Mesure parallèle d'expression Circadian Clock génique et la sécrétion d'hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Résumé

Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.

Résumé

Les horloges circadiennes sont fonctionnelles dans tous les organismes sensibles à la lumière, ce qui permet une adaptation au monde extérieur, en anticipant les changements environnementaux quotidiennes. Des progrès considérables dans notre compréhension de la connexion étanche entre l'horloge circadienne et la plupart des aspects de la physiologie ont été réalisés dans le domaine au cours de la dernière décennie. Cependant, effilocher la base moléculaire qui sous-tend la fonction de l'oscillateur circadien chez l'homme reste de la plus haute défi technique. Ici, nous fournissons une description détaillée d'une approche expérimentale à long terme (2-5 jours) enregistrement bioluminescence et de collecte de moyen d'écoulement dans les cellules primaires humaines en culture. A cet effet, nous avons transduit des cellules primaires avec un reporter de luciférase lentivirale qui est sous le contrôle d'un promoteur de gène d'horloge de base, ce qui permet l'évaluation parallèle de la sécrétion d'hormones et de bioluminescence circadien. En outre, nous décrivons les conditions pour perturber l'horloge circadienne dans prcellules humaines imary en transfectant siRNA CLOCK ciblage. Nos résultats sur la régulation circadienne de la sécrétion d'insuline par les îlots pancréatiques humains, et Myokine la sécrétion par les cellules musculaires squelettiques humaines, sont présentés ici pour illustrer l'application de cette méthodologie. Ces paramètres peuvent être utilisés pour étudier la composition moléculaire des horloges périphériques humaines et d'analyser leur impact fonctionnel sur les cellules primaires dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques.

Introduction

Le système de chronométrage circadien (du latin "Circa diem") a vu le jour dans tous les organismes sensibles à la lumière, comme un mécanisme d' adaptation à la rotation de la Terre. Chez les mammifères, elle est organisée de façon hiérarchique, qui englobe l'horloge centrale, qui est située dans le noyau suprachiasmatique de l'hypothalamus ventrale et périphérique (ou esclave) qui sont des oscillateurs fonctionnant dans différents organes. En outre, ces oscillateurs autonomes auto-entretenues cellules sont fonctionnelles dans presque toutes les cellules du corps ^1. Signaux photiques représentent un signal de synchronisation dominant ....

Protocole

Déclaration éthique: Manipulations inclus dans ce protocole ont été approuvés par le comité d' éthique de l'hôpital universitaire de Genève et par l'éthique Comité SUD EST IV (Accord 12/111) ^19. Les îlots humains ont été isolés à partir de pancréas de donneurs multi-organes de mort cérébrale dans le Centre de transplantation Islet à l'hôpital universitaire de Genève (Suisse) , comme décrit par nous dans les références ^16,18, ou obtenu à partir d' une source commerciale.

1. Préparation de la culture cellulaire primaire

1. Isolement îlots pancréatiques humaines, Dissociation et Culture

Résultats

Évaluation de l'Islet Hormone Sécrétion avec Parallel Circadian bioluminescence Enregistrement à partir de cellules Perifused îlots humains

Après avoir fourni une première caractérisation moléculaire de l'horloge circadienne, fonctionnant dans des cellules d'îlots humains ^16, nous avons pour but d'étudier l'impact de la perturbation de l' horloge sur la fonction des îlots et la transcription ^18. Nous mett.......

Discussion

Les paramètres expérimentaux décrits ici sont composés de livraison lentiviral de reporters de bioluminescence circadiens dans des cellules primaires humaines en culture, suivie par une synchronisation ultérieure in vitro et l' enregistrement continu de bioluminescence pendant plusieurs jours, et l' analyse parallèle de la sécrétion d' hormones par les mêmes cellules. Ils représentent une approche efficace pour explorer les mécanismes moléculaires et les aspects fonctionnels des horloges circadienne.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25300-054	Pour la digestion par biopsie musculaire
DPBS pas de calcium pas de magnésium	Invitrogen	14190-094
HAM F-10	Invitrogen	41550-021	Pour la culture de myoblastes
FBS	Invitrogen	10270	Complément au milieu de culture
Pénicilline-Streptomycine	Sigma	P0781-100	Complément au milieu de culture
Gentamycine	Axone  ;	A1492.0001	Complément au milieu de culture
Fungizone	Invitrogen	15290-026	Amphotéricine B, complément au milieu de culture
DMEM 1g/L de glucose + Na pyruvate + glutamax  ;	Invitrogen	21885-025	Pour la culture de myotubes
DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax	Invitrogen	11880-028	Support d’enregistrement pour LumiCycle
Glutamax	Invitrogen	35050-028	L-alanyl-L-glutamine dipeptide, complément au milieu d’enregistrement
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104	Solution de détachement cellulaire, pour la dissociation des cellules des îlots
CMRL	Gibco	21530-027	Milieu de culture pour cellules d’îlots pancréatiques
Pyruvate de sodium	Gibco	11360-039	Complément au milieu de culture
15 ml Tube conique en polypropylène haute clarté	Falcon	352096
F75 Flacon	BD Falcon 353136
3,5 cm Boîte de Pétri	BD Falcon	353001
Foskolin	Sigma	F6886	Activateur d’adénylyl cyclase, utilisé pour la synchronisation
Luciferin	Prolume LTD	260150	Complément au support d’enregistrement
OptiMEM  ;	Invitrogen	51985-026	Sans sérum Minimal Essential Medium (MEM) utilisé pour la transfection de cellules d’îlots pancréatiques humains
Réactif de lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150	Réactif de transfection
HiPerFect Réactif	transfection	Qiagen	301705
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool  ;	Dharmacon	L-008212-00
ON-TARGET plus siRNA #1 non ciblé (siControl)	Dharmacon	D-001810-01
DNeasy Blood & Kit de mouchoirs  ;	Qiagen	69504	Pour l’extraction d’ADN de myotubes
RNeasy Plus Mini kit  ;	Qiagen	74104	Pour l’extraction d’ARN de myotubes
QIAshredder  ;	Qiagen	79654	Pour l’extraction de l’ARN des myotubes
Tubes collecteurs de 2 ml	Axygen	311-10-051	Pour collecter le milieu avec la périfusion Plaque de
culture tissulaire, 6 puits	BD Falcon  ;	353046	Pour prélever le milieu avec le kit de périfusion
RNeasy Plus Micro	Qiagen	74034	Pour l’extraction de l’ARN des îlots de Langerhans
Humain IL-6 Kit ELISA instantané  ;	eBioscience	88-7066-22
Kit d’insuline humaine Mercodia	Mercodia	10-1113-01
Acide chlorhydrique, min,37 %,p.a.	Acros organics	124630010	Utilisé pour la préparation du tampon de lyse (375 ml Éthanol + 7,5 % HCl + 117,5 % H2O)
Éthanol (>99,8 %)	Fluka Analytical	02860-1L	Utilisé pour la préparation du tampon de lyse (375 ml Éthanol + 7,5 % HCl + 117,5 % H2O)
Îlots humains pour la recherche	Prodo Laboratories
Name	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Equipment :
Centrifugeuse	Heraeus	Megafuge 1.0R
Bain-marie	VWR	1112A	; à 37 ° ; C
Tissu culture hood	Faster  ;	SafeFastElite
Incubateur de culture de tissu	Heraeus	HeraCell 150	5 % CO2 à 37 ° ; C, pas d’eau grâce à l’installation LumiCycle
Incubateur de culture Tissu	Heraeus	HeraCell 150	5 % CO2 à 37 ° ; C, pas d’eau grâce à l’installation LumiCycle
Tissu culture incubateur	Thermo Scientific	Hera Cell 150i	5 % CO2 à 37 ° ; C
Shaker	Heidolph Instruments	Unimax 1010	Pour l’agitation du mélange de siRNA
LumiCycle	Actimetrics
Logiciel LumiCycle	Actimetrics
CosinorJ	logiciel EPFL		Disponible gratuitement sur : http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX  ;	ERC GmbH		Logiciel de commande qui contrôle la synchronisation du changement automatique