Fabricating UV-Vis et Raman Spectroscopy Platform Immunoassay

Résumé

Les sondes optiques à base de nanoparticules ont été conçues pour détecter les antigènes à l’aide de la spectroscopie Raman et UV-Vis. Nous décrivons ici un protocole permettant de préparer de telles sondes pour un immunodosage par spectroscopie UV-Vis/Raman de manière à intégrer les futures capacités de multiplexage.

Résumé

Les dosages immunologiques sont utilisés pour détecter des protéines sur la base de la présence d'anticorps associés. En raison de leur utilisation intensive dans la recherche et les paramètres cliniques, une grande infrastructure d'instruments et de matériaux immunoessais peut être trouvé. Par exemple, 96- et 384 puits de plaques de polystyrène sont disponibles dans le commerce et ont un design standard pour accueillir l'ultraviolet visible (UV-Vis) Machines de spectroscopie de différents fabricants. En outre, une grande variété d'immunoglobulines, des étiquettes de détection, et des agents de blocage pour la conception des dosages immunologiques personnalisés tels que des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) sont disponibles.

En dépit de l'infrastructure existante, des kits ELISA standards ne répondent pas à tous les besoins de la recherche, ce qui nécessite le développement d'immuno-essai individualisé, qui peut être coûteux et fastidieux. Par exemple, les kits ELISA ont une faible multiplexage (détection de plus d'un analyte à la fois) des capacités car elles dépendent généralement de la fluorescence ou de la colméthodes orimetric pour la détection. Des analyses colorimétriques et fluorescents à base ont des capacités limitées de multiplexage en raison de larges pics spectraux. En revanche, la spectroscopie Raman méthodes basées sur-ont une capacité beaucoup plus grande pour le multiplexage en raison des pics d'émission étroites. Un autre avantage de la spectroscopie Raman est que les journalistes Raman éprouvent beaucoup moins photoblanchiment que des marqueurs fluorescents ^1. Malgré les avantages que les journalistes Raman ont plus de marqueurs fluorescents et colorimétriques, les protocoles pour fabriquer des immunoessais à base de Raman sont limitées. Le but de ce document est de fournir un protocole pour préparer des sondes fonctionnalisés à utiliser en conjonction avec des plaques de polystyrène pour la détection directe des analytes par analyse UV-Vis et spectroscopie Raman. Ce protocole permettra aux chercheurs d'adopter une approche do-it-yourself pour la détection future multi-analyte tout en capitalisant sur l'infrastructure pré-établie.

Introduction

dosages immunologiques en sandwich typique détecter indirectement la présence d'un antigène en utilisant deux anticorps. L'anticorps de capture est lié à une surface solide et forme un complexe anticorps-antigène lorsqu'il est à proximité d'un antigène approprié. Un anticorps de détection est ensuite introduit et se lie à l'antigène. Après lavage, les anticorps / antigène / anticorps et reste complexe est détecté par l'anticorps de détection marqué comme le montre la figure 1A. Détection typique est effectuée par un détecteur fluorescent ou colorimétrique, ce qui limite le multiplexage à 10 analytes en raison des larges pics s....

Protocole

1. Préparation des buffers

1. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
   1. Diluer 50 ml de 10x PBS avec 450 ml d'eau de qualité HPLC pour obtenir une concentration 1x PBS. filtrer de manière stérile la solution avec un filtre de 0,22 um.
   2. Conserver la solution à la température ambiante.
2. Préparation de Tris Buffered Saline + Tween 20 (TBST)
   1. Diluer 50 ml de solution saline tamponnée 10x Tris (TBS) avec 450 ml d'eau de qualité HPLC pour obtenir une concentration de 1x. Ajouter 250 pi de Tween-20 pour 0,05% (v / v) de Tween-20. filtrer de manière stérile la s....

Résultats

Dans cette étude, les 60 nm particules d'or ont été utilisés pour la spectroscopie UV-Vis. UV-Vis spectres d'absorption de 400 à 700 nm ont été recueillies et les surfaces des pics pour chaque concentration AUNP ont été déterminées en utilisant un logiciel open source d'analyse spectrale ^8. Avant pic d'intégration, les spectres collectés a subi une correction de base en utilisant un ajustement polynomial trois points. Les surfaces des pics ont été utilisées pour générer une courbe d'étalon.......

Discussion

Dans le protocole détaillé, il existe plusieurs points critiques pour faire face. Une question est le choix de Raman reporter et nanoparticules d'or. Bien que le protocole a été écrit pour être adapté à un usage individuel, Raman journaliste DCTC a été utilisé comme un exemple. DCTC est un journaliste chargé positivement et se lie à des surfaces telles que le citrate plafonné AuNPs chargé négativement. Ce protocole peut être adapté pour les journalistes chargés négativement en utilisant des nanoparticules d'or a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nanoparticule d’or 60 nm	Ted Pella, Inc.	15708-6	Il s’agit de nanoparticules d’or recouvertes de citrate. Veuillez consulter la discussion pour la relation entre le rapporteur Raman et la charge de surface AuNP et son importance pour la sélection appropriée de l’AuNP et/ou du rapporteur Raman.
Bicarbonate de sodium	Fisher Scientific	S233-500
	Méthanol Pharmco-Aaper	339000000
Tris Saline tamponnée (10x) pH 7,5	Scy Tek	TBD999
Unité de filtration par le haut de la bouteille	VWR	97066-202
Tween 20 (polysorbate 20)	Scy Tek	TWN500	Utilisé comme agent émulsifiant pour les étapes de lavage.
Concentré salin tamponné au phosphate 10x, pH 7,4	Scy Tek	PBD999
Tube LoBind protéiné 2,0  ; Les	tubes Eppendorf	22431102	les tubes LoBind empêchent la liaison des protéines et des AuNPs à la surface des tubes.
Tube Protéiné LoBind 0,5  ; ml	Les tubes Eppendorf	22431064	les tubes LoBind empêchent la liaison des protéines et des AuNPs aux surfaces des tubes.
Dispositifs pour microplaques UniSeal	GE Healthcare	7704-0001	Utilisé pour l’étanchéité et le stockage de plaques fonctionnalisées.
Plaque de dosage, avec couvercle à faible évaporation, 96 puits à fond plat	Costar	3370
Eau de qualité HPLC	Sigma Aldrich	270733-4L
3,3&prime ;-Diethylthiatricarbocyanine iodure (DTTC)	Sigma Aldrich	381306-250MG	Raman reporter
mPEG-Thiol, MW 5 000 - 1 gramme	Laysan Bio, Inc.	MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5 000 - 1  ; gram	Laysan Bio, Inc.	OPSS-PEG-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA a une extrémité NHS.
IgG de souris, contrôle de la molécule entière	Thermo Fisher Scientific	31903	Antigène
de chèvre anti-IgG de souris (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé	Thermo Fisher Scientific	31164	Anticorps
blocage de l’albumine sérique humaine	Sigma Aldrich	A1887-1G	L’albumine sérique bovine peut être utilisée à la place.
Mini centrifugeuse	Fisher Schientific	12-006-900
Spectrophotomètre UV-Vis	Thermo Scientific Nanodrop	2000c
Spectrophotomètre UV-Vis	BioTek	Synergy 2
Colonnes de dessalage	Thermor Scientific	87766
Fabriqué en interne 785  ; nm microscope Raman inversé N	/A	N/A	Un microscope Raman inversé est le meilleur pour une mise au point correcte sur la surface de la plaque de puits. Sinon, un très faible grossissement sera utilisé en raison de la hauteur de la plaque à 96 puits. Un système construit à l’interne a été utilisé, car il était moins cher que d’acheter auprès d’un fournisseur. Cependant, tout système de microscope Raman inversé disponible dans le commerce peut être utilisé.

Solution de