Des outils pour étudier le rôle de l'architecture Protein HMGB1 dans le traitement des Helix effets de distorsion, l'ADN spécifique du site InterStrand Crosslinks

Résumé

Des dommages ciblés à l’ADN peuvent être obtenus en attachant un agent endommageant l’ADN à un oligonucléotide formant un triplex (TFO). À l’aide de TFO modifiés, l’association de protéines spécifiques aux dommages à l’ADN et la modification de la topologie de l’ADN peuvent être étudiées dans des cellules humaines à l’aide de tests d’immunoprécipitation de la chromatine modifiée et de tests de super-enroulement de l’ADN décrits dans le présent document.

Résumé

Boîte de high mobility group 1 (HMGB1) protéine est une protéine non-histone architecturale qui est impliquée dans la régulation de nombreuses fonctions importantes dans le génome, tels que la transcription, la réplication de l'ADN et la réparation d'ADN. HMGB1 se lie à l'ADN structurellement déformée avec une affinité supérieure à celle de l'ADN-B canonique. Par exemple, nous avons constaté que la HMGB1 se lie à l'ADN (reticulations interbrins CIST), qui lient de manière covalente les deux brins de l'ADN, provoquent la déformation de l'hélice, et si on les laisse non réparée peut provoquer la mort cellulaire. En raison de leur potentiel cytotoxique, plusieurs agents ICL-inductrices sont actuellement utilisés comme agents chimiothérapeutiques dans la clinique. Alors que les agents ICL formant montrent des préférences pour certaines séquences de base (par exemple, 5'-TA-3 'est le site de réticulation préféré pour psoralène), ils induisent en grande partie des dommages de l' ADN d'une manière aveugle. Cependant, en couplant de façon covalente l'agent induisant la LSC à un oligonucléotide formant triplex (TFO), qui se lie à l'ADN dans une séquence spécifiqueAinsi, des dommages de l'ADN cible peut être atteint. Ici, nous utilisons un TFO conjugué de manière covalente sur 'extrémité à un 4'-hydroxyméthyl-4,5' 5 (HMT) psoralène, 8-triméthylpsoralène pour générer un ICL site spécifique sur un plasmide mutation-reporter pour l'utiliser comme un outil pour étudier la modification architecturale, le traitement et la réparation des lésions de l'ADN complexes par HMGB1 dans les cellules humaines. Nous décrivons les techniques expérimentales pour préparer ICL TFO dirigés sur des plasmides rapporteurs et d'interroger l'association de HMGB1 avec les ICL TFO dirigées dans un contexte cellulaire en utilisant des tests chromatine immunoprécipitation. En outre, nous décrivons des tests de surenroulement de l'ADN pour évaluer la modification d'architecture spécifique de l'ADN endommagé en mesurant la quantité de tours superhélices introduits sur le psoralène réticulé plasmide par HMGB1. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier les rôles des autres protéines impliquées dans le traitement et la réparation des ICL TFO dirigées ou d'autres dommages à l'ADN ciblé dans toute lignée cellulaire d'intérêt.

Introduction

Formant des triplex d' oligonucléotides (OFT) un ADN duplex se lient d'une manière spécifique d' une séquence via une liaison de Hoogsteen d'hydrogène pour former des structures en triple hélice ^1-5. La technologie triplex a été utilisé pour interroger une variété de mécanismes biomoléculaires, tels que la transcription, la réparation des dommages de l' ADN et le ciblage génique (passé en revue dans les références ^6-8). OFT ont été largement utilisés pour induire des dommages spécifiques au site sur les plasmides rapporteurs ^9,10. Notre laboratoire et d' autres ont déjà utilisé un TFO, AG30, attaché à une molécule de psoralène pour induire l' ADN interbrins réticulations spécifiques du site (de ICL) dans le gène supF sur le pSupFG1 plasmidique ^5,10-12. ICL sont hautement cytotoxique que ces lésions réticulent de manière covalente les deux brins d'ADN, et si elle unrepaired, peut bloquer la transcription des gènes et empêcher la réplication des machines d'ADN ^13,14. En raison de leur potentiel cytotoxique, des agents induisant ICL ont été utilisés comme médicaments chimiothérapeutiques dans le traitementdu cancer et d' autres maladies ^15. Cependant, le traitement et la réparation des ICL dans les cellules humaines ne sont pas bien comprises. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le traitement des ICL dans les cellules humaines peut aider à améliorer l'efficacité des régimes chimiothérapeutiques à base d'ICL. ICL TFO-induits et leurs intermédiaires de réparation ont le potentiel de provoquer des distorsions structurelles importantes à l'hélice de l'ADN. De telles distorsions sont des cibles probables pour les protéines d' architecture, qui se lient à l' ADN déformé avec une affinité supérieure à canonique B-forme duplex ADN ^16-20. Ici, nous avons étudié l'association d'une protéine architecturale très abondante, HMGB1 avec ICL dans les cellules humaines par l'intermédiaire d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) essais sur des plasmides de psoralène-réticulé et identifié un rôle pour HMGB1 dans la modulation de la topologie de l'ADN plasmidique psoralène réticulé chez l'homme des lysats de cellules cancéreuses.

HMGB1 est une très abondante et ubiquitaire non sonton protéine architecturale qui se lie à l' ADN endommagé et les substrats d'ADN alternativement structurés avec une affinité supérieure canonique forme B de l' ADN ^17-20. HMGB1 est impliqué dans plusieurs processus ADN métaboliques, tels que la transcription, la réplication de l' ADN et la réparation d' ADN ^16,21-23. Nous avons déjà démontré que HMGB1 se lie à ICL TFO dirigées in vitro avec une grande affinité ^20. De plus, nous avons démontré que le manque de HMGB1 a augmenté le traitement mutagène de ICL TFO dirigées et HMGB1 identifié comme une réparation nucleotide excision (NER) co-facteur ^23,24. Récemment, nous avons constaté que HMGB1 est associée à ICL TFO dirigées dans les cellules humaines et son recrutement à ces lésions dépend de la protéine NER, XPA ^16. Surenroulement négatif de l' ADN a été montré pour favoriser l'élimination efficace des lésions de l' ADN par NER ^25, et nous avons constaté que HMGB1 induit surenroulement négatif préférentiellement sur plas ICL contenant TFO dirigéessubstrats milieu ( par rapport aux plasmides substrats non endommagés) ^16, fournissant une meilleure compréhension du rôle (s) potentiel de HMGB1 comme un co-facteur de NER. Le traitement des ICL est pas entièrement comprise dans les cellules humaines; ainsi, les techniques et les analyses développées sur la base des outils moléculaires décrits ici pourraient conduire à l'identification de protéines supplémentaires impliquées dans la réparation ICL, qui peut à son tour servir de cibles pharmacologiques qui peuvent être exploitées pour améliorer l'efficacité des traitements de chimiothérapie du cancer.

Ici, une approche efficace pour évaluer l'efficacité de la formation ICL TFO dirigée dans l'ADN plasmidique par électrophorèse sur gel dénaturant d'agarose a été discuté. En outre, en utilisant les plasmides contenant les ICL TFO dirigées, des techniques pour déterminer l'association de HMGB1 avec des plasmides ICL endommagés dans un contexte cellulaire en utilisant des essais ChIP modifiés ont été décrits. En outre, une méthode facile pour étudier les modifications topologiques introduites par ee protéine HMGB1 architecturale, en particulier sur des substrats de plasmide ICL endommagés dans les lysats de cellules humaines a été déterminée en effectuant des essais de surenroulement par électrophorèse sur gel d'agarose à deux dimensions. Les techniques décrites peuvent être utilisées pour favoriser la compréhension de l'implication de la réparation de l'ADN et des protéines d'architecture dans le traitement des lésions de l'ADN ciblé sur des plasmides dans les cellules humaines.

Nous décrivons des protocoles détaillés pour la formation d'ICL psoralène spécifiques au site TFO dirigés sur l'ADN de plasmide et le plasmide subséquent ChIP et surenroulement des dosages pour identifier des protéines qui associent les lésions et les protéines qui modifient la topologie de l'ADN, respectivement. Ces dosages peuvent être modifiés pour produire avec d'autres agents endommageant l'ADN, OFT, des substrats de plasmide et des lignées de cellules de mammifères présentant un intérêt. En fait, nous avons montré qu'il existe au moins un site potentiel TFO affinité de liaison unique et élevé au sein de chaque gène annoté dans le génome humain ^26. Commentjamais, pour plus de clarté, nous avons décrit ces techniques pour l'utilisation d'un TFO spécifique psoralène-conjugué (pAG30) sur un plasmide mutation-rapporteur spécifique (pSupFG1) dans les cellules U2OS humaines que nous avons utilisé dans Mukherjee & Vasquez 2016 ^16.

Protocole

1. Préparation de ICL TFO dirigés sur le plasmide Substrats

1. Incuber quantités équimolaires de plasmide pSupFG1 ^10,11 ADN (ADN plasmidique 5 ug est un bon point de départ) avec psoralène conjugué TFO AG30 dans 8 pi de tampon de triplex de liaison [50% de glycérol, Tris 10 mM (pH 7,6), mM MgCl 10 _2] , et dH ₂ O pour un volume final de 40 pi dans un tube de couleur ambre. Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas. Laisser incuber la réaction à 37 ° C bain d'eau pendant 12 heures.
2. Réchauffez la lampe UVA pour assurer la pleine puissance. Placez la réaction de triplex sur la pellicule de paraffine, et placer le film de paraffine sur la glace sous la (nM 365) lampe UVA. Placer un filtre mylar entre la lampe et la réaction.
3. UVA irradient pour une dose totale de 1,8 J / cm ^2. Conserver les échantillons à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
   Attention: Porter des lunettes de protection et des vêtements avec une irradiation UVA.
4. Linéariser 200 ng du plasmide préparé ci-dessus avec la restriction enzyme Eco R1 dans un volume total de 20 ul à l' aide du fabricant fourni 10x tampon. Heat dénaturent l'enzyme pendant 20 min à 65 ° C. Faites tourner les échantillons pendant 10 minutes à 10.000 xg et stocker à 4 ° C.
5. Préparer 50x tampon alcaline [NaOH 1,5 M, 50 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)]. Ajouter 0,5 mg d'agarose à 50 ml dH ₂ O. Faire bouillir pour dissoudre l'agarose et le placer dans un bain d'eau à 50 °.
6. Après que la température de l'agarose dissous est à 50 ° C, ajouter 1 ml de tampon 50x alcaline, mélanger puis verser le gel dans le bac de gel. Prévoyez du temps pour le gel de se solidifier à la température ambiante avant utilisation.
7. Ajouter 4 ul de 0,5 M d'EDTA à 20 ul d'échantillon d'ADN linéarisée et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante.
8. Ajouter un tampon de chargement de gel alcalin 6x (NaOH 300 mM, 6 mM d' EDTA, 18% (p / v) d'un polysaccharide de poids moléculaire élevé, à 0,06% de vert de bromocrésol dans dH ₂ O) aux échantillons et à une échelle d' ADN de 1 kb.
   NOTE: Il est important d'utiliser un tampon de chargement de gel alcalin 6x, s'il vous plaît voir la discussion.
9. Charger les échantillons sur le gel dans la chambre froide et courir la nuit dans un tampon alcalin 1x (12-16 h) à 3,2 volts par cm. Une fois que les échantillons sont entrés dans le gel, placer une plaque de verre sur le dessus du gel pour l'empêcher de flotter.
10. Neutraliser les échantillons par trempage du gel dans un tampon de neutralisation [1 M de Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M de NaCl, 3 M d'acétate de sodium (pH 5,2)] pendant 45 min à température ambiante.
11. Colorer le gel de l'ADN avec 4 ul de 1% de bromure d'éthidium (EtBr) dans 50 ml d'eau pendant 1 heure à température ambiante. Destain avec de l'eau pendant 15 min. Visualiser l'ADN en utilisant un système d'imagerie.
    Attention: EtBr est un mutagène puissant et peut être absorbé par la peau. Éviter tout contact direct avec EtBr.

2. Transfection et immunoprécipitation de ICL contenant Plasmides TFO dirigées dans des cellules humaines

1. Plate 400.000 cellules de mammifères (par exemple, U2OS ocellules steosarcoma) par boîte de 60 mm dans du milieu Eagle modifié Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) sans antibiotiques 24 heures avant la transfection. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO _2.
2. Avant la transfection, le milieu de croissance chaud et du tampon phosphate salin (PBS) à 37 ° C dans un bain d'eau. Chauffer le réactif de transfection à la température ambiante.
3. Incuber 30 ul de réactif de transfection avec 500 ul de milieu de croissance 1x (mélange 1) et 2 pg de tubes à fond rond TFO dirigés ICL contenant des plasmides dans 500 ul de 1 x milieu de croissance (mélange 2) dans séparés 14 ml pendant 10 min à température ambiante.
4. Ajouter mélange 1 à mélanger 2, bien mélanger par pipetage de haut en bas. Incuber pendant 25-30 minutes à la température ambiante.
5. Laver les cellules deux fois avec du PBS chaud. Ajouter le mélange de transfection d'une manière goutte à goutte répartir uniformément dans toute la plaque de cellules. Ajouter 1 ml de milieu de croissance de la plaque, et amener le volume final à 2 ml. Mélanger nousll. Placez les plaques de culture à 37 ° C incubateur avec 5% de CO ₂ pendant 4 heures.
6. Remplacer le support avec 3 ml de milieux de croissance supplémenté avec 10% de FBS, et on incube encore pendant 16 heures. Ne pas utiliser des antibiotiques.
7. Traiter les cellules avec 80 pl de 37% de formaldéhyde fraîche par plaque à une concentration finale d'environ 1% et on incube pendant 10 minutes à la température ambiante en l'absence de lumière.
   Attention: Le formaldéhyde est toxique et doit être manipulé en fonction de ses consignes de sécurité. l'exposition au formaldéhyde peut causer des dommages à la peau, des yeux et des voies respiratoires.
8. Étancher le formaldéhyde réticulant par addition de 300 ul de glycine réfrigérée (fournie dans le kit disponible dans le commerce) par plaque et incuber pendant 5 min. Retirez les médias et laver deux fois avec PBS refroidi, puis recueillir des cellules par grattage dans 1 ml refroidi (4 ° C) PBS dans un tube de microcentrifugeuse. Gardez les échantillons sur la glace en tout temps.
9. Préparer des pastilles de cellules par centrifugation à 4 ° C pendant 5 min, unet 13.400 xg en utilisant une table réfrigérée centrifugeuse. Pipet le surnageant et placer le culot cellulaire sur la glace.
10. De manière homogène resuspendre le culot dans 1 ml refroidie (4 ° C) Tampon A (fournie dans le kit disponible dans le commerce) et laisser incuber sur de la glace pendant 10 minutes. Mélanger de temps en temps en inversant le tube. cellules à granules comme avant (voir l'étape 2.9 ci-dessus).
11. De manière homogène resuspendre le culot dans 1 ml refroidie (4 ° C) Tampon B (fournie dans le kit disponible dans le commerce) et laisser incuber sur de la glace pendant 10 min avec un mélange occasionnel par inversion. cellules à granules par centrifugation comme précédemment (voir étape 2.9 ci-dessus).
12. Resuspendre les cellules à nouveau dans 200 pi réfrigérés Buffer B. Ajouter 2 pl de micrococcique nucléase (MNase) et incuber à température ambiante pendant 10 min. Mélanger la réaction de temps en temps en tapotant le tube. Arrêter la réaction MNase en plaçant le tube sur de la glace et en ajoutant 40 mM d'EDTA. cellules à granules comme avant (voir l'étape 2.9 ci-dessus).
13. Resuspendre les cellules dans 100 immunopr chromatine ul 1xecipitation tampon (ChIP) du tampon (fournie dans le kit disponible dans le commerce) additionné de cocktail inhibiteur de protease.
14. Placez les cellules remises en suspension dans un tube de microcentrifugation à paroi mince. Soniquer les échantillons en les faisant flotter sur l'eau de bain sonicateur pendant 20 secondes puis 20 secondes d'incubation sur de la glace. Répétez les étapes 9 fois sonication pour générer ~ 800-1200 fragments de pb.
    1. 20 ul des échantillons soniqués ajoute 3 ul de NaCl 5 M et 1 pi de RNase A. Bien mélanger par tourbillonnement et on incube à 37 ° C pendant 30 min. Par la suite, ajouter 2 pl Proteinase K et incuber pendant 2 heures à 65 ° C. Purifier les échantillons en utilisant un kit de purification PCR. Exécutez des échantillons sur un gel d'agarose à 1% et visualiser avec EtBr.
       REMARQUE: L'intensité maximale de l'ADN qui en résulte doit être égal ou inférieur à 1000 pb.
15. Dans trois tubes séparés, ajouter 30 ul de lysat dans un tube siliconé prérefroidi, puis ajouter 70 ul de tampon de puces 1x réfrigérées avec des inhibiteurs de protéase ajoutée. Ajouter 1 μg d'anti-immunoglobuline G (IgG), H3 anti-histones (comme témoin positif) ou des anticorps anti-HMGB1 aux tubes respectifs. Laisser incuber pendant une nuit dans une chambre froide avec une rotation continue.
16. Resuspendre protéines G perle homogène dans la chambre froide. Ajouter 4 ul de billes de protéine G par le tube et laisser incuber pendant 2-4 heures dans une chambre froide avec une rotation.
17. L'utilisation d'un support magnétique, sédimenter les billes et retirer le surnageant. Ajouter 200 ul de 1 x tampon ChIP mélangé avec un cocktail inhibiteur de la protéase au culot et laver pendant 5 min dans la chambre froide avec la rotation. Répétez laver deux fois.
18. Effectuer un lavage supplémentaire avec haute teneur en sel tampon 1x ChIP (contenant 70 mM de NaCl).
19. Remettre en suspension les pastilles avec un tampon d'élution de 160 ul (fournie dans le kit disponible dans le commerce) et incuber à 37 ° C avec rotation pendant 30 min.
20. Pellet les perles et recueillir le surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 6 pi 5 M de NaCl et 2 pl de proteinase K, et incuber une nuit à 65° C.
21. On purifie l'ADN en utilisant un kit de purification de produit de PCR et éluer l'ADN en utilisant 50 ul dH ₂ O.
22. Effectuer PCR ¹⁶ réactions en utilisant des jeux d'amorces pour la région (s) d'intérêt, et de résoudre les produits sur un gel d' agarose 1% coloré avec EtBr.

3. surenroulement Assay et 2 dimensions Agarose Gel Electrophoresis

1. Préparer l' ADN du tampon de synthèse de réparation (45 mM de Hepes-KOH, pH 7,8, 70 mM de KCl, 7,4 mM _MgCl2, DTT mM , 0,9, EDTA 0,4 mM, 2 mM d' ATP, 20 uM de dNTP, 3,4% de glycerol et 18 ug sérumalbumine bovine) . Conserver à -80 ° C. Thaw sur la glace et avant utilisation ajouter 40 phosphocréatine mM et 2,5 pg de la créatine phosphokinase.
2. Préparer 10x surenroulement tampon [Tris 500 (pH 8,0), NaCl 500 mM, _MgCl2 25 mM, EDTA 1 mM], et conserver à la température ambiante.
3. Linéariser 300 ng d'ADN plasmidique surenroulé pSupFG1 complètement en utilisant 1 ul de virus de la vaccine topoisomérase I (5-15 U / pl), avec 1xtampon de surenroulement dans une réaction de 10 ul. Laisser incuber le mélange à 37 ° C pendant 1 heure.
4. Décongeler HeLa extrait exempt de cellules ²⁴ sur la glace. Pour les plasmides complètement détendus, ajoutez l'extrait exempt de cellules HeLa 25 pi et un tampon de synthèse de réparation d'ADN. Bien mélanger. Ajouter 1 pl supplémentaires de Vaccinia topoisomérase I au mélange, et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
5. Mettre un terme aux réactions par addition de dodécylsulfate de sodium (SDS) (1% en concentration finale) et de la proteinase K (0,25 mg / ml de concentration finale). Incuber à 65 ° C pendant 2 heures.
6. Couler un gel d'agarose 1% avec 1 x Tris Borate EDTA (TBE). Ajouter colorant de chargement de l'ADN et charger les réactions directement sur le gel au moins 4 voies en dehors. Exécutez le gel pendant 8-10 h à 2 V / cm 1x TBE (dimension 1) à la température ambiante pour résoudre les topo-isomères.
   NOTE: Préparer une solution stock 5x TBE dans 1 L de dH ₂ O en ajoutant 54 g de base Tris. 27,5 g d'acide borique et 20 ml d'EDTA 0,5 M (pH 8,0).
7. Préparer 2 L de 1xTBE avec 3 pg / ml chloroquine-phosphate. Faire tremper le gel dans 200 ml de cette solution pendant 20 min. Couvrir le plateau de gel avec du papier d'aluminium.
8. Pour l'électrophorèse du gel dans la deuxième dimension, tourner le gel de 90 ° dans le sens horaire et l'exécuter pour 4-6 heures à 2 V / cm chloroquine contenant 1x TBE pour résoudre les supertours positifs et négatifs.
9. Colorer le gel avec EtBr pendant 1 heure sur une bascule. Décolorer le gel avec _dH2Û pendant 15 min, puis de visualiser la distribution thermique des topo - isomères à l' aide d' une caméra.

Résultats

La formation de la LSC TFO dirigée est essentielle pour les dosages à base de plasmides, qui sont utilisées pour interroger les rôles des protéines architecturales dans le traitement ICL dans les cellules humaines. Dénaturation électrophorèse sur gel d'agarose est un moyen facile de déterminer l'efficacité de la formation ICL TFO dirigée. Les plasmides hébergeant ICL TFO dirigés migrent avec une mobilité plus lente à travers la matrice de gel d'agarose (figure 1A, piste ...

Discussion

La formation efficace des ICL TFO dirigés dépend de deux facteurs essentiels: premièrement, des composants tampons appropriée (par exemple, MgCl ₂₎ et le temps d'incubation de la TFO avec son substrat d'ADN cible ( en fonction de l'affinité de liaison de l'TFO à sa cible recto-verso, et que les concentrations utilisées); et deuxièmement, la dose appropriée des UVA (365 nm), l'irradiation pour former des reticulations de psoralène de manière efficace. la formation d'un triplex ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	Commande sur mesure	HPLC (ou gel) purifié
Simple ChIP Enzymatic Chromatine IP Kit	Cell signaling Inc.	9003	Le protocole suggéré par le fabricant est optimisé pour la propriété intellectuelle de la chromatine et non pour la propriété intellectuelle du plasmide. Les anticorps de contrôle IgG et H3 ainsi que les billes de protéine G et la nucléase micrococcique sont fournis par le fabricant.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR master mix
HMGB1 anticorps	Abcam	Ab18256
Wizard Gel et kit de nettoyage PCR	Promega	A9281
Sel de chloroquine-diphosphate	Sigma	C6628-50G	Pour électrophorèse bidimensionnelle sur gel d’agarose
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
GenePORTER réactif de transfection	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray lampe ultraviolette à ondes longues	Upland, CA	B 100 AP	Lampe UVA
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100	Epigentek	EQC-1100	Sonicateur à bain d’eau
Filtre Mylar	GE Healthcare Life Sciences
Agarose	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	Système BIO-RAD	XRS+	Système d’imagerie ADN
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
37 % Formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Utilisé pour la réticulation  ;
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Milieux de culture cellulaire
PBS	ThermoFisher	70013073	Culture cellulaire
Trypsine-EDTA	ThermoFisher	25200056	Culture cellulaire
Vert de bromocresol	Sigma-Aldrich	114-359	Colorant de chargement d’ADN
Tubes siliconés	Fisher Scientific  ;	02-681-320	Tube microfuge à faible rétention
Base Tris	Fisher Scientific	BP152-1
Acide borique	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
Photomètre	InternationalLight Technologies	ILT1400-A	Mesure de la dose UVA
Cell lines
Ostéosarcome humain U2OS	ATCC	ATCC HTB-96	Cultivé selon le fournisseur s recommandation
Adénocarcinome cervical humain HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Cultivé selon le fournisseur' s recommandation
Amorce avant proximale	5&prime ;-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Amorce inverse proximale	5&prime ;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer	5&prime ;-aat acc gcg cca cat agc ag Distal
reverse primer	5&prime ;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc