Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Volodymyr Petrenko; Camille Saini; Laurent Perrin; Charna Dibner

doi:10.3791/54673

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Article de méthode

Mesure parallèle d'expression Circadian Clock génique et la sécrétion d'hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

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DOI :

10.3791/54673

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11 novembre 2016

Volodymyr Petrenko^*¹ , Camille Saini^*² , Laurent Perrin^*¹ , Charna Dibner¹

¹Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), ²Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.

Résumé

Les horloges circadiennes sont fonctionnelles dans tous les organismes sensibles à la lumière, ce qui permet une adaptation au monde extérieur, en anticipant les changements environnementaux quotidiennes. Des progrès considérables dans notre compréhension de la connexion étanche entre l'horloge circadienne et la plupart des aspects de la physiologie ont été réalisés dans le domaine au cours de la dernière décennie. Cependant, effilocher la base moléculaire qui sous-tend la fonction de l'oscillateur circadien chez l'homme reste de la plus haute défi technique. Ici, nous fournissons une description détaillée d'une approche expérimentale à long terme (2-5 jours) enregistrement bioluminescence et de collecte de moyen d'écoulement dans les cellules primaires humaines en culture. A cet effet, nous avons transduit des cellules primaires avec un reporter de luciférase lentivirale qui est sous le contrôle d'un promoteur de gène d'horloge de base, ce qui permet l'évaluation parallèle de la sécrétion d'hormones et de bioluminescence circadien. En outre, nous décrivons les conditions pour perturber l'horloge circadienne dans prcellules humaines imary en transfectant siRNA CLOCK ciblage. Nos résultats sur la régulation circadienne de la sécrétion d'insuline par les îlots pancréatiques humains, et Myokine la sécrétion par les cellules musculaires squelettiques humaines, sont présentés ici pour illustrer l'application de cette méthodologie. Ces paramètres peuvent être utilisés pour étudier la composition moléculaire des horloges périphériques humaines et d'analyser leur impact fonctionnel sur les cellules primaires dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques.

Introduction

Le système de chronométrage circadien (du latin "Circa diem") a vu le jour dans tous les organismes sensibles à la lumière, comme un mécanisme d' adaptation à la rotation de la Terre. Chez les mammifères, elle est organisée de façon hiérarchique, qui englobe l'horloge centrale, qui est située dans le noyau suprachiasmatique de l'hypothalamus ventrale et périphérique (ou esclave) qui sont des oscillateurs fonctionnant dans différents organes. En outre, ces oscillateurs autonomes auto-entretenues cellules sont fonctionnelles dans presque toutes les cellules du corps ^1. Signaux photiques représentent un signal de synchronisation dominant ....