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Article de méthode

Préparation Fenêtre latérale chronique Cranial Active In Vivo Observation Suite Distal cérébrale moyenne Artère Occlusion chez la souris

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DOI :

10.3791/54701

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29 décembre 2016

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1Department of Neurosurgery and Center for Stroke-research Berlin (CSB), Charité-Universitätsmedizin, 2Department of Physics, University of California San Diego

Dans cet article

Résumé

occlusion chirurgicale d'une branche distale de l'artère cérébrale moyenne (MCAo) est un modèle fréquemment utilisé dans la recherche de course expérimentale. Ce manuscrit décrit la technique de base de MCAo permanente, combinée à l'insertion d'une fenêtre crânienne latérale, ce qui offre la possibilité pour la microscopie intravitale longitudinale chez la souris.

Résumé

Ischémie cérébrale focale (ie, accident vasculaire cérébral ischémique) peut causer des lésions cérébrales importante, conduisant à une perte sévère de la fonction neuronale et par conséquent à une foule de troubles moteurs et cognitifs. Sa prévalence élevée pose un problème de santé grave, car la course est parmi les principales causes d'invalidité à long terme et décès dans le monde 1. La récupération de la fonction neuronale est, dans la plupart des cas, que partielle. Jusqu'à présent, les options de traitement sont très limitées, notamment en raison de l'étroite fenêtre de temps pour thrombolyse 2,3. La détermination des méthodes pour accélérer la récupération d'un AVC reste un objectif médical prime; cependant, cela a été entravée par des idées mécanistes insuffisantes dans le processus de récupération. les chercheurs de l'AVC expérimentaux utilisent fréquemment des modèles de rongeurs d'ischémie cérébrale focale. Au-delà de la phase aiguë, la recherche de la course est de plus en plus axé sur la phase sub-aiguë et chronique suite à une ischémie cérébrale. La plupart des chercheurs d'AVC appliquent permanent ou tranocclusion sitoire du MCA chez des souris ou des rats. Chez les patients, les occlusions du MCA sont parmi les causes les plus fréquentes d'accident vasculaire cérébral ischémique 4. Outre l' occlusion proximale de la MCA en utilisant le modèle de filament, l' occlusion chirurgicale de la MCA distale est probablement le modèle le plus fréquemment utilisé dans la recherche de course expérimentale 5. Occlusion d'une extrémité distale (à la ramification des artères lenticulo-striées) MCA branche épargne généralement le striatum et affecte principalement le néocortex. occlusion des vaisseaux peut être permanent ou transitoire. Haute reproductibilité du volume de la lésion et les taux de mortalité très faibles par rapport aux résultats à long terme sont les principaux avantages de ce modèle. Ici, nous démontrons comment effectuer une fenêtre crânienne (CW) préparation latérale chronique du sinus sagittal, et ensuite comment chirurgicalement induire une course distale sous la fenêtre en utilisant une approche craniotomie. Cette approche peut être appliquée pour l'imagerie séquentielle des changements aigus et chroniques après une ischémie viaepi-éclairante, confocal à balayage laser et microscopie à deux photons intravitale.

Introduction

L’AVC est l’une des principales causes d’invalidité à long terme et de décès dans le monde1, arrivant en deuxième position après les maladies coronariennes. De plus, l’AVC est la principale cause d’invalidité à long terme, ce qui souligne son énorme impact socio-économique6-8. Au-delà du traitement aigu, l’étude de nouvelles approches et de nouveaux mécanismes pour accélérer et améliorer le rétablissement après un AVC reste un objectif médical prioritaire7.

Au cours des dernières décennies, les données de la recherche expérimentale sur les accidents vasculaires cérébraux ont considérablement contribué à la compréhension des cascades physiopathologiques complexes déclenchées par l’ischémie9,10. L’excitotoxicité, l’apoptose, la dépolarisation péri-infarctus et l’inflammation ont été identifiées comme les médiateurs les plus pertinents de la mort cellulaire après une ischémie cérébrale focale. De plus, à l’aide de modèles animaux d’ischémie cérébrale, des concepts, des modalités de diagnostic et des approches thérapeutiques importants ont été développés et validés (par exemple, la « pénombre » et la thrombolyse)11.

La disponibilité de modèles expérimentaux d’AVC, combinée à des modalités d’imagerie non invasives (par exemple, l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomodensitométrie ou l’analyse de contraste du chatoiement laser), permet au chercheur d’étudier les changements physiopathologiques hyperaigus et chroniques induits par l’agression ischémique de manière longitudinale12. Parallèlement à l’étude du profil spatio-temporel de la lésion évolutive, des changements ressemblant à la plasticité neuronale peuvent être étudiés et corrélés aux résultats fonctionnels et aux résultats histologiques. Au cours des dernières années, d’autres avancées méthodologiques ont été réalisées en utilisant la combinaison de modèles d’ischémie cérébrale et de microscopie in vivo via des fenêtres crâniennes13. Ces nouvelles techniques permettent aux chercheurs d’analyser l’unité neurovasculaire au niveau cellulaire et moléculaire, avec une grande puissance analytique dans les phases aiguë, subaiguë et chronique après une ischémie cérébrale focale14. De plus, l’imagerie microscopique in vivo de la dynamique microcirculatoire a révélé de nouveaux aspects de la fonction microvasculaire cérébrale et de l’angioarchitecture, avec une pertinence physiopathologique significative15-17.

Dans ce protocole, nous présentons comment effectuer une préparation chronique de CW latéralement au sinus sagittal et comment induire chirurgicalement un AVC distal sous la fenêtre. Ce modèle murin peut être appliqué à l’imagerie séquentielle des changements aigus, subaigus et chroniques après une ischémie cérébrale focale via l’épi-éclairage, le balayage laser confocal et la microscopie intravitale à deux photons.

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Protocole

ÉTHIQUE ÉTAT: Les expériences impliquant des sujets animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlin, Allemagne (G0298 / 13) et les critères ARRIVE, selon le cas. Pour cette étude, 10 à 12 semaines d'âge C57BL / 6J ont été utilisées.

1. Lateral chronique Cranial Préparation Fenêtre

  1. Effectuer une anesthésie par une injection sous-cutanée de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Test de sédation adéquate avec un stimulus de douleur.
  2. Stériliser les instruments chirurgicaux et champ opératoire avec 70% d'éthanol.
  3. Retirez le cuir chevelu du cou pour les yeux à l'aide d'un rasoir de rongeur.
  4. Fixer la tête dans un cadre stéréotaxique.
  5. Utilisez dexpanthénol pommade oculaire sur les deux yeux pour éviter la déshydratation.
  6. Nettoyer la zone chirurgicale pour enlever tous les poils et le stériliser avec 3 couches de 74,1% d'éthanol et 10% de 2-propanolol.
  7. Effectuer une ligne médianeincision du cou pour les yeux à l'aide d'un scalpel.
  8. SPAN le lambeau de peau avec 4 sutures tenting.
  9. Retirer le périoste avec précaution sur l'hémisphère gauche en grattant avec un scalpel au point où le muscle temporal commence.
    NOTE: Cette préparation sert aussi à créer une zone de bonne adhérence pour la colle dentaire, qui fixe le couvercle en verre.
  10. Effectuer une craniotomie fronto-pariétale d'un diamètre de 4 mm, en fluidifiant le crâne au niveau du bord du volet osseux à l'aide d'un micro-foret. Appliquer la solution saline pendant le forage pour éviter les blessures à la chaleur.
  11. Élever le volet osseux avec canules et retirez-le en utilisant microforceps.
  12. Irriguer soigneusement et abondamment avec une solution saline.
  13. Mélanger la colle dentaire jusqu'à ce qu'il ait la consistance appropriée et n'est pas fluide (ie, la colle ne devrait plus produire des fils). Placez-le sur l'os autour de la craniotomie.
  14. Placez un couvercle en verre avec un diamètre de 6 mm sur la colle préparée et le fixer avec ee reste de la colle dentaire. Assurez-vous qu'il est étanche à l'eau. Attendez jusqu'à ce que la colle est sèche et dure en la testant avec une pince.
    NOTE: Une irrigation supplémentaire accélère le processus de durcissement.
  15. Retirer les sutures tenting et fermer la plaie avec des sutures de la peau.
  16. Tirez la peau du flanc de la souris. Insérez une voie sous-cutanée de l'aiguille et remplacer doucement 0,5 ml de solution saline sous-cutanée stérile pour l'équilibre des fluides.
  17. Après la chirurgie, garder les animaux dans la cage de récupération chauffée pendant 90 min. Attendez jusqu'à ce que les animaux sont complètement éveillés avant de les laisser sans surveillance. Attendez jusqu'à ce que les animaux soient complètement récupérés avant de les retourner dans une cage avec d'autres animaux.
  18. Répéter le remplacement du volume d'une solution saline sous-cutanée au bout d'environ 12 heures, comme décrit à l'étape 1.16.
  19. Toujours appliquer une analgésie par gavage , soit directement dans la cavité buccale après la chirurgie (par exemple, le paracetamol (10 mg / ml) ou d' autres médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens).
  20. Vérifier la état des animaux tous les jours après la chirurgie, et toujours fournissent purée aliments pour animaux sur le sol dans une boîte de Pétri pour faire manger simple et d'éviter la perte de poids critique après la chirurgie.
    REMARQUE: La microscopie intravitale peut être effectuée dès le premier jour après la préparation de la fenêtre crânienne.
  21. Appliquer isoflurane et fixer l'animal dans un support de tête. Ouvrez la suture de la peau et nettoyer la fenêtre avec des bourgeons de coton et une solution saline stérile. Après 24 heures, la fenêtre crânienne doit être rempli de liquide céphalo-rachidien par ce point de temps, ce qui permet l'imagerie. Effectuer l' imagerie en utilisant des protocoles de microscopie établis 18.

2. Distal MCAo

REMARQUE: La procédure MCAo doit être effectuée environ 5 jours après la préparation CW. Cela minimise les interférences de la réaction immunitaire provoquée par la préparation CW avec la réaction immunitaire induite AVC.

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Figure 1. Vue d'ensemble de Distal MCAo. A. Ceci est une belle vue d' ensemble sur les navires avant l'op. B. Les navires après le premier contact bipolaire. C. Les navires après second contact bipolaire. D. La vue d' ensemble sur les navires, qui sont complètement fermés maintenant. E. aperçu final avec un grossissement inférieur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Anesthésier les souris en utilisant un masque d'anesthésie et un régime anesthésique approprié, en consultation avec le personnel vétérinaire (par exemple, l' induction avec 1,5 à 2% d' isoflurane et de maintenance avec 1,0 à 1,5% d' isoflurane dans 2/3 N 2 O et 1/3 O 2 par l' intermédiaire freezer).
  2. Rasage et enlever les poils et désinfecter la peau et la fourrure environnante avec un agent approprié (par exemple, l' alcool éthylique à 70%), et sécher ensuite.
  3. Maintenir la température corporelle des souris à 36,5 ° C ± 0,5 ° C pendant une intervention chirurgicale. Une rétroaction contrôlée coussin chauffant, chauffée selon la température rectale de la souris, est fortement recommandé.
  4. Placer l'animal dans la position latérale. Fixer le nez dans le masque d'anesthésie et d'ajuster la concentration d'isoflurane de 1.0 - 1,5%.
  5. Appliquer une pommade humide (dexpanthénol) pour les deux yeux.
  6. Utilisez l'incision de la peau fait pour la préparation CW.
  7. Séparez délicatement la peau et identifier le muscle temporal dessous.
  8. Réglez l'énergie du générateur haute fréquence (5-7 W) et utiliser le mode bipolaire.
  9. Utilisez la pince électrocoagulation et retirer délicatement le muscle temporal du crâne, la création d'un lambeau musculaire, sans enlever totalement le muscle.
  10. Identifier le MCA en dessous du crâne transparent dans la partie rostrale de la zone temporelle, dorsale à la rétro-orbital sinus. Si la bifurcation MCA ne peut être identifié, essayez d'identifier le navire le plus rostrale.
  11. Thin le crâne au-dessus de la branche MCA avec un microfraise tout en irriguant en permanence pour éviter les dommages de la chaleur.
  12. Soulever l'os avec canules et retirez-le avec microforceps.
  13. Diminuer l'énergie du générateur haute fréquence à 3-5 W.
  14. Approchez l'artère au-dessus et en douceur le toucher avec la pince bipolaire des deux côtés sans soulever le navire.
  15. Coaguler l'artère amont et en aval de la bifurcation du vaisseau.
  16. Attendre 30 secondes, puis touchez l'artère doucement pour faire en sorte que le flux sanguin est interrompu de façon permanente. Répétez l'électrocoagulation si une recanalisation est observée.
  17. Fixer le muscle temporal avec 1 ou 2 points de suture à l'insertion des muscles pour couvrir le défaut osseux, si possible.
  18. Suturer la plaie et placer l'animal dans la zone de récupération chauffée. En général, les animaux de récupération rapidement après anest volatilehesia.
  19. Pour le remplacement du volume, appliquer de 0,5 ml de solution saline stérile sous-cutanée, tel que décrit à l'étape 1.16.
  20. Après la chirurgie, permettent aux animaux de rester dans la cage de récupération chauffée pendant 90 min. Attendez jusqu'à ce que les animaux sont conscients avant de les laisser sans surveillance. Seulement les retourner à une cage avec d'autres animaux quand ils sont complètement rétablis.
  21. Répéter la substitution de volume, comme expliqué à l'étape 1.16, après 12 h.
  22. Appliquer l' analgésie postopératoire par l' eau potable (par exemple, le paracétamol (10 mg / ml) ou d' autres médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens).
  23. Vérifiez l'état de santé des animaux tous les jours après la chirurgie. Fournir purée aliments pour animaux dans une boîte de Pétri sur le plancher pour simplifier manger et pour minimiser la perte de poids post-opératoire.

3. Traitement Sham

  1. Effectuer toutes les procédures identiques aux étapes 1 et 2, décrites CW préparation, sauf ne pas coaguler le ar cérébrale moyenne exposée ci-dessus, y compris-terie.

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Résultats

Le calendrier et les résultats représentatifs sont présentés dans les figures 2 et 3. La préparation de la fenêtre crânienne, avec une petite fenêtre crânienne latérale du sinus longitudinal supérieur (Figure 2 B, C, D) se traduit par un taux de mortalité et de morbidité très faible lorsqu'elle est effectuée par un chirurgien expérimenté. Tous les 10 animaux ont survécu, et tout CW chronique pourrait être utilisé pour l'imagerie de haute...

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Discussion

L' AVC est parmi les principales causes d'invalidité à long terme et décès dans le monde 1. Au - delà de traitement aigu, la recherche de nouvelles approches et des mécanismes pour accélérer et améliorer la récupération après un AVC demeure un objectif médical premier 7. les chercheurs de l'AVC expérimentaux utilisent fréquemment des modèles de rongeurs d'ischémie cérébrale focale. En fait, les modèles induisant transitoire ou permanent MCAo imitent l' un des types les plus cour...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

VP participe au programme de recherche clinique de la Charité, financé par la Charité - Universitätsmedizin Berlin et l’Institut de la santé de Berlin. TB est un boursier SNSF PostDoc Mobility. Les auteurs reçoivent une subvention de la EinsteinStiftung/A-2012-153 à PV.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope chirurgical binoculaireZeissStemi 2000 C
Source lumineuse pour microscopeZeissCL 6000 LED
Coussin chauffant avec sonde rectaleFST21061-10
Cadre stéréotaxiqueKopfModèle 930
Système d’anesthésie pour isofluraneDraeger
IsofluranePince Abott
Dumont #5FST11251-10
Pince Dumont #7FST11271-30
Pince bipolaireErbe20195-501
Pince bipolaire  ;Erbe  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 20195-022
MicrodrillFST  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; 18000-17  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
Porte-aiguilleFST12010-14
5-0 suture en soieFeuerstein, Suture en soie Suprama
7-0Feuerstein, Suture en soie Suprama
8-0Feuerstein,
Peco ServicesV1200
Chambre de récupération vétérinaire Suprama

Références

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