Mass histologie à Quantifier neurodégénérescence<em&gt; Drosophila</em

Résumé

Drosophile est largement utilisé en tant que système modèle pour étudier la neurodégénérescence. Ce protocole décrit un procédé par lequel une dégénérescence, comme déterminé par la formation de vacuoles dans le cerveau, peuvent être quantifiés. Il minimise également les effets dus à la procédure expérimentale par le traitement et le contrôle sectionner et les mouches expérimentales comme un échantillon.

Résumé

maladies progressives neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer (AD) ou la maladie de Parkinson (PD) sont une menace croissante pour la santé humaine dans le monde entier. Bien que les modèles de mammifères ont fourni des informations importantes sur les mécanismes sous-jacents de la pathogénicité, la complexité des systèmes de mammifères ainsi que leurs coûts élevés limitent leur utilisation. Par conséquent, le modèle système Drosophila simple mais bien établie offre une alternative pour étudier les voies moléculaires qui sont affectés dans ces maladies. Outre les déficits comportementaux, les maladies neurodégénératives sont caractérisées par des phénotypes histologiques tels que la mort neuronale et axonopathy. Pour quantifier la dégénérescence neuronale et de déterminer comment elle est affectée par des facteurs génétiques et environnementaux, nous utilisons une approche histologique qui est basé sur la mesure des vacuoles dans le cerveau des mouches adultes. Pour minimiser les effets de l'erreur systématique et de comparer directement les sections de contrôle et expmouches erimental dans une préparation, nous utilisons la méthode du «col» pour des coupes en paraffine. La neurodégénérescence est ensuite évaluée par la mesure de la taille et / ou le nombre de vacuoles qui se sont développées dans le cerveau de mouche. Cela peut être fait en se concentrant sur une région d'intérêt spécifique ou en analysant l'ensemble du cerveau en obtenant des coupes en série qui couvrent la tête complète. Par conséquent, cette méthode permet de mesurer non seulement la dégénérescence sévère, mais aussi des phénotypes relativement douces qui ne sont détectables que dans quelques sections, comme cela se produit au cours du vieillissement normal.

Introduction

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, les maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer ou de Parkinson sont devenus une menace pour la santé de plus en plus pour la population générale. Selon les instituts nationaux de la santé, 115 millions de personnes dans le monde sont prévus d'être affectées par la démence en 2050. Bien que des progrès significatifs ont été réalisés dans l'identification des gènes et des facteurs de risque impliqués dans au moins certaines de ces maladies, pour beaucoup d'entre eux, le sous-jacent mécanismes moléculaires sont encore inconnus ou mal compris.

Organismes modèles ....

Protocole

1. Fixation de la tête sur les colliers et incorporation dans la paraffine

Note: Toutes les étapes du processus de fixation doit être fait dans une hotte. Méthylbenzoate, tout en ne posant un risque pour la santé, a une odeur très distincte, ce qui peut être écrasante en cas de manipulation dans une hotte.

1. Avant anesthésier les mouches, forment 50 ml de solution Carnoy en ajoutant 15 ml de chloroforme et 5 ml d'acide acétique glacial à 30 ml d'éthanol à 99% (ne pas mélanger le chloroforme et l'acide acétique). Verser dans un récipient en verre à fond plat, comme un plat cristallisant, veiller à ce que les colliers peuvent poser à plat e....

Résultats

En utilisant les résultats de la méthode décrite dans les sections en série colorées par le pigment de l' œil ³³ qui englobent la tête de la mouche entière. Une partie de ceci est montré à la figure 1B, où les sections à partir d' une tête individuelle sont présentés de haut en bas. Les sections de différentes mouches sont vu de gauche à droite dans cet exemple. Pour faciliter l' orientation et l' identification des mouches, une mouche eyeless .......

Discussion

Le procédé décrit fournit un moyen pour quantifier la neurodégénérescence dans le cerveau de la drosophile. Alors que d'autres méthodes, telles que le comptage d'un type de cellule spécifique, peuvent être utilisées pour identifier la neurodégénérescence, l'avantage de cette méthode est qu'elle peut être appliquée de façon plus générale. Le comptage des cellules exige que ces cellules puissent être identifiées de façon fiable en utilisant soit un anticorps spécifique ou l'expression d'un.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de l’entreprise de réactifs/équipements		Numéro
Collier	Genesee Scientific	TS 48-100	Nous utilisons des colliers sur mesure qui sont fabriqués à partir d’une seule pièce de métal au lieu de couches comme ceux de Genesee. Une description sur la façon de fabriquer des colliers peut être trouvée à http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html  ;
Bac à glaçons en caoutchouc pour l’encastrement	Magasin		La taille peut être adaptée en collant des murs supplémentaires.
Boîte de cristallisation	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Acide acétique glacial	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Odeur distincte - À utiliser dans la hotte !
Cire de paraffine à bas point de fusion	Fisher Scientific Company	T565	Assurez-vous de garder extra fondu dans un 65° ; C Bain d’eau
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Lame de microscope autodécoupée
Fisher	Scientific Company	12-550D Couvercle de
microscope en verre	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Trois récipients différents pour les lavages
Pot de coloration vertical avec Couverture	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Solution de poly-L-lysine (PLL)	Sigma Life Science	P8290-500

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