Les poissons-zèbres sont en train de devenir un modèle précieux de traitement des lipides alimentaires et de maladies métaboliques. Il décrit des protocoles d’alimentation des larves riches en lipides, l’imagerie en direct d’analogues lipidiques fluorescents alimentaires et la quantification de l’apport alimentaire. Ces techniques peuvent être appliquées à une variété de techniques de dépistage, d’imagerie et d’enquête basée sur des hypothèses.
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Article de méthode
Haute teneur en graisses Alimentation Paradigm pour larvaire Zebrafish: Alimentation, imagerie en direct, et la quantification de la prise alimentaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les poissons-zèbres sont en train d’émerger comme un modèle de traitement des lipides alimentaires et de maladies métaboliques. Ce protocole décrit comment nourrir les larves de poisson-zèbre avec un repas riche en lipides, qui consiste en une émulsion de liposomes de jaune d’œuf de poule créée par sonication de jaune d’œuf dans un milieu embryonnaire. Des instructions détaillées sont fournies pour dépister la consommation de jaune d’œuf chez les larves afin que les larves qui ne se nourrissent pas ne faussent pas les résultats expérimentaux. Les liposomes du jaune d’œuf de poule peuvent être enrichis avec des analogues lipidiques fluorescents, y compris les acides gras et le cholestérol, permettant une visualisation systémique et subcellulaire du traitement des lipides alimentaires. Plusieurs méthodes sont décrites pour monter les larves qui sont propices à l’imagerie en direct à court et à long terme avec des objectifs droits et inversés à fort et faible grossissement. De plus, il présente un test permettant de quantifier l’ingestion alimentaire des larves en extrayant les lipides des larves nourries avec des analogues lipidiques fluorescents, en repérant les lipides sur une plaque de chromatographie à couche mince et en quantifiant la fluorescence. Enfin, les aspects critiques des procédures, les contrôles importants, les options de modification des protocoles pour répondre à des questions expérimentales spécifiques et les limites potentielles sont discutés. Ces techniques peuvent être appliquées non seulement à des enquêtes ciblées et fondées sur des hypothèses, mais aussi à une variété de dépistages et de techniques d’imagerie en direct pour étudier le métabolisme des lipides alimentaires et le contrôle de l’apport alimentaire.
Introduction
Les mécanismes par lesquels l'intestin réglemente le traitement des lipides alimentaires, le foie contrôle la synthèse des lipides et des lipoprotéines de métabolisme complexe, et comment ces organes fonctionnent avec le système nerveux central pour contrôler la prise alimentaire sont encore mal compris. Il est d'intérêt biomédical pour élucider cette biologie à la lumière des épidémies actuelles de l'obésité, les maladies cardiovasculaires, le diabète, et non alcoolisées maladie du foie gras. Des études en culture cellulaire et les souris ont fourni la majorité de notre compréhension des relations mécanistes entre les lipides et les maladies alimentaires....
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Protocole
Ces protocoles ont été approuvés par la Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care et utilisation Comité (protocole no. 139).
1. Préparation d'un animal
- Maintenir les adultes et les larves à 28 ° C sur un 14 heures: la lumière de 10 h: cycle d'obscurité. Nourrir les adultes deux fois par jour avec Artemia shell libre (decapsulated, non-éclosion, à partir de 14 dpf) et micropellets commerciales.
- Ces protocoles sont optimisés pour l'utilisation des larves de 6-7 dpf recueillies par la reproduction naturelle du fond de l'AB. Les protocoles peuvent être modifiés pour les larves d'autres âges et ori....
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Résultats
Lorsque alimenté sur une bascule à 29-31 ° C, la majorité des larves saines (≥95%) sera manger dans 1 h. À consommer l'émulsion de jaune d'oeuf, l'intestin des larves obscurcit en couleur. Très intestins sombres peuvent être observés à 2 h (figure 1). Si les larves sont unfed ou ne parviennent pas à se nourrir, l'intestin reste claire. Larves oeuf nourri d'exposition blanche un distendus de lumière intestinale qui ne noircissent pas en couleur.
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Discussion
Les techniques décrites ici permettent aux chercheurs de traiter des larves de poisson zèbre avec une alimentation riche en lipides, visualiser le traitement des lipides alimentaires dans des larves vivantes, et de quantifier l'apport alimentaire des larves. Pour assurer le succès, une attention particulière devrait être accordée à plusieurs étapes critiques. œufs de poule commerciales varient; pour réduire au minimum la variabilité potentielle que nous effectuons tous les tests sur les oeufs organiques des poulets .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Meng-Chieh Shen pour les images, Jennifer Anderson pour ses commentaires utiles sur le manuscrit et les membres du laboratoire Farber pour leur contribution au développement de ces techniques. Cette étude a été financée par les RO1DK093399 de prix NIDDK-NIH (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium : PI Stephen Ekker et Co-PI S.A.F), et F32DK096786 (J.P.O.). Ce contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des NIH. Un soutien supplémentaire a été fourni par la G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation au laboratoire de la S.A.F. et à la dotat....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tricaïne (sel de méthanesulofnate d’éthyle 3-aminobenzoate) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthésie pour larves de poisson-zèbre |
| Oeufs de poule | N/A | N/A N/A | Oeufs biologiques, sans cage, non enrichis pour acides gras omege-3 |
| Processeur à ultrasons 3000 sonicateur | Misonix, Inc. | S-3000 | Pour fabriquer des liposomes de jaune d’œuf |
| Sonabox enceinte acoustique | Misonix, Inc. | 432B | Pour fabriquer des liposomes de jaune d’œuf |
| 1/8" à micro-pointe conique | Misonix, Inc. | 419 | Pour fabriquer des liposomes de jaune d’œuf |
| Flacons ambrés (4 ml, verre) | National Scientific | 13-425 | Stockage des lipides ; comprend les flacons, les bouchons ouverts et les septos de capuchon |
| Incu-Shaker Mini ; | Benchmark | 1222U12 | Agitateur incubé pour aliments |
| BODIPY FL C16 ; | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Analogue lipidique fluorescent ; (Acide 4,4-difluoro-5,7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacéne-3-hexadécanoïque) |
| BODIPY FL C12 ; | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Analogue lipidique fluorescent ; (Acide 4,4-difluoro-5,7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène-3-dodécanoïque) |
| BODIPY FL C5 ; | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Analogue lipidique fluorescent ; (Acide 4,4-difluoro-5,7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacène-3-pentanoïque) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Analogue lipidique fluorescent ; (Acide 4,4-difluoro-5,7-diméthyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacéne-3-propionique) |
| Cholestérol topFluor ; | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Analogue lipidique fluorescent ; 23-(difluorure de dipyrrothéthénon)-24-norcholestérol |
| BSA sans acides gras | Sigma-Aldrich | A0281-1G | Pour la solubilisation du cholestérol TopFluor |
| Méthylcellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Supports de montage pour l’imagerie des larves vivantes ; 75 x 25 x 1 mm |
| Agarose à bas point de fusion | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Supports de montage pour les larves vivantes imagerie; 22 x 30 |
| lames de microscope VWR ; | VWR ; | 16004-422 | Montage des larves pour l’imagerie en direct |
| Coverslips ; | Verre de couverture | 12-544A | Montage des larves pour l’imagerie en direct |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Montage des larves pour l’imagerie en direct |
| FluoroDish (plat à fond en verre) | World Precision Instruments, Inc. ; | FD35-100 Montage des | larves pour l’imagerie en direct ; parabole de 35 mm, verre de 23 mm, épaisseur de verre de 0,17 mm. ; |
| Microscope confocal | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope pour l’imagerie en direct à fort grossissement |
| Stéréoscope | SM21500 | Nikon pour l’imagerie en direct à faible grossissement | |
| Tubes de culture en verre ; | Kimble | 73500-13100 | Extraction des lipides ; (13 x 100 mm ; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus ; | ThermoQuest | SC210A | Extraction des lipides |
| Plaques CCM canalisées | Whatman Scientific | WC4855-821 | Dosage de l’ingestion alimentaire ; LK5D Gel de silice 150 A, 20 x 20 cm, 250 um d’épaisseur ; |
| Plaques CCM canalisées | Analtech, Inc. | 66911 | Dosage de l’ingestion alimentaire ; Remplacement direct des plaques TLC Whatman Scientific |
| Typhoon 9410 Imager en mode variable | GE Healthcare | 9410 | Lecteur de plaques fluorescentes pour le dosage de l’apport alimentaire |
| Logiciel ImageQuant | Healthcare | 29000605 | Analyse du dosage de l’apport alimentaire |
| 5 3/4' Pipettes pasteur jetables en borosilicate de large calibre ; ; ; | Kimble | 63A53WT | Transfert des larves |
Références
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
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Réimpressions et autorisations
