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Article de méthode

La boucle artério (AV) dans un modèle Small Animal pour étudier l'angiogenèse et du génie tissulaire vascularisé

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DOI :

10.3791/54676

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2 novembre 2016

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1Department of Plastic and Hand Surgery and Laboratory for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital of Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), 2Genetic Engineering and Biotechnology Institute for Postgraduate Studies, Baghdad University, 3Department of Plastic, Hand and Microsurgery, Sana Klinikum Hof GmbH

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode microchirurgie pour la génération d'une boucle artérioveineuse (AV) en tant que modèle pour l' analyse de la vascularisation in vivo dans un environnement isolé et bien caractérisés. Ce modèle est non seulement utile pour l'étude de l'angiogenèse, mais est également parfaitement adaptée pour l'ingénierie axialement vascularisé et les tissus transplantables.

Résumé

Un réseau de vaisseaux sanguins fonctionnel est une condition préalable à la survie et à la croissance de presque tous les tissus et organes du corps humain. De plus, dans des situations pathologiques telles que le cancer, la vascularisation joue un rôle prépondérant dans la progression de la maladie. Par conséquent, il existe un fort besoin d’un modèle in vivo standardisé et bien caractérisé afin d’élucider les mécanismes de la néovascularisation et de développer différentes approches de vascularisation pour l’ingénierie tissulaire et la médecine régénérative.

Nous décrivons une approche microchirurgicale pour un petit modèle animal pour l’induction d’un axe vasculaire composé d’une veine et d’une artère qui sont anastomosées à une anse artérioveineuse (AV). La boucle AV est transférée dans une chambre d’implantation fermée pour créer un microenvironnement isolé in vivo, qui n’est relié à l’organisme vivant que par le biais de l’axe vasculaire. Grâce à l’imagerie 3D (IRM, micro-TDM) et à l’immunohistologie, la croissance vasculaire peut être visualisée au fil du temps. En implantant différentes cellules, facteurs de croissance et matrices, leur fonction dans la formation du réseau de vaisseaux sanguins peut être analysée sans aucune influence perturbatrice de l’environnement dans un environnement bien contrôlable.

Outre les études d’angiogenèse et d’antiangiogenèse, le modèle de boucle AV est également parfaitement adapté à l’ingénierie des tissus vascularisés. Après un certain temps de prévascularisation, les tissus générés peuvent être transplantés dans le site du défaut et connectés microchirurgicalement aux vaisseaux locaux, assurant ainsi un apport sanguin immédiat et l’intégration du tissu modifié. En faisant varier les matrices, les cellules, les facteurs de croissance et l’architecture de la chambre, il est possible de générer différents tissus, qui peuvent ensuite être adaptés aux besoins de chaque patient.

Introduction

La plupart des tissus et des organes du corps humain dépendent d'un réseau de vaisseaux sanguins fonctionnels qui fournit des nutriments, échange des gaz et supprime les déchets. Dysfonctionnement du système causé par des problèmes vasculaires locales ou systémiques peut conduire à une multitude de maladies graves. En outre, dans des domaines de recherche tels que l'ingénierie tissulaire ou la médecine régénérative, un réseau de vaisseaux sanguins dans les tissus fonctionnels générés artificiellement ou organes transplantés est indispensable pour une application clinique réussie.

Pendant des décennies, les chercheurs ont étudié les mécanismes exacts impliqués dans la vascularisation de plus en plus d'avoir un aperçu plus profond dans des situations pathologiques afin de trouver de nouvelles interventions thérapeutiques et de fournir une meilleure prévention des troubles vasculaires. Dans la première étape, les procédés de base tels que les interactions cellule-cellule ou l'effet de molécules sur les cellules du système vasculaire sont généralement étudiés en 2D ou en 3D in vitroexpériences. Les modèles traditionnels 2D sont faciles à réaliser, sont bien établis et ont grandement contribué à une meilleure compréhension de ces processus. Pour la première fois en 1980, Folkman et al. rapporté angiogenèse in vitro l' ensemencement de cellules endothéliales capillaires sur des plaques revêtues de gélatine 1. Cela a immédiatement cédé la place à la publication d'une multitude d'autres expériences 2D de l' angiogenèse sur le tube de cellules endothéliales formation test 2, la migration test 3 et la co-culture de différents types de cellules 4, ainsi que d' autres. Ces essais sont encore utilisés aujourd'hui et acceptées comme standard dans les méthodes in vitro.

Cependant, cette configuration expérimentale est pas toujours approprié pour l'étude du comportement in vivo de cellules puisque la plupart des types de cellules ont besoin d' un environnement 3D pour former des structures physiologiques pertinentes des tissus 5. On a pu montrer que l'architecture de la matrice 3D est déterminante pour capillaire morphogenesis 6 et que la matrice cellulaire (ECM) interactions cellulaires-extra et la culture 3D conditions régissent les facteurs importants impliqués dans l' angiogenèse tumorale 7. La matrice 3D fournit des entrées mécaniques complexes, peuvent lier des protéines effectrices et établir des tissus à l'échelle des gradients de concentration de soluté. En outre, il est jugé nécessaire afin d'imiter en morphogénétique vivo et étapes de remodelage dans les tissus complexes 5. Dans ces systèmes, à la fois l'angiogenèse et la vasculogenèse peuvent être étudiés. Alors que l' angiogenèse décrit le bourgeonnement des capillaires à partir de vaisseaux sanguins préexistants 8, vasculogenèse se réfère à la formation de novo des vaisseaux sanguins par les cellules endothéliales ou leurs progéniteurs 9,10. Maturation des navires est décrite dans un processus appelé «artériogenèse» via le recrutement de cellules musculaires lisses 11. Un angiogénique typique modèle in vitro est le bourgeonnement des cellules endothéliales de monocouche existantess ensemencée en monocouche sur une surface de gel, sur la surface des microsphères noyées dans un gel ou en construisant des sphéroïdes de cellules endothéliales 12. Dans les modèles vasculogéniques cellules endothéliales simples sont piégés dans un gel 3D. Ils interagissent avec les cellules endothéliales adjacentes pour former des structures et des réseaux de novo vasculaires, généralement en combinaison avec des cellules de soutien 12.

Cependant, même en 3D complexes modèles in vitro ne peuvent pas imiter dans les paramètres in vivo complètement donné la multitude de cellule-cellule et cellule-ECM Interactions 13. Les substances ayant une forte activité in vitro ne montrent pas automatiquement les mêmes effets in vivo et vice versa 14. Pour une analyse complète de la vascularisation traite il y a un besoin urgent de développer des modèles in vivo que mieux simuler la situation dans le corps. Une large gamme d'essais in vivo de l' angiogenèse sont décrits dans la littérature, y compris lapoussin test chorio membranaire (CAM), le modèle zebrafish, le dosage de l' angiogenèse de la cornée, le modèle de sac d'air dorsal, la chambre dorsale du pli cutané, les modèles de tumeurs sous - cutanées 14. Cependant, ces tests sont souvent associés à des limitations, telles que des changements morphologiques rapides, des problèmes dans de nouveaux capillaires distinctifs de ceux qui existent déjà dans l'essai de CAM, ou l'espace limité dans le dosage de l' angiogenèse cornéenne 15. En outre, les systèmes non-mammifères sont utilisés (par exemple., Le modèle zebrafish 16), ce qui conduit à des problèmes dans la xénotransplantation 17. Dans le modèle de tumeur sous-cutanée, l'angiogenèse provenant uniquement de la tumeur elle-même ne peut être analysée puisque les tissus adjacents contribue fortement au processus de vascularisation. En outre, le tissu environnant peut avoir un rôle décisif dans la formation du microenvironnement de la tumeur 18.

Non seulement pour l'étude de l'angiogenèse ou la vasculogenèse est-il une forte need pour un standard et bien caractérisé en ce modèle in vivo , mais également pour l' étude des différentes stratégies de vascularisation dans l' ingénierie tissulaire et la médecine régénératrice. De nos jours, la production d'organes ou de tissus artificiels complexes est possible à la fois in vitro et in vivo. Bioprinting 3D fournit une technique à la demande de fabrication pour la production 3D complexes tissus vivants fonctionnels 19. En outre, les bioréacteurs peuvent être utilisés pour générer des tissus 20 ou même le corps propre peut être utilisé comme bioréacteur 21. Cependant, le principal obstacle à l'application réussie de tissus générés artificiellement est l'absence de vascularisation dans les constructions artificielles. Connexion immédiate à la vascularisation de l'hôte après la transplantation est une condition préalable importante pour la survie, en particulier dans le cas des tissus ou des organes artificiels à grande échelle.

In vitro ou différent dans les stratégies de prévascularisation vivo ont été déveau point pour établir une microvascularisation fonctionnelle dans des constructions avant l'implantation 22. L'implantation d'un échafaudage avec des capillaires in vitro par génie préformées sur la peau dorsale de souris a conduit à une anastomose rapide du système vasculaire de la souris dans un 23 jour. En revanche, une co-culture de sphéroïdes comprenant des cellules souches mésenchymateuses humaines et des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine assemblés en un réseau tridimensionnel prévasculaire développé davantage après implantation in vivo. Cependant, anastomose avec la vascularisation hôte a été limitée 24. Surtout, des défauts mal vascularisés, comme les zones nécrotiques ou irradiés, cette soi-disant vascularisation extrinsèque - la croissance de vaisseaux de la région environnante dans l'échafaudage - échoue souvent. Vascularisation intrinsèque, d'autre part, est situé sur un axe vasculaire en tant que source de nouveaux capillaires poussent dans l'échafaudage 25. En utilisant l'approche de la vascularisation axiale, L'ingénierie tissulaire peut être transplanté avec son axe vasculaire et relié aux navires locaux sur le site destinataire. Immédiatement après la transplantation, le tissu est suffisamment pris en charge par l'oxygène et de nutriments, ce qui crée les conditions d'une intégration optimale.

En raison de la disponibilité limitée des modèles d'enquête sur l' angiogenèse in vivo et dans la reconnaissance de l'importance croissante de générer des tissus axialement vascularisé, nous avons développé l'approche microchirurgicale de Erol et Spira en outre pour générer un artérioveineuse (AV) boucle dans le modèle animal 26. L'utilisation d'une chambre d'implantation complètement fermée rend ce procédé très bien adapté pour étudier la formation des vaisseaux sanguins sous "contrôlée", bien caractérisés dans des conditions in vivo (figure 1). Ce modèle est non seulement utile pour l'étude de l'angiogenèse, mais est également parfaitement adaptée pour la vascularisation axiale de échafauds pour engin de tissudes fins ingé-.

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Protocole

Le Comité des soins aux animaux de l'Université Friedrich-Alexander d'Erlangen-Nuremberg (FAU) et le gouvernement du Moyen-Franconie, Allemagne, a approuvé toutes les expériences. Pour les expériences, des rats Lewis mâles avec un poids corporel de 300-350 g ont été utilisés.

1. La artério boucle Modèle dans le Rat

  1. Implantation Procédure (Figure 2)
    1. Pour l' anesthésie utiliser une boîte en plastique spécial qui est relié par un tube au vaporisateur isoflurane et fermé par un couvercle. Allumez le gaz d'alimentation et le débitmètre entre 0,8 à 1,5 L / min.
    2. Placez le rat dans la boîte en plastique d'induction et sceller le dessus. Allumez vaporisateur isoflurane à 5%.
    3. Observer attentivement le rat pendant l'induction de l'anesthésie. Après 3 - 4 min, le rat sera anesthésié.
    4. Confirmer l'anesthésie appropriée: la perte du réflexe de redressement, la perte de réflexe palpébral, réflexe de retrait, réflexe cornéen positif.
    5. Retirez le rat de la boîte et vérifiez sonpoids pour le calcul des médicaments. Appliquer une pommade oculaire pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
    6. Administrer des médicaments de la douleur et des antibiotiques (par exemple., 7,5 mg / kg par voie sous cutanée enrofloxacine (sc), 12,5 mg / kg tramadol et 100 mg / kg par voie intraveineuse à la fois metamizole (iv)). Administrer cristalloïdes poids adapté pendant le fonctionnement (par exemple., 30 ml / kg sc).
    7. Placez le rat sur son dos sur une plaque chauffante à 37 ° C sous anesthésie avec 1 - 2% d' isoflurane inhalation administrée par masque.
    8. Surveiller l'anesthésie correctement et augmenter isoflurane si le niveau d'anesthésie est trop faible (mouvement du rat, la réponse à la douleur, à la mâchoire ton, sans perte de réflexes (voir 1.1.4.), La fréquence cardiaque croissante). Veillez à ne pas surdoser isoflurane (perte de réflexes cornéens, fréquence cardiaque élevée, diminution de la saturation en oxygène). Utiliser une oxymétrie de pouls particulier pour les petits animaux pour le contrôle de la saturation en oxygène (95-100%) et la fréquence cardiaque (250-450 / min) du rat. Au cours des operatià surveiller la température du rat (36 - 40 ° C) et régler la température de la plaque chauffante si nécessaire.
    9. Raser les côtés intérieurs des pattes arrière avec un rasoir électrique et désinfecter la zone avec des antiseptiques. Répartir les membres postérieurs et les fixer avec du ruban adhésif.
    10. Poser le rat sous un microscope chirurgical et couvrir le rat avec drapage stérile. Faire en sorte que l'ensemble de la procédure d'opération est réalisée dans des conditions stériles.
    11. Ouvrir la peau, au milieu de la cuisse gauche avec une incision longitudinale du genou supérieure à l'aine en utilisant un scalpel (n ° 10).
    12. Couper le tissu sous-cutané et le fascia en couches d'environ 3 cm de longueur à l'aide de ciseaux de dissection et microforceps jusqu'à ce que le faisceau vasculaire fémorale est exposée à partir de l'artère pelvienne de l'aine jusqu'à la bifurcation de l'artère fémorale du genou.
    13. Séparer les vaisseaux et retirer l'adventice en utilisant des ciseaux de adventice et microforceps.
    14. Coaguler le côté bRanches utilisant la coagulation électrique. Couvrir le champ opératoire avec une compresse humide.
    15. Ouvrez la peau sur le côté droit comme décrit pour le côté gauche, 1.1.11 - 1.1.14.
    16. Pour la récolte du greffon veineux, ligaturer la veine fémorale droite par coagulation électrique sur les extrémités proximale et distale à une distance de 1 - 1,5 cm.
    17. Retirer le greffon veineux avec microforceps et rincer le greffon veineux avec une solution d'héparine (50 Ul / ml dans une solution de chlorure de sodium à 0,9%) en utilisant une canule d'irrigation et de le transférer à la cuisse gauche. Couvrir le champ opératoire sur le côté droit avec une compresse humide.
    18. Ligaturer la veine fémorale sur le côté gauche de manière proximale à la région inguinale avec un collier de microvaisseaux. Coaguler la veine fémorale de manière distale par coagulation électrique, au niveau du genou supérieur avant de bifurquer, à une distance d'environ 2 cm.
    19. Anastomose pour relier l'extrémité proximale du greffon veineux avec l'extrémité proximale de la veine d'anastomose bout-à-bout avec une 11-0 Suture. Utilisez environ 8 sutures interrompues. Commencez par placer les deux premiers points de suture au niveau des positions 12 heures et 6 heures. Ensuite, mettre en 2 à 3 autres sutures entre ces points sur la face avant, puis mettre 2 à 3 autres sutures sur le côté arrière.
    20. Ligaturer l'artère fémorale de la même manière que décrit pour la veine fémorale (1.1.18.). Assurez-vous que les vaisseaux de la boucle ne sont pas tordus. Anastomose à l'extrémité distale du greffon veineux avec l'extrémité proximale de l'artère, comme décrit pour la veine fémorale (étapes 01.01.19.).
    21. Administrer 25 UI d'héparine par voie intraveineuse. Faire à nouveau que les navires de la boucle ne sont pas tordus, Retirer les pinces et vérifier les fuites et la perméabilité de la boucle pendant environ 5 min.
    22. Papavérine dégouliner (par exemple, 4 mg / ml) sur les vaisseaux pour prévenir les spasmes vasculaires. S'il y a une perméabilité, la boucle se dilate et le pouls de l'artère peut être observée.
    23. Pré - remplir la chambre d'implantation avec la première moitié (environ 500 pi) de la matrice (par exemple </ Em>, un hydrogel ou une matrice osseuse avec ou sans cellules). Incorporer la boucle dans la chambre d'implantation.
    24. Remplir la chambre d'implantation avec la seconde moitié de la matrice à un volume total de 1000 pi. Sceller la chambre avec le couvercle de la chambre.
    25. Fixer la chambre d'implantation sur la cuisse avec un non-absorbable 6-0 suture. Fixer le couvercle de la chambre avec un non-absorbable 6-0 suture. Arrêtez possible saignement à la coagulation électrique.
    26. Fermer la peau avec résorbables 4-0 sutures. Couvrir la plaie avec de l'aluminium par pulvérisation.
    27. Administrer des antibiotiques et des analgésiques (par exemple, 7,5 mg / kg d' enrofloxacine ms, le tramadol 12,5 mg / kg per os (PO) (par l' intermédiaire de l' eau de boisson) pendant 3 - 5 jours , et ensuite en fonction du comportement du rat).
    28. Tourner le vaporisateur et laissez le rat à respirer les gaz d'alimentation jusqu'à ce qu'il commence à se réveiller.
    29. Placez le rat dans une boîte avec support thermique et d'observer attentivement jusqu'à guérison complète.
    30. Ne laissez pas le non ratassisté jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.
    31. Ne pas retourner le rat à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
  2. procédure Explantation
    1. Effectuer l'explantation après un temps court ou une implantation de longue date (selon la conception de l'étude, des exemples s'il vous plaît voir les références 27-32). Anesthetize le rat selon les étapes 1.1.1.-1.1.9.
    2. Ouvrez la peau de l'abdomen avec un scalpel (n ° 10) et déplacer les intestins de côté avec une compresse. Exposer l'aorte abdominale et les tampons de coton veine cave caudale à l'aide.
    3. Cathétériser l'aorte abdominale (par exemple., Calibre 24 plastique canule) et couper la veine cave caudale avec des ciseaux de dissection.
    4. Rincer l'aorte abdominale avec une solution de chlorure de sodium à 0,9% contenant 100 UI / ml d'héparine jusqu'à ce que le liquide qui fuirait est clair. Perfuser l'aorte avec 30 ml de solution de perfusion (par exemple., Agent de contraste ou de l' Inde dansk).
    5. Euthanize le rat par injection d'une dose létale d'embutramide, mebezonium iodure, d'une solution injectable de chlorhydrate de tetracaine (0,1 à 0,2 ml / kg) dans une anesthésie profonde.
    6. Ligaturer l'aorte abdominale et la veine cave caudale avec un non absorbable suture 4-0.
    7. Fermez la zone de la plaie ouverte avec 1 - 2 pinces. Stocker le rat pendant 24 heures à 4 ° C (polymérisation de la solution de perfusion).
    8. Placez le rat sur son dos. Répartir les membres postérieurs et les fixer avec du ruban adhésif.
    9. Ouvrez la peau au-dessus de la chambre avec une incision longitudinale avec un scalpel (n ° 10).
    10. Retirez le tissu conjonctif de la chambre et le pédicule en boucle avec des ciseaux de dissection et microforceps. Couper le pédicule en boucle à une distance de 1 cm de l'ouverture de la chambre avec des ciseaux de dissection et enlever la chambre.
    11. Ouvrez le couvercle de la chambre et retirer soigneusement la construction de la chambre avec une pince et le fixer dans 4% solution de formol tamponné pendant 24 heures à la salletempérature. Utiliser ensuite la construction pour la 3D micro-tomodensitométrie ou paraffine pour l' analyse histologique 30.

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Résultats

Création de tissus
À des fins d'ingénierie du tissu osseux, un certain nombre de substituts osseux ont été implantés dans le petit animal de rat modèle de boucle AV 27,28,33,34. Vascularisation pourrait parfaitement être démontrée en 3D micro-tomographie par ordinateur (micro-CT) (figure 3A). Vascularisation d'une matrice bovine traitée os spongieux (PBCB) était significativement plus élevée dans le groupe de la boucle par rappo...

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Discussion

Depuis plus d' une décennie, nous avons utilisé avec succès l'artérioveineuse (AV) boucle à des fins d'ingénierie tissulaire et de l' angiogenèse étude in vivo dans le modèle des petits animaux. Nous pourrions démontrer que ce modèle microchirurgicale est très bien adapté pour l'ingénierie des tissus différents et qu'il peut également être utilisé pour les études de l'angiogenèse ou antiangiogéniques.

Importance de la technique par rapport aux mét...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier les institutions suivantes pour soutenir notre recherche en boucle AV: Staedtler Stiftung, Dr Fritz Erler Fonds, Else Kröner Fesenius Stiftung, Baxter Healthcare GmbH, DFG, IZKF / ELAN / EFI / Bureau pour l'égalité et la diversité, la Forschungsstiftung Medizin , Université Friedrich-Alexander d'Erlangen-Nuremberg (FAU), AO Foundation, Manfred Roth Stiftung, Xue Hong, Fondation Hans Georg Geis, DAAD (DAAD), en Allemagne, et le Ministère de l'Enseignement supérieur et de la recherche scientifique, Irak. Nous tenons à remercier Stefan Fleischer, Marina Milde, Katrin Köhn et Ilse Arnold-Herberth pour leur excellent support technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,9 % chlorure de sodiumBerlin-Chemie AG34592508
11-0 Ethilon / polyamide 6/6EthiconEH7438G
4-0 Vicryl / polygalactine 910EthiconV392H
6-0 Prolene / polypropylèneEthicon8695H
spray aluminiumPharma Partner Vertriebs-GmbH1020
antiseptiques  ;BODE Chemie GmbH  ;
Cathéter  ;B Braun Meslungen AG4251612-02
produit de contrasteFlowtech  ; MV-122
embutramide, iodure de mébézonium, solution injectable de chlorhydrate de tétracaïne  ;Intervet International GmbH
encre de chine intense encre de ChineLefranc & Bourgeois
EnrofloxacineBayer AG
pommade oculaireBayer AG
Formalin 4 %Carl Roth GmbH & Co. KGP087.4
HeparinRatiopharm GmbH
isoflurane  ;Abbott Laboratories6055482
rat Lewis, mâleCharles River Laboratories
Metamizol-Natrium  ;Ratiopharm GmbH
papaverine / Paveron NLinden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH
tramadol / TramalGrü ; nenthal GmbH

Références

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