Des études de la morphogenèse neuronale utilisant la drosophile arborisation dendritique larvaire (da) neurones bénéficient de la visualisation in situ des protéines neuronales et épidermiques par immunofluorescence. Nous décrivons un procédé qui permet d'améliorer l'analyse par immunofluorescence des neurones DA et des cellules épidermiques entourant en retirant le tissu musculaire de la paroi du corps de la larve.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Larvaires arborisation dendritique (da) neurones de drosophile sont un modèle populaire pour les mécanismes de la morphogenèse neuronale enquête. Neurones Da se développent dans la communication avec les cellules de l' épiderme , ils innervent et donc leurs avantages de l' analyse de la visualisation in situ des deux protéines neuronal et épidermique exprimées par immunofluorescence. Les méthodes traditionnelles de préparation des filets larvaires pour les expériences d'immunofluorescence laissent intact le tissu musculaire qui couvre la majeure partie de la paroi du corps, présentant plusieurs défis à l'imagerie des protéines neuronales et épidermiques. Nous décrivons ici un procédé pour éliminer le tissu musculaire à partir des filets de Drosophila larves. Ce protocole permet l'imagerie des protéines qui sont autrement occulté par le tissu musculaire, améliore le rapport signal à bruit, et facilite l'utilisation de nanoscope pour étudier da développement des neurones.
Introduction
Larvaires arborisation dendritique (da) neurones de drosophile fournissent un excellent modèle pour l' étude du développement neuronal en raison de leur susceptibilité à la manipulation génétique et la facilité avec laquelle ils peuvent être visualisés. Ces neurones sensoriels ont joué un rôle dans l'identification de nombreuses voies qui contrôlent dendrites morphogenèse 1-3.
Quatre classes de neurones DA (classe I - IV) innervent l'épiderme larvaire. Ces neurones se trouvent entre la membrane basale et l'épiderme, avec leurs dendrites formant matrices bidimensionnelles en grande partie à 4,5.
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Protocole
Remarque: La procédure de destitution musculaire (Figure 1) est une modification des méthodes décrites précédemment pour la préparation des filets larvaires. Les étapes qui précèdent et suivent le retrait du muscle sont décrites brièvement et le lecteur est renvoyé aux travaux antérieurs 10, 11 pour des descriptions plus détaillées.
1. Disséquer Larve dans une solution saline froide
- Préparer une dilution de travail de solution saline froide HL3.1 15 ou Ca 2+ froid -free HL3.1 saline 11 (tableau 1). Placez la larve dans un plat en élastomère de silicon....
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Résultats
Nous démontrons l'utilité de la procédure de retrait des muscles pour améliorer le rapport signal sur bruit dans des expériences d'immunofluorescence pour co-visualiser les protéines cloisonnées de jonction Coracle (Cora) et disques-large (DLG) ainsi que des neurones da classe IV marquées avec le marqueur membranaire CD4- tdTomato.
Cora a déjà été utilisé pour identifier les secteurs où da dendrites neuronales sont entourées par des cellules de l'.......
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Discussion
Ici , un protocole est décrit pour le retrait manuel du tissu musculaire à partir des filets de Drosophila larves. Ce protocole modifie précédemment décrit les techniques de dissection larvaires 10,11. Après la larve est disséquée dans un plat en élastomère de silicone, la ligne médiane dorsale est située. Une pince à broche unique, dans son orientation la plus plane possible, est soigneusement inséré entre le tissu musculaire et l'épiderme, à proximité de la ligne médiane dorsale. Les pinces son.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Nous remercions Gary Laïevski pour des discussions utiles sur la microscopie. Ce travail a été financé par le NIH accorde R01GM061107 et R01GM067758 à ERG
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Pince à épiler Dumont #5 | Microscopie électronique Sciences | 72701-D | |
| Micro ciseaux, 8 cm, droite, lames de 5 mm, pointes de 0,1 mm | World Precision Instruments | 14003 | |
| Kit d’élastomère de silicone Sylgard 184 | Dow Corning | 3097358-1004 | pour la dissection de plaques |
| Épingles à insectes Austerlitz, 0,1 mm | Outils de science fine | 26002-10 | |
| Source lumineuse Fostec 8375 | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopie | ||
| Vectashield support de montage anti-décoloration | Vector Laboratories | H-1000 | pour la microscopie confocale |
| Prolong Diamond monteur anti-décoloration | Life Technologies | P36970 | pour la microscopie à éclairage structuré |
| Micro verre de couverture, 22 x 22 mm, n° 1,5 | VWR | 48366-227 | |
| Lames de microscope Superfrost Plus, 25 x 75 x 1,0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Anticorps anti-Coracle de souris | Études sur le développement Banque d’hybridomes | C615.16 | surnageant, dilué 1:50 |
| Antidisques de souris anticorps grand Études | sur le développement Banque d’hybridomes | 4F3 | surnageant, dilué 1:50 |
| Lapin anticorps anti-dsRed | Clontech | 632496 | dilué 1:1 000 |
| Anticorps anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 568 conjugué | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilué 1:1 000 |
| Anticorps anti-souris de chèvre, Alexa Fluor 488 conjugué | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilué 1:500 |
Références
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
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Réimpressions et autorisations
