Article de méthode

Visualiser le tissu interrénal stéroïdogénique et son vasculaire Microenvironnement dans Zebrafish

DOI :

10.3791/54820

⸱

21 décembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Life Science, Tunghai University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La glande interrénal chez le poisson zèbre est la contrepartie téléostéen de la glande surrénale chez les mammifères. Ce protocole présente comment effectuer la déshydrogénase 3-β-hydroxystéroïde (Δ 5-4 isomérase; 3β-HSD) dosage de l' activité enzymatique, qui détecte les cellules stéroïdogènes différenciées chez le poisson zèbre en développement.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole explique comment détecter les cellules stéroïdogéniques interrénales différenciées par un simple test d’activité enzymatique sur l’ensemble du montage. L’identification des tissus stéroïdogènes différenciés par coloration histochimique chromogène des cellules à activité positive de la 3-β-hydroxystéroïde déshydrogénase /Δ5-4 isomérase (3β-Hsd) est essentielle pour surveiller la morphologie et la différenciation des tissus corticosurrénaliens et interrénaux chez les mammifères et les téléostéens, respectivement. Dans le modèle du poisson-zèbre, la transparence optique et la perméabilité tissulaire des embryons et des larves en développement permettent une coloration complète de l’activité 3β-Hsd. Ce protocole de coloration, tel qu’il est réalisé sur des lignes de rapporteurs fluorescents transgéniques marquant les cellules pronéphriques et endothéliales en développement, permet de détecter le tissu interrénal stéroïdogène en plus du rein et du système vasculaire voisin. En combinaison avec la coupe en vibratome, l’immunohistochimie et la microscopie confocale, nous pouvons visualiser et doser le microenvironnement vasculaire des tissus stéroïdogènes interrénaux. Le test d’activité 3β-Hsd est essentiel pour l’étude de la biologie cellulaire de la glande interrénale du poisson-zèbre car à ce jour, aucun anticorps approprié n’est disponible pour le marquage des cellules stéroïdogènes du poisson-zèbre. De plus, ce test est rapide et simple, fournissant ainsi un outil puissant pour les criblages de mutants ciblant les troubles génétiques surrénaliens (interrénaux) ainsi que pour déterminer les effets de perturbation des produits chimiques sur la stéroïdogenèse dans les études pharmaceutiques ou toxicologiques.

Introduction

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La glande surrénale, un élément crucial de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien, sécrète stéroïdes et coordonne l'homéostasie des stéroïdes et la réponse du corps au stress. La glande surrénale comprend le cortex externe, qui sécrète des stéroïdes d'une manière spécifique de la zone, et la médulla interne, qui synthétise catécholamines. La glande interrénal en téléostéens est la contrepartie de la glande surrénale chez les mammifères et est composé de cellules interrénales et chromaffines stéroïdogenèse, qui sont des équivalents fonctionnels du cortex surrénalien et de la moelle, respectivement 1-3. Des études réalisées en utilisant le modèle de poisson zèbre ont rapporté que les deux lignées de cellules chromaffines stéroïdogenèse et sont formées par des mécanismes moléculaires et cellulaires très semblables à ceux des mammifères 1,2. Par conséquent, le poisson zèbre est un modèle potentiellement puissant pour l'étude des troubles génétiques, le contrôle neuroendocrine, et la biologie des systèmes de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (interrénal).

Dans la glande surrénale, 3β-HSD catalyse la conversion de la progestérone à partir de prégnénolone, 17α-hydroxyprogestérone , de la 17α-hydroxypregnelolone et de l' androstènedione déhydroépiandrostérone 4,5. 3β-HSD est essentiel pour la biosynthèse toutes les classes de stéroïdes hormonaux, à savoir la progestérone, les glucocorticoïdes, les minéralocorticoïdes, les androgènes et oestrogènes. Les deux 3β-HSD humaine isoenzymes HSD3B1 et HSD3B2 sont exprimés de manière différentielle 6. HSD3B1 est exprimée dans le placenta et les tissus périphériques, tandis que HSD3B2 est exprimée dans le cortex surrénal et les gonades. HSD3B1 humaine et HSD3B2 sont co-orthologues de HSD3B1 zebrafish, qui est exprimé au niveau du tissu interrénal et les gonades adultes; hsd3b2 zebrafish est un gène maternellement exprimé dont les transcriptions disparaître avant organogenèse 7. Le protocole de l'ensemble de montage 3β-HSD dosage d'activité enzymatique pour le poisson zèbre est développé en modifiant la méthode de Levy,s décrite par Milano et al. , Sur des coupes congelées de huit espèces de téléostéens 8. En raison de la perméabilité du tissu et de la transparence optique du poisson zèbre développement, l'ensemble du montage 3β-HSD histochimie peut être utilisé avec succès pour l'embryon de poisson zèbre fixe et les larves, et plus particulièrement à délimiter les tissus différenciés interrénales.

Ce dosage rapide et sensible a été appliquée à divers mutants et morphants montrent différents types de dysmorphogenèse interrénal. L'activité 3β-HSD interrénal est absent dans l'embryon , où la spécification du tissu interrénal est perturbé par un effet de choc spécifique du facteur de transcription Ff1b et diminue à mesure que la différenciation interrénal est affectée par un effet de choc de la co - régulateur Ff1b Prox1 9,10. Notamment, l'activité 3β-HSD peuvent être détectés chez des mutants présentant des défauts graves à un stade précoce, comme borgnes tête d' épingle et strabisme, où le 3β-Hsd histochimie définit la façon dont la migration cellulaire interrénal est affectée 11. La différenciation du tissu interrénal ne soit pas compromise, même en l'absence complète de sang et le système vasculaire. Par conséquent, comment les signaux de endothéliale façonnent l'organe interrénal développement peut être déterminé 12,13. Dans l'ensemble, cette analyse histochimique a été utilisé avec succès pour l'étude de la spécification, la différenciation et la migration des cellules stéroïdogènes dans le modèle de poisson zèbre. Par conséquent, il devrait être un moyen efficace et un outil fiable pour tous les écrans génétiques ou chimiques ciblant les troubles des organes surrénales et interrénales.

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Protocole

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Déclaration éthique: Toutes les procédures expérimentales sur le poisson zèbre ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université Tunghai (Approbation CISR NO 101-12.) Et réalisée en conformité avec les lignes directrices approuvées.

1. Stock Solutions pour 3β-HSD activité enzymatique Coloration

  1. Préparer le trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml dans du diméthylsulfoxyde (DMSO)].
  2. Préparer l'hydrate β-nicotinamide adénine dinucléotide (1,2 mg / ml dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,2).
  3. Préparer nicotinamide (vitamine B3, 50 mg / ml dans H 2 O).
  4. Préparer tétrazolium 4-nitro (50 mg / ml dans 70% de diméthylformamide).
  5. Aliquotes tous ces composants dans des tubes de microcentrifugation et conserver à -20 ° C.
    NOTE: Dans notre expérience, la congélation et la décongélation des aliquotes de toutes les solutions mentionnées ci-dessus répétées n'affectent l'intensité de l'activité 3β-HSD coloration.

2. Wtrou de montage 3β-HSD Activité Coloration

REMARQUE: L'activité enzymatique 3β-HSD est détectable dans les embryons de poisson zèbre aussi tôt que 28 heures après la fécondation (HPF) lorsqu'elles sont cultivées à 28,5 ° C, ce qui est cohérent avec l'apparition de l' expression d'ARNm de 2,7 HSD3B1. Le tout montage 3β-HSD protocole activité de coloration dans cette étude est basée sur une méthode décrite précédemment 8 et était déterminé à réussir dans le zebrafish développer jusqu'à 7 jours après la fécondation 9. Pour analyser la micro - vasculaire du tissu stéroïdogénique interrénal, l' ensemble du montage 3β-HSD coloration d' activité doit être appliquée à des lignées transgéniques exprimant une fluorescence spécifique de l' endothélium, telles que Tg (kdrl: EGFP) S843 14 et Tg (kdrl: mCherry) CI5 15 . Pour analyser le tissu stéroïdogénique interrénal considérant le développement du rein zebrafish, l'activité 3β-HSD coloration peut être applied à la Tg (wt1b: GFP) li1 poissons 16, où la formation du glomérule et pronephrique tubules est délimitée.

  1. Traiter le poisson zèbre développement en les incubant à 0,03% phénylthiourée dans l'eau d'oeuf (sel de 0,06 mg / L ris dans de l'eau déminéralisée), à ​​partir d'une étape entre 12 et 24 HPF, pour inhiber la formation de pigment.
  2. Fixer des embryons ou des larves dechorionated en (A) 4% de paraformaldehyde (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS) supplémenté avec 0,1% de Tween 20 (PFAT) pendant 1 h à température ambiante (TA) ou (B) 2% PFAT pendant une nuit à 4 ° C ou pendant 2 h à 4 ° C, puis 4 heures à température ambiante.
    Attention: PFA est toxique par inhalation et par contact avec la peau. Il est destructeur pour la peau, les muqueuses, les yeux et les voies respiratoires supérieures.
  3. Laver l'embryon 4x pendant 10 min avec du PBS additionné de 0,1% de Tween 20 (PBST) à température ambiante.
    NOTE: Il est essentiel de ne pas sécher les échantillons tout en changeant les solutions de lavage.
  4. Fraîchement préparer la staining solution avant que les réactions (tableau 1). Préparer, vortex, et des pièces de centrifugeuse A et B dans des tubes séparés.
    REMARQUE: l'ajout de tous les composants directement dans un seul tube provoquerait une forte précipitation.
  5. Ajouter la solution complète de la partie A à la solution complète de la partie B, bien mélanger pour préparer la solution de coloration, et distribuer immédiatement 1 ml dans chaque tube microfuge contenant des embryons fixes et lavés.
  6. Enveloppez microtubes de papier d'aluminium pour les protéger de la lumière et le lieu soit sur un rotateur ou une plate-forme à bascule pour agitation douce à température ambiante.
  7. Déterminer empiriquement le temps de réaction en surveillant les signaux chromogéniques par microscopie. De légères précipitations vont se développer au fil du temps; cependant, ils ne vont pas interférer avec le processus réactionnel.
    NOTE: Pour les embryons fixés à 28 HPF, coloration à 25 ° C pendant 4 heures génère un signal clair au niveau du tissu interrénal.
  8. Arrêter la réaction par lavage 4x pendant 10 minutes dans du PBST. jef aucune autre immunohistochimique (IHC) analyse est nécessaire, après la fixation des embryons colorés avec 4% PFAT pendant 60 min à température ambiante. Sinon, stocker les embryons lavés à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
  9. Pour la microscopie toute monture, effacer les tachés, post-fixes, et lavé les embryons avec 50% de glycérol dans du PBS, les orienter avec la face dorsale vers le haut sur une lame, et d'observer à l'aide d'un microscope droit sous un éclairage de champ lumineux.
    NOTE: Pour faire une image à haute résolution de la morphologie des tissus interrénal, l'analyse de l'embryon 3β-HSD activité tachés et deyolked plat de montage est recommandé. Comme le tissu stéroïdogénique interrénal est positionné juste au- dessus de la vésicule ombilicale, une analyse ventrale plate-montage du tissu interrénal permet une observation directe et claire de la morphologie interrénal 17.

3. IHC Analyse des 3β-HSD Embryons Activité tachés

NOTE: Pour l'analyse du microenvironnement vasculaire du steroitissus dogenic, les embryons d'activité tachés 3β-HSD avec un rapporteur fluorescent spécifique de l' endothélium transgénique sont soumis transversaux vibratome tronçonnage et après analyse IHC 12,18.

  1. Post-fixation
    1. Post fixer les embryons 3β-HSD activité colorées et lavées avec 2% de PFA supplémenté avec 1% de Triton X-100 pendant 1 heure à 4 ° C et laver 4 x 10 min dans du PBS contenant 1% de Triton X-100 (PBSTx) à la température ambiante.
  2. Incorporation
    1. Préparer 4% à faible point de fusion d'agarose par dissolution de l'agarose dans du PBS à 95 ° C, aliquote dans des tubes de microcentrifugation, et stocker à 4-8 ° C.
    2. Faire fondre une partie aliquote de 4% à faible point de fusion d'agarose à 70 ° C pendant 10 min, puis maintenir la partie aliquote à 47 ° C. Incluez chaque embryon en fusion 4% à faible point de fusion d'agarose dans un bouchon détaché d'un tube de 1,5 ml qui sert de moule et laisser refroidir jusqu'à ce que solide.
  3. vibratome sectionnement
    1. Collez un morceau de ruban de papier à la p seclatform du vibratome.
    2. Retirer le bloc d'agarose durci du moule par une lame de rasoir. Appliquer superglue sur la bande de papier sur la plate-forme, et fixer le bloc d'agarose sur la bande de papier, avec la face antérieure de l'échantillon vers le haut. Couper le bloc d'agarose à une forme trapézoïdale prisme, à environ 4 mm et 8 mm de chaque côté des facettes supérieures et inférieures, respectivement.
    3. Rincer le bloc d'agarose contenant l'échantillon avec du PBS froid complémenté avec 0,5% de Triton X-100 (0,5% PBSTx) à l'aide d'un compte-gouttes.
    4. Trancher le bloc d'agarose dans 100 um sections selon le manuel d'instructions du vibratome. rincez constamment le bloc d'agarose pour éviter le dessèchement. Comme chaque tranche est coupée, retirez-le du vibratome en utilisant une aiguille G 26 de la seringue, et transférer sur une plaque de tache contenant froid 0,5% PBSTx (500 pl / puits).
    5. Recueillir des coupes de tissus d'activité positive les 3ß-HSD en vérifiant sous un microscope de dissection, et transférer les sections par un pipointe pette avec son extrémité de coupure (environ 1 mm de diamètre intérieur à l'ouverture) dans une plaque de 96 puits contenant froid 0,5% PBSTx (150 pl / puits). Les échantillons de tissu se dissocient généralement à partir du bloc d'agarose après cette étape.
  4. Perméabilisation et laver
    1. Laver les tranches 6x pendant 15 min dans 0,5% PBSTx à la température ambiante, 10 minutes dans du PBS, et 4x pendant 10 min dans du PBS additionné de 1% de sérum albumine bovine / 1% de DMSO / 0,1% de Triton X-100 (PBDTx).
  5. Blocage
    1. Incuber les tranches pendant 1 heure à 2% de sérum de foetus de veau (FCS) dans PBDTx à température ambiante.
  6. Réaction d'anticorps primaire
    1. Incuber les tranches pendant 1,5 jours dans PBDTx contenant un anticorps primaire (par exemple polyclonal de lapin anti- fibronectine humaine et de souris anti-humain kinase d' adhésion focale) à 4 ° C.
  7. La lessive
    1. Laver les tranches 6x pendant 10 min dans PBDTx à la température ambiante.
  8. Blocage
    1. Incuber les tranches pendant 1 heure dans 2% de FCS dans PBDTx à la température ambiante.
  9. Réaction d'anticorps secondaire
    1. Incuber les tranches pendant 1,5 jours dans PBDTx contenant un anticorps secondaire (fluorophore conjugué de chèvre anti-lapin ou anti-IgG de souris) à 4 ° C.
  10. La lessive
    1. Laver les tranches 6x pendant 10 min à température ambiante dans PBDTx et 4x pendant 10 minutes dans du PBST à température ambiante.
      NOTE: Pour une analyse microscopique confocale, effacer les échantillons avec 50% de glycérol dans du PBS.

4. confocale Analyse

  1. Observer l'ensemble embryon de montage et la section par un microscope confocal équipé de 10X / 20X et 0,5 / 0,75 objectif.
  2. Pour la détection simultanée de la fluorescence et la coloration 3β-HSD, régler le mode multipiste comme suit: 488 nm laser à l'argon et 505-530 nm filtre passe-bande pour la détection de la GFP; 543 nm laser hélium-néon et 560-615 nm filtre passe-bande pour la détection de mCherry; et transmis canal de lumière pour la détection de la 3β-HSD coloration.La taille sténopé est 1 unité Airey, et la résolution est de 1024 x 1024 pixels.
  3. Assembler les z piles (avec 6 intervalle de um) comme une projection 3D, et de fusionner la projection et le champ lumineux, en utilisant le logiciel intégré confocal.

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Résultats

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Pour déterminer comment les codevelops de tissus interrénales stéroïdogènes avec le glomérule du rein pronephrique et son vascularisation naissante, le dosage de l' activité enzymatique 3β-HSD a été réalisée sur la double transgénique Tg (wt1b: GFP) li1; Tg (kdrl: mCherry) CI5 embryon à 34 HPF (figure 1). A ce stade, le tissu stéroïdogénique activité positive 3β-HSD est situé juste à la ligne médiane et caudale immédiatement au rein gloméru...

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Discussion

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L'intensité du signal de l'activité 3β-HSD a augmenté au cours de la réaction. Des signaux clairs de l'activité 3β-HSD ont été détectées après 4 heures de réaction pour les étapes à partir de 28 HPF en avant. Toutefois, la durée de la réaction nécessite la détermination empirique, en fonction du but de l'essai. Dans le cas où la coloration nécessite un traitement pendant une nuit, un fond légèrement bleutée tend à se développer sur les échantillons. Ce problème peut être surmonté en augmentant la durée d...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrent à déclarer.

Remerciements

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Nous remercions Prof. Christoph Englert et le Professeur Didier Stainier pour les dons de la Tg (wt1b: GFP) li1 et Tg (kdrl: EGFP) S843 souches, respectivement, et la facilité de Taiwan Zebrafish de base pour fournir Tg (kdrl: mCherry) CI5. Cette étude a été soutenue par des subventions du ministère de Taiwan de la science et de la technologie (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope confocalCarl Zeiss  ;LSM510  ;
DMSOSigmaD8418  ;
GlycérolUSBUS16374
Sérum de veau fœtal Hyclone  ;GE Healthcare Life SciencesSH30073
NicotinamideSigmaN0636
&beta ;-Nicotinamide adénine dinucléotidehydrate SigmaN1636
4-Nitro blue tetrazoliumPromegaS380C
Nusieve GTGLonza50081
ParaformaldéhydeSigmaP6148
Phénylthiouréesigma  ;P7629
Saline tamponnée au phosphateSigmaP4417-100Tab
PYREX Spot PlateCorning7220-85
Sel de récifAZOOAZ28001
trans-DéhydroandrostéroneSigmaD4000
Triton X-100SigmaT8787
Tween 20SigmaP9416
VibratomeLeicaVT1000M

Références

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  1. Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
  2. To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
  3. Liu, Y. W. Interrenal organogenesis in the zebrafish model. Organogenesis. 3, 44-48 (2007).
  4. Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
  5. Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551(1992).
  6. Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
  7. Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
  8. Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
  9. Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
  10. Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
  11. Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
  12. Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997(2014).
  13. Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
  14. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  15. Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
  16. Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
  17. Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
  18. Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040(2012).

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Mots-clés

Interrenal Steroidogenic TissueZebrafish Embryos3 Hsd Activity AssayWhole Mount StainingVibratome SectioningConfocal MicroscopyTransgenic Reporter LinesVascular MicroenvironmentPronephric KidneyEndothelial Cells

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