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Article de méthode

Mass histologie à Quantifier neurodégénérescence

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DOI :

10.3791/54809

⸱

15 décembre 2016

 , 
1Oregon Institute of Occupational Health Sciences, Oregon Health & Sciences University

Dans cet article

Résumé

Drosophile est largement utilisé en tant que système modèle pour étudier la neurodégénérescence. Ce protocole décrit un procédé par lequel une dégénérescence, comme déterminé par la formation de vacuoles dans le cerveau, peuvent être quantifiés. Il minimise également les effets dus à la procédure expérimentale par le traitement et le contrôle sectionner et les mouches expérimentales comme un échantillon.

Résumé

maladies progressives neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer (AD) ou la maladie de Parkinson (PD) sont une menace croissante pour la santé humaine dans le monde entier. Bien que les modèles de mammifères ont fourni des informations importantes sur les mécanismes sous-jacents de la pathogénicité, la complexité des systèmes de mammifères ainsi que leurs coûts élevés limitent leur utilisation. Par conséquent, le modèle système Drosophila simple mais bien établie offre une alternative pour étudier les voies moléculaires qui sont affectés dans ces maladies. Outre les déficits comportementaux, les maladies neurodégénératives sont caractérisées par des phénotypes histologiques tels que la mort neuronale et axonopathy. Pour quantifier la dégénérescence neuronale et de déterminer comment elle est affectée par des facteurs génétiques et environnementaux, nous utilisons une approche histologique qui est basé sur la mesure des vacuoles dans le cerveau des mouches adultes. Pour minimiser les effets de l'erreur systématique et de comparer directement les sections de contrôle et expmouches erimental dans une préparation, nous utilisons la méthode du «col» pour des coupes en paraffine. La neurodégénérescence est ensuite évaluée par la mesure de la taille et / ou le nombre de vacuoles qui se sont développées dans le cerveau de mouche. Cela peut être fait en se concentrant sur une région d'intérêt spécifique ou en analysant l'ensemble du cerveau en obtenant des coupes en série qui couvrent la tête complète. Par conséquent, cette méthode permet de mesurer non seulement la dégénérescence sévère, mais aussi des phénotypes relativement douces qui ne sont détectables que dans quelques sections, comme cela se produit au cours du vieillissement normal.

Introduction

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, les maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer ou de Parkinson sont devenus une menace pour la santé de plus en plus pour la population générale. Selon les instituts nationaux de la santé, 115 millions de personnes dans le monde sont prévus d'être affectées par la démence en 2050. Bien que des progrès significatifs ont été réalisés dans l'identification des gènes et des facteurs de risque impliqués dans au moins certaines de ces maladies, pour beaucoup d'entre eux, le sous-jacent mécanismes moléculaires sont encore inconnus ou mal compris.

Organismes modèles invertébrés simples comme Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster offrent une variété d'avantages expérimentaux pour étudier les mécanismes des maladies neurodégénératives, y compris un cycle court de la vie, un grand nombre de descendants, et la disponibilité des méthodes génétiques et moléculaires bien établies et parfois uniques 1 -12. En outre, ces organismes se prêtent à impartialeécrans d'interaction qui permettent d'identifier les facteurs qui contribuent à ces maladies par leurs effets aggravants ou améliorer sur phénotypes neurodégénératives.

L'analyse de ces interactions génétiques et évaluer les effets du vieillissement nécessite des protocoles quantitatifs pour détecter la neurodégénérescence et de mesurer sa gravité. Cette évaluation peut se faire relativement facilement lorsque l'on mesure les aspects comportementaux chez la drosophile, tels que l' apprentissage olfactif, géotaxie négative, ou phototaxie rapide, qui fournissent une valeur de performance numérique 13-21. Il est également possible de déterminer les effets sur la survie neuronale en comptant les neurones. Cependant, ceci est seulement possible lorsqu'on se concentre sur une population spécifique qui est clairement identifiable, comme les neurones dopaminergiques qui sont affectés dans la MP, et même alors, les résultats ont été controversés 22-24.

Le protocole décrit ici utilise la méthode du collier pour effectuer des coupes en série de paraffine, un procédéqui a été à l' origine développé par Heisenberg et Böhl, qui sert à isoler des mutants du cerveau anatomiques chez la drosophile 25. L'utilisation de la méthode du collier a été ensuite adapté, y compris dans cryocoupes, vibratome sections, et les sections en plastique 26-28. Ici, cette méthode est utilisée pour obtenir des coupes en série de la tête de la mouche entière, qui peut ensuite être utilisé pour mesurer les vacuoles qui se développent dans les mouches avec des phénotypes neurodégénératives 16,21,29-32. Ces mesures peuvent être effectuées dans des zones spécifiques du cerveau ou peuvent couvrir l'ensemble du cerveau; cette dernière approche permet d'identifier même faibles phénotypes dégénératives, comme observé au cours du vieillissement. Enfin, lors de l'utilisation des colliers, jusqu'à 20 mouches peuvent être traités comme une préparation, ce qui est non seulement moins de temps, mais permet également à l'analyse de contrôle et les mouches expérimentales dans la même préparation, en minimisant les artefacts dus à de légers changements dans la préparation.

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Protocole

1. Fixation de la tête sur les colliers et incorporation dans la paraffine

Note: Toutes les étapes du processus de fixation doit être fait dans une hotte. Méthylbenzoate, tout en ne posant un risque pour la santé, a une odeur très distincte, ce qui peut être écrasante en cas de manipulation dans une hotte.

  1. Avant anesthésier les mouches, forment 50 ml de solution Carnoy en ajoutant 15 ml de chloroforme et 5 ml d'acide acétique glacial à 30 ml d'éthanol à 99% (ne pas mélanger le chloroforme et l'acide acétique). Verser dans un récipient en verre à fond plat, comme un plat cristallisant, veiller à ce que les colliers peuvent poser à plat et sont complètement couvertes par la solution.
  2. Anesthetize les mouches avec du CO 2 ou de l' éther.
  3. les mouches de la discussion (jusqu'à 20 avec la plupart des colliers) par leur cou dans les colliers à l'aide de pinces. Rappelez - vous d'aligner toutes les têtes dans la même orientation, comme on le voit sur la figure 1A, et être doux pour assurer qu'aucun dommage se produit à la tête ou les yeux.
  4. Inclure les mouches sinus de oculis (flèches, Figure 1A) à des positions aléatoires de sorte que l'ordre des mouches peut être facilement identifié dans les sections. En outre, si les mouches expérimentales ont une couleur des yeux clair ou blanc, enfiler des mouches aux yeux rouges, comme le type sauvage, entre eux pour veiller à ce que le pigment est présent suffisamment pour colorer la diapositive. Notez l'ordre des mouches sur une feuille de protocole ainsi que le nombre de collier si vous utilisez plus d'un collier.
  5. Une fois un collier a été terminé, placez-le dans la solution préparée Carnoy pendant 3,5 - 4 h.
  6. Déverser la solution Carnoy dans la disposition cartouche appropriée et commencer les lavages à l'éthanol. Assurez-vous de verser lentement afin de ne pas perturber le placement des colliers dans le conteneur.
  7. Laver les colliers pendant 30 minutes dans 99% d'éthanol deux fois.
  8. Laver les colliers dans 100% d'éthanol pendant 1 h. Assurez-vous de changer les lavages à temps pour éviter overdehydration.
  9. Mettez les colliers en méthylbenzoateO / N à la température ambiante. Fermer le récipient avec du parafilm pour empêcher l'évaporation du benzoate de méthyle.
  10. Verser le methylbenozate dans le récipient jetable approprié dans la hotte. Ajouter un mélange préalablement préparé de 1: 1 à faible point de fusion (56-57 ° C) de la paraffine de cire et méthylbenzoate. A partir de ce moment-là, les colliers doivent être conservés dans un incubateur à 65 ° C pour faire en sorte que la paraffine ne durcit pas.
  11. Verser le methylbenozate et le mélange de paraffine dans le récipient jetable approprié et verser la cire de paraffine fondue pure, maintenue à 65 ° C sur les collerettes.
  12. Modifier la paraffine après 30 minutes et répéter ce au moins 5 fois. Au moins 6 - 8 lavages doivent être effectués.
  13. Une fois que les lavages sont complets, placez les colliers dans un bac à glaçons en caoutchouc avec des fentes d'environ la taille des colliers. Versez la paraffine fondue sur eux jusqu'à ce que complètement couvert et laisser durcir O / N (essayez d'éviter les bulles d'air).
  14. Retirez les blocs de paraffine containing les colliers à partir du bac à glaçons. Séparer le bloc de paraffine du collier à l'aide d'une lame de rasoir, brisant doucement le col. Les têtes seront dans le bloc de paraffine tandis que les corps restent dans le col. Les blocs peuvent être maintenus à la température ambiante.
  15. Pour nettoyer les colliers, les faire tremper dans un agent de deparafinization à 65 ° C pour éliminer la paraffine, propre avec lavage léger, et laver dans de l'éthanol avant de le réutiliser.

2. Sectionnement et montage

  1. Chauffer une plaque chauffante à 50 ° C. Placez les porte-objets (ou des blocs métalliques de montage) et des lames de rasoir sur la plaque et laissez-les réchauffer.
  2. En fonction de l'orientation souhaitée pour sectionner, fixer le bloc de paraffine, soit avec les têtes vers le côté (pour les sections horizontales) ou vers le haut (pour les sections frontales) à un bloc de montage chauffé (fondre brièvement le bloc du côté de contact). Retirez le bloc de la plaque chauffante et laisser refroidir pendant au moins 10 min pour veiller à ce que la paraffine est durcie suffisamment pour une bonne étanchéité sur le bloc de montage. Gardez la rangée de têtes alignées parallèlement à la surface du bloc, autant que possible pour éviter les sections inégales.
  3. Prenez une lame de rasoir et couper l'excédent de paraffine à l'écart des têtes de mouches de sorte que seule une petite rangée avec les têtes intégrés reste (la lame de rasoir peut être réchauffé pour faciliter la garniture). Assurez-vous de ne pas couper trop de sorte que la paraffine ne se casse pas pendant la coupe (plus parage peut être fait pendant la coupe).
  4. Placez le bloc de montage dans le porte-objet de la microtome et veiller à ce que l'alignement de la rangée de têtes est aussi parallèle que possible du bord de la lame.
  5. Préparer des lames de microscope en les recouvrant d'une fine couche de poly-L-lysine (PLL) solution et les laisser sécher pendant 5 min. Couvrez-les avec de l'eau peu avant d'utiliser.
  6. Couper 7 um sections et transférer le ruban de sections à la diapositive flottant sur l'eau.
    NOTE: Pour obtenir l'ensemble du cerveau pour les sections horizontales, nous recueillons le ruban à partir de quand commencer à couper dans l'oeil jusqu'à ce que la tête a été complètement coupé (coupe de la trompe dans le cerveau). Plus d'une diapositive peut être nécessaire pour l'ensemble de la tête.
  7. Placer la lame sur une plaque chauffante à 37 ° C et laisser le ruban d'étendre pendant environ 1 min.
  8. Retirer l'excès d'eau (en le versant hors ou à l'aide d'un tissu) et sécher les diapositives O / N.
  9. Retirez la cire de paraffine de la diapositive en plaçant les lames dans un, vertical jar grand slide-coloration rempli d'un agent de deparafinization (recouvrant complètement les sections). Effectuer 3 lavages de 30 min - 60 min chacun.
  10. Retirer la lame du lavage final. Placez 2 gouttes de médias d'enrobage sur la lame et le couvrir avec une grande lamelle.

3. Photographier et analyse les sections

  1. Laisser les lames préparées à sécher pendant 1 - 2 d. Ensuite, examinez-les sur une Microsc de fluorescenceope sous une lumière bleue.
  2. Utilisez un faible grossissement pour déterminer l'orientation des mouches et de trouver la région d'intérêt se concentrant sur une région spécifique.
    NOTE: Pour les mouches de sws (voir la figure 2), on trouve la section qui contient la grande commissure et de prendre une image (généralement à un grossissement de 40X). Lors de l' analyse de la totalité du cerveau (comme dans la figure 3), nous faisons défiler à travers toutes les sections de la tête et soit photographier la section avec le phénotype le plus sévère ou toutes les sections qui montrent vacuoles.
  3. Pour une analyse en double aveugle, prendre et images numériques sans connaître le génotype et enregistrer le nombre de cols et de la position de la tête dans la ligne pour les identifier plus tard.
  4. Une fois que les images ont été prises, de les analyser en utilisant un logiciel d'imagerie.
  5. Comptez le nombre de vacuoles par section ou par tête. Pour mesurer la taille de la vacuole, ouvrez les images dans un logiciel et sélectionnez les vacuoles avec une sélection tropl. Déterminer la quantité de pixels dans les vacuoles sélectionnés.
  6. Pour la conversion en um 2, prendre une photo d'un étalonnage micromètre d'étape au grossissement utilisé pour acquérir des photos. Déterminer la quantité de pixels à 100 um 2 pour calculer un facteur de conversion.
  7. Convertir le nombre total de pixels en um 2 en divisant le nombre de pixels par le facteur de conversion calculé à l'étape précédente.

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Résultats

En utilisant les résultats de la méthode décrite dans les sections en série colorées par le pigment de l' œil 33 qui englobent la tête de la mouche entière. Une partie de ceci est montré à la figure 1B, où les sections à partir d' une tête individuelle sont présentés de haut en bas. Les sections de différentes mouches sont vu de gauche à droite dans cet exemple. Pour faciliter l' orientation et l' identification des mouches, une mouche eyeless ...

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Discussion

Le procédé décrit fournit un moyen pour quantifier la neurodégénérescence dans le cerveau de la drosophile. Alors que d'autres méthodes, telles que le comptage d'un type de cellule spécifique, peuvent être utilisées pour identifier la neurodégénérescence, l'avantage de cette méthode est qu'elle peut être appliquée de façon plus générale. Le comptage des cellules exige que ces cellules puissent être identifiées de façon fiable en utilisant soit un anticorps spécifique ou l'expression d'un...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions accordées à D.K. par la Fondation pour la recherche médicale de l’Oregon et par les NIH/NINDS (NS047663). E.S. a été soutenu par une subvention de formation des NIH (T32AG023477).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom de l’entreprise de réactifs/équipementsNuméro
CollierGenesee ScientificTS 48-100Nous utilisons des colliers sur mesure qui sont fabriqués à partir d’une seule pièce de métal au lieu de couches comme ceux de Genesee. Une description sur la façon de fabriquer des colliers peut être trouvée à http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html  ;
Bac à glaçons en caoutchouc pour l’encastrementMagasinLa taille peut être adaptée en collant des murs supplémentaires.
Boîte de cristallisationFisher Scientific company08-762-3
EtherFisher Scientific CompanyE138-1
EthanolDecon Laboratories Inc.2701
CholoroformFisher Scientific CompanyC298-500
Acide acétique glacialFisher Scientific CompanyA38-212
MethylbenzoateFisher Scientific CompanyM205-500Odeur distincte - À utiliser dans la hotte !
Cire de paraffine à bas point de fusionFisher Scientific CompanyT565Assurez-vous de garder extra fondu dans un 65° ; C Bain d’eau
MicrotomeLeica BiosystemsReichert Jung 2040 Lame de microscope autodécoupée
FisherScientific Company12-550D Couvercle de
microscope en verreFisher Scientific Company12-545-M
SafeClearFisher Scientific Company314-629Trois récipients différents pour les lavages
Pot de coloration vertical avec CouvertureTed Pella Inc.432-1
PermountFisher Scientific CompanySP15-500
Solution de poly-L-lysine (PLL)Sigma Life ScienceP8290-500
de catalogue ménager

Références

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