trois fois (~ 1 sec chacun). Gardez oocytes à Robb pour <20 min pour éviter l'activation.
    NOTE: Alternativement, les ovocytes peuvent être disséqués à la main à partir de femelles. L'avantage de cette méthode est qu'elle nécessite moins de femelles. Cependant, des précautions doivent être prises pour limiter l' exposition au dioxyde de carbone à seulement quelques minutes pour éviter les artefacts associés à l' hypoxie 7.
  3. Filtrer à travers de grandes mailles (~ 1 500 um) dans 250 ml bécher pour enlever de grandes parties du corps. Si de nombreux abdomens intacts restent sur un matériau maillé, re-grind à l'aide du tampon de Robb supplémentaires, et le filtre à nouveau. Laisser reposer ~ 2 min, puis Aspirer la couche supérieure, en supprimant autant de grandes parties du corps que possible.
  4. Filtre par petites mailles (~ 300 um) dans un bécher de 250 ml. Rincer les ovocytes restants sur premier bêcher en utilisant une pipette Pasteur supplémentaire Robb et enduit. Laisser déposer ~ 3 min; oocytes se déposent. Aspirer tous mais ~ 10 ml.
  5. Pour autant des 10 ml que possible pour enduit tube de 5 ml. Laisser reposer, éliminer le liquide, et répéter avec le reste. Rincer les ovocytes restants sur bêcher en utilisant plus pipette Pasteur Robb et enduit. Laissez installer dans 5 ml tube pour ~ 3-5 min.

3. Les traitements médicamenteux (Facultatif)

  1. Enduire un deuxième tube de 5 ml avec TBP pour chaque préparation de l'ovocyte. Ajouter un solvant approprié (de contrôle) ou d'un médicament à 1 ml de chacun Robb pour chaque préparation de l' ovocyte (tableau 2).
  2. oocytes divisé en deuxième enduit tube de 5 ml. Laisser déposer, retirer le liquide, et ajouter 1 ml Robb plus solvant dans un tube et 1 ml Robb plus de médicament dans second tube. Nutation pour suffisamment de temps pour le traitement médicamenteux (tableau 2). Let régler.

4. Fixation

  1. Aspirer tout liquide et ajouter immédiatement 1 ml Fix.
  2. Option n ° 1: Formaldéhyde / fixation heptane (Fixation Buffer plus 5% de formaldéhyde).
    1. Fixer pendant 2,5 minutes sur un nutator. Ajouter 1 ml heptane et vortex 1 min. Laisser déposer ~ 1 min.
    2. Retirer tout le liquide, puis ajouter 1 ml PBS 1x. Vortex 30 sec. Laisser déposer ~ 1 min.
    3. Retirer tout le liquide, puis remplir le tube avec PBS 1x.
      NOTE: Les ovocytes peuvent être utilisées immédiatement ou conservées sur le nutator pendant plusieurs heures à la température ambiante.
  3. Option n ° 2: Formaldéhyde / cacodylate fixation (Fix Mix plus 8% formaldéhyde et cacodylate 100 mM).
    1. Correction de 6 min sur un nutator. Laisser reposer 2 min. Retirer le liquide, puis remplir le tube avec PBS 1x.
      NOTE: Les ovocytes peuvent être utilisées immédiatement ou conservées sur le nutator pendant plusieurs heures à la température ambiante.

5. Retrait Membranes ( "Rolling")

  1. Utiliser enduit pipette Pasteur, ajouter ~ 500 à 1000 ovocytes à la partie givré (sablé) d'une lame de verre. Retirez toutes les parties du corps et matériaux en utilisant des pinces étrangères. Ne laissez pas sécher les ovocytes; ajouter 1x PBS si nécessaire.
  2. Placez une lamelle sur le dessus des ovocytes et doucement ovocytes «rouler» jusqu'à ce que toutes les membranes sont enlevées (faisant glisser le bord de la lamelle à travers les ovocytes qui fonctionne le mieux.) Contrôler périodiquement les progrès sous le microscope, en ajoutant plus 1x PBS si nécessaire. Faites attention car trop de pression va détruire les ovocytes.
    NOTE: Pour immunofluorescence seulement, passez à l'étape 6. Pour FISH (avec ou sans immunofluorescence), passez à l'étape 7.

6. Anticorps Coloration de Drosophila Ovocytes

  1. Extraction et blocage
    1. Rinçage oocytes roulé dans un tube conique de 15 ml contenant ~ 15 ml de PBS / 1% de Triton X-100. nutation ovocytes présents dans cette solution pendant au moins 1,5 heure et pas plus de 2 heures.Cette étape permet la pénétration des anticorps.
    2. Laissez oocytes régler ~ 2 min. Éliminer le liquide avec le plus grand nombre possible de membranes, puis ajouter du PBS / 0,05% de Triton X-100.
      REMARQUE: Membranes régleront plus lent que les ovocytes laminés.
    3. Laissez oocytes régler ~ 2 min, puis retirez tout mais ~ 1 ml de liquide. oocytes de transfert aux gradués 1,5 ml tube et enlever le liquide restant. Ajouter 1 ml TBP pour bloquer et nutation pendant 1 h.
  2. anticorps Staining
    1. Pré-absorption d'anticorps secondaire contre l'embryon.
      REMARQUE: Cette étape élimine la coloration de fond à partir des interactions anticorps non-spécifiques avec des protéines de drosophile.
      1. Recueillir et fixer des embryons de drosophile (~ 25 pi) par procédure typique 8. Conserver dans le méthanol à -20 ° C.
      2. Éliminer le méthanol à partir d'embryons, ajouter 800 ul de methanol plus 200 ul de 1 x PBS et nutation pendant 15 min. Retirer 500 pi de surnageant et le remplacer par 500 ul PBS 1x. Ensuite nutation pendant 15 min. Répéter deux fois (pour un total de ~ 1 h de lavages), puis terminer en TBP.
        REMARQUE: Embryons peut être utilisé immédiatement ou conservés sur le nutator pendant plusieurs heures à la température ambiante.
      3. Retirer du liquide, remplir de TBP à 200 ul par ovocyte prep, et ajouter des anticorps secondaires marqués par fluorescence à des dilutions appropriées (en gardant à l'esprit que le volume final sera de 300 pi;. Voir étape 7.4) nutation à 4 ° C pendant la nuit (de préférence) ou à la température ambiante pendant 3 à 4 heures.
        NOTE: Les anticorps pré-absorbés seront utilisés à l'étape 6.2.4.
        NOTE: Conserver les échantillons dans l'obscurité, autant que possible, une fois les anticorps fluorescents ont été ajoutés.
    2. Retirer le liquide à partir d'ovocytes, remplir de TBP à 300 pi, et d'ajouter des anticorps primaires à des dilutions appropriées. Nutation à 4 ° C pendant la nuit (de préférence) ou à la température ambiante pendant 3 à 4 heures.
    3. Laver oocytes quatre fois pendant 15 min chacun avec 1 ml TBP.
    4. Retirerliquide à partir d'ovocytes, ajouter 200 pi de surnageant à partir d'embryons (pré-absorption des anticorps secondaires). Remplissez ensuite avec TBP à 300 pi. Nutation à la température ambiante pendant 3 à 4 heures (de préférence) ou à 4 ° C durant la nuit.
    5. Laver oocytes fois pendant 15 minutes avec 1 ml TBP, enlever le liquide. Puis ajouter 0,5 ul Hoechst 33342 et 500 ul TBP et nutation pendant 7 min.
    6. Laver oocytes deux fois 15 min chacun avec 1 ml TBP.
      REMARQUE: Les ovocytes peuvent être montés sur une lame immédiatement ou peuvent être stockés dans la TBP à 4 ° C jusqu'au moment de l'imagerie.

7. FISH (Continuer à partir de l'étape 5 ci-dessus)

  1. Rincer oocytes roulé dans un tube conique de 15 ml contenant ~ 15 ml 2x SSCT. Laissez oocytes régler ~ 2 min. Retirez tous, mais ~ 0,5 ml de liquide avec autant de membranes que possible.
    REMARQUE: Membranes régleront plus lent que les ovocytes laminés.
  2. Transfert des ovocytes à 0,5 ml tube et enlever le liquide restant. Successivement ajouter et supprimer 500 pi20%, 40% et 50% des solutions de formamide nutation pendant 10 minutes dans chaque solution.
    NOTE: Les ovocytes se déposent plus lentement avec des pourcentages plus élevés de formamide.
  3. Éliminer le liquide, puis ajouter une solution de 500 pi de formamide à 50%, et de nutation à 37 ° C pendant 1 à 5 heures.
    NOTE: Longer incubations se traduisent par une meilleure pénétration de la sonde.
  4. Enlever le liquide, en laissant pas plus de ~ 100 ovocytes pi, et d' ajouter 36 ul de solution d'hybridation plus 2 pi de sonde (50 ng / ul) et 2 ul d'eau et 2 ul d'une sonde 2 ème (tableau 1).
  5. Incuber à 91 ° C pendant 3 min (poissons) ou 80 ° C pendant 20 min (FISH en plus immunofluorescence), suivie d'une incubation dans un bain d'eau à 37 ° pendant une nuit.
    REMARQUE: Ces étapes peuvent être réalisées dans un thermocycleur.
  6. Ne pas enlever le liquide. Ajouter 500 ul de solution à 50% de formamide et nutation à 37 ° C pendant 1 heure.
  7. Laisser déposer, retirer le liquide, ajouter la solution de formamide 500 ul de 50%, uned nutation à 37 ° C pendant 1 heure.
  8. Laisser déposer, retirer le liquide, ajouter la solution de formamide 500 ul de 20%, et nutation à la température ambiante pendant 10 min.
  9. Effectuer trois lavages rapides dans 500 ul 2x SSCT (laisser se décanter enlever puis ajouter le liquide, inverser plusieurs fois, répéter.) Laisser déposer, retirer le liquide, puis ajouter 500 ul TBP et nutation pendant 4 heures.

8. Anticorps Coloration après FISH

  1. Retirer le liquide à partir d'ovocytes, remplir de TBP à 300 pi, et ajouter 10 ul d'anticorps anti-α-tubuline conjugué à FITC. En variante, d'autres anticorps peuvent être utilisés, suivant le protocole ci-dessus. Nutation à la température ambiante pendant une nuit.
  2. Laver oocytes fois pendant 15 minutes avec 500 ul TBP, enlever le liquide, puis ajouter 0,5 ul Hoechst 33342 et 500 ul TBP et nutation pendant 7 min.
  3. Laver deux fois oocytes pendant 15 minutes chacun avec 500 ul TBP.
    NOTE: Les ovocytes peuvent être montés sur une lame immédiatement ou peuvent être stockés dans TBP à 4 ° C jusqu'au moment deimagerie. Gardez oocytes dans l'obscurité, autant que possible, une fois les anticorps fluorescents ont été ajoutés.
Répéter Nom Chromosome Oligo Sequence *
359 X GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC
AACAC 2 AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC
dodéca 3 CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT
1.686 2 + 3 AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT 4 (+ Y) AATATAATATAATATAATATAATATAATAT
* 359 séquence d'Eric Joyce, communication personnelle, d' autres séquences de Sullivan et al. 8

Tableau 1: sondes FISH pour Drosophila répétitions centromériques.

Drogue Solvant Concentration en Stock La concentration finale Durée du traitement Effet
colchicine éthanol 125 mM 150 um 10 min ou 30 min déstabiliser non-kinétochore (10 min) 9 ou toutes (30 min) microtubules
paclitaxel DMSO 10 mM, 10 pm 10 minutes stabiliser microrotubules
Binucleine 2 DMSO 25 mM, 25 pm 20 min inhiber la kinase Aurora B 10

Tableau 2: Le traitement médicamenteux.

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Résultats

Les méthodes que nous avons décrites ici se traduira par la collecte des ovocytes chez la drosophile stade avancé représentant trois étapes de la méiose (Figure 1). Oocytes dans la prophase se distinguent par la présence de l'enveloppe nucléaire, qui est visible par l'absence de signal de la tubuline dans la région entourant le caryosome (figure 1A). Prométaphase est la période après enveloppe ventilation nucléaire au cours de l...

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Discussion

Staging Drosophila Ovocytes

Bien qu'un caryosome allongé est souvent vu dans les ovocytes prométaphase, en utilisant caryosome forme pour distinguer prométaphase à partir d'ovocytes en métaphase peut être problématique. Pendant prométaphase, l'caryosome commence comme une forme ronde, allonge, puis se rétracte à une forme ronde comme l'ovocyte se rapproche de l'arrestation de métaphase. Cela signifie que de nombreux ovocytes prométaphase ne dispo...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Christian Lehner pour avoir fourni l’anticorps CENP-C et Eric Joyce pour ses recommandations sur FISH. Les travaux dans le laboratoire McKim ont été financés par une subvention des NIH (GM101955).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes coniques de 15 mlDivers
16 % de formaldéhydeTed Pella, Inc.18505DANGEREUX ; une fois ouvert, jeter au bout d’un mois
Béchers de 250 mlDivers
tubes de 5 mlDiverses
levures sèches activesDiversmélanger avec de l’eau pour obtenir une pâte de la consistance d’un
anticorps anti-&alpha ;-tubuline de beurre de cacahuète conjugué à FITCSigmaF2168clone DM1A
Binucléine 2SigmaB1186MÉLANGEUR DANGEREUX
Divers
albumine sérique bovineSigmaA4161
chlorure de calciumDivers
colchicineSigmaC-9754
lamellesVWR48366-227n° 1 1/2
sulfate de dextranDivers
DMSODivers
EGTADivers
éthanolDiverses
pincesTed Pella, Inc.5622Pince à épiler Dumont haute précision style 5
formamideSigma47670-250ML-F
lames de verreVWR48312-003
glucoseDivers
tubes gradués de 1,5 mlDivers
HEPESVWREM-5330disponible chez plusieurs vendeurs
Hoechst 33342Divers
chlorure de magnésiumDivers
méthanolDivers
grandes mailles (~1 500 & micro ; m)VWRAA43657-NKvariété de formats et d’autres fournisseurs, 12 ou 14 mailles
petites mailles (~ 300 & micro ; m)Spectrum labs146 424variété de formats, p. ex., 146 422 ou 146 486
nutatorDivers
pipettes PasteurDivers
acétate de potassiumDivers
Acide cacodyliqueSigmaC0125DANGEREUX ; alternativement, le cacodylate de sodium peut être substitué au
potassium hydroxydeDivers
acétate de sodiumDivers
chlorure de sodiumDivers
citrate de sodiumDivers
hydroxyde de sodiumDivers
saccharoseDivers
taxol (paclitaxel)SigmaT1912DANGEREUX
Triton X-100FisherPI-28314
Tween 20FisherPI-28320
vortexDivers
DANGEREUSES

Références

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  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
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  7. Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544(2009).
  8. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
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  10. Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
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