Biofilm Enlèvement des Aérosols de dioxyde de carbone sans purge d'azote

Résumé

Les biofilms sur les surfaces peuvent être éliminés efficacement et rapidement en utilisant un jet périodique d’aérosols de dioxyde de carbone sans purge d’azote.

Résumé

Les biofilms peuvent poser de sérieux problèmes dans de nombreuses applications. Non seulement ils peuvent causer des pertes économiques, mais ils peuvent également présenter un risque pour la santé publique. Par conséquent, il est hautement souhaitable d’éliminer les biofilms des surfaces. De nombreuses études sur le nettoyage des aérosols de_CO2 ont utilisé des purges à l’azote pour augmenter l’efficacité de l’élimination du biofilm en réduisant la condensation d’humidité générée pendant le nettoyage. Cependant, dans cette étude, des jets périodiques d’aérosols de CO₂ sans purges d’azote ont été utilisés pour éliminer les biofilms de Pseudomonas putida des surfaces en acier inoxydable poli. Les aérosols de CO₂ sont des mélanges de CO₂ solide et gazeux et sont générés lorsque le gaz CO₂ à haute pression est détendu adiabatiquement à travers une buse. Ces aérosols à grande vitesse ont été appliqués sur un biofilm qui avait été cultivé pendant 24 heures. L’efficacité d’élimination variait de 90,36 % à 98,29 % et a été évaluée en mesurant l’intensité de fluorescence du biofilm alors que le temps de traitement variait de 16 secondes à 88 secondes. Nous avons également réalisé des expériences pour comparer les efficacités d’élimination avec et sans purges d’azote ; Les efficacités d’élimination du biofilm mesurées n’étaient pas significativement différentes les unes des autres (test T, P > 0,55). Par conséquent, cette technique peut être utilisée pour nettoyer diverses surfaces biocontaminées en une minute.

Introduction

Les biofilms sont des structures complexes de communautés bactériennes dans lesquelles les cellules bactériennes sont intégrées dans des matrices autoproduites de substances polymères extracellulaires, maintenues ensemble et protégées de l’environnement extérieur. Les biofilms peuvent présenter un risque pour la santé publique et entraîner des pertes économiques, car ils peuvent se former sur diverses surfaces, notamment les matériaux et dispositifs d’implants médicaux, les équipements de transformation des aliments et les échangeurs de chaleur. En fait, les biofilms se sont avérés être associés à 65 % de toutes les maladies infectieuses bactériennes chez l’homme, selon les Centers for Disease Control and Prevention¹.

Les autoclaves et les désinfectants tels que le chlore ont généralement été utilisés pour l’inactivation des biofilms. Cependant, l’utilisation d’un autoclave est limitée pour les surfaces qui ne peuvent ni résister à la vapeur à haute température ni être placées dans l’autoclave. Les désinfectants ne conviennent pas aux surfaces sensibles aux traitements chimiques ou sujettes à la collecte de produits d’oxydation toxiques². De plus, le biofilm doit non seulement être inactivé, mais également éliminé afin d’éviter la fixation de nouvelles cellules à la surface, formant ainsi un nouveau biofilm³. Cependant, il est difficile d’éliminer les biofilms à l’aide de méthodes basées sur le cisaillement des fluides visqueux, car la vitesse d’écoulement près de la surface est presque nulle et la force de cisaillement ne peut généralement pas surmonter les forces d’adhérence des substances de taille micronique et submicronique. De plus, la matrice du biofilm est connue pour agir comme une barrière physique et chimique¹.

De nombreuses techniques physiques et mécaniques ont été développées pour éliminer les biofilms des surfaces, notamment les vibrations ultrasonores¹, les courants électriques⁴, l’irradiation laser⁵ et les pulvérisations d’eau à haute pression⁶. Chaque technique a ses propres avantages et inconvénients. Les vibrations ultrasoniques et le courant électrique peuvent être utilisés pour contrôler la formation de biofilm ; Cependant, ils nécessitent une configuration particulière et des surfaces conductrices, respectivement, nécessitant une contrainte de cisaillement supplémentaire^{1, 4}. L’irradiation laser peut être appliquée sur une zone limitée et sur des surfaces dures ; Cependant, certaines cellules vivantes et mortes restent à la surface⁵. Les pulvérisations d’eau à haute pression éliminent efficacement les biofilms ; Cependant, leur élan élevé peut endommager les substrats mous⁶.

élimination du biofilm à l’aide d’aérosols de_CO2 a été précédemment proposée. Il a montré des résultats prometteurs, avec des efficacités d’élimination élevées dans un court laps de temps^7-11. Les aérosols de CO₂ sont générés par l’expansion adiabatique d’un gaz CO₂ à haute pression à travers une buse, et ils sont appliqués sur les surfaces contaminées par un biofilm. Cette technique de nettoyage utilise le transfert de quantité de mouvement des particules solides de CO₂ et l’action solvante des liquides de CO₂ fondus, suivie de la force de cisaillement aérodynamique du gaz CO₂ ¹². Par rapport aux jets de gaz N₂ à haute pression, les jets d’aérosol de CO₂ à la même pression de stagnation sont beaucoup plus efficaces pour éliminer les biofilms d’E. coli ⁷. De plus, bien que la quantité de mouvement du CO₂ solide qui est délivré aux bactéries soit considérablement élevée, la quantité de mouvement du jet d’aérosol total appliqué sur la surface solide est nettement inférieure à celle des jets d’eau. Par conséquent, un nettoyage sans dommage est possible en utilisant cette technique d’aérosol de_CO2.

Dans ce protocole, des jets périodiques d’aérosols de_CO2 sans purges à l’azote ont été utilisés pour éliminer les biofilms de Pseudomonas putida d’une surface en acier inoxydable poli. En fait, les purges à l’azote ont été utilisées dans de nombreuses études sur les aérosols de_CO2 pour augmenter l’efficacité de l’élimination en réduisant la condensation d’humidité générée pendant le nettoyage, même si le chauffage avec une plaque chauffante ou des lampes infrarouges et l’utilisation de boîtes sèches ont également été adoptés¹². La formation du biofilm de surface et les procédures de nettoyage optimisées sont décrites ci-dessous. L’efficacité d’élimination a été évaluée en mesurant l’intensité de fluorescence du biofilm à la surface.

Protocole

1. Préparation de la surface pour la formation du biofilm

1. Couper 1 mm d'épaisseur , 304 plaques d'acier inoxydable en copeaux (10 x 10 mm ²⁾ avec un dispositif de coupe mécanique.
2. Effectuer le nettoyage par ultrasons des puces dans de l'acétone, du méthanol et déionisée (DI) de manière séquentielle de l'eau pendant 10 minutes à chaque fois. Utiliser un conteneur résistant aux solvants, composé de substances telles que le verre, pour éliminer la contamination organique.
3. Rincer les puces avec de l'eau DI courante pendant 3-5 sec.
4. Sécher les puces utilisant N ₂ flux de gaz pendant 3-5 sec.

2. Préparation de la culture bactérienne

1. Prenez un P. putida KT2440 (aimablement fourni par le professeur Sung Kuk Lee, UNIST, Corée du Sud) actions stockées dans un -80 ° C congélateur.
2. Décongeler à la température ambiante après 1 min, et la couche supérieure de la solution de stock congelé se transforme en neige fondante. Immergez une boucle dans la couche fondue de la solution de stock.
3. Utilisez cette boucle pour strie les bactéries sur un Luria-Bertani Plaque (LB) contenant 1,5% d'agar.
4. Incuber la plaque pendant une nuit à 30 ° C pour faire croître les colonies bactériennes.
5. Choisissez une seule colonie de la plaque en utilisant une boucle fraîche.
6. Inoculer 10 ml de bouillon LB dans un tube conique de 50 ml avec la boucle contenant la seule colonie bactérienne.
7. Incuber le bouillon dans un incubateur à agitation pendant 16 heures à 30 ° C et 160 rpm.

3. Formation biofilm sur la surface

1. Prenez chacune des puces préparées avec des pincettes et les tremper dans 70% d'éthanol 5 fois pendant 1-2 secondes chacune, pour stériliser la surface de chaque puce. Veiller à ce que les copeaux sont maintenus avec des pincettes pendant le trempage.
2. Tremper chaque puce dans l'eau DI autoclavée et bouillon LB séquentiellement, 5 fois pour 1-2 sec chacun, pour évacuer le reste de l'éthanol.
3. Placez ces puces dans des plaques de culture à 6 puits avec 2 puces et 5 ml de bouillon LB par puits.
4. Diluer la culture bactérienne jusqu'à ce que la concentration dans le bouillon atteint LB8 × 10 ⁸ cellules / ml (densité optique à 600 nm de longueur d' onde: ~ 0,8).
5. Inoculer chaque puits avec 50 ul de la culture bactérienne diluée.
6. Incuber les plaques à 30 ° C sans agitation pendant 24 heures pour la formation de biofilms.

Nettoyage 4. CO ₂ Aérosol

1. Tremper les copeaux de biofilm formé dans un tampon d'acétate d'ammonium 10 mM (volatils) 5 fois pour éliminer vaguement attachés et bactéries planctoniques.
2. Sécher ces puces dans une enceinte de sécurité biologique, où l'air circule légèrement.
3. Immédiatement après le séchage, placer une puce sur le lieu de chargement, qui est de 20 mm de la buse CO ₂ le long de l'axe du jet. Inclinez l'axe du jet à un angle de 40 °.
4. Régler la pression de stagnation du _CO2 et du _N2 gazeux à 5,3 MPa et 0,7 MPa, respectivement, en utilisant des régulateurs de pression des gaz.
5. Appliquer le jet d'aérosol sur la partie centrale de la puce. Aérosols blancs , y compris le CO ₂ solide devraitêtre visible. Tourner "sur" l'électrovanne pour le CO ₂ pendant 5 secondes, puis remettez- le "off" pendant 3 sec (cycle de : 8 sec) en utilisant périodiquement un interrupteur commandé manuellement. Si une purge d'azote doit être utilisé, allumer l'électrovanne pour une alimentation continue de _N2.
6. Traiter les copeaux avec du CO ₂ pour aérosols 16, 40 et 88 secondes , avec ou sans purge d'azote. Maintenir des puces sans traitement comme témoins négatifs.

5. Analyse de l'efficacité de suppression

1. Préparer 1 uM colorant d'acide nucléique fluorescence verte (excitation / émission de longueur d'onde: 480/500 nm) dans l'eau DI pour colorer les cellules bactériennes sur le contrôle et les puces d'aérosol traité.
2. Placer les morceaux dans la solution de coloration.
3. Incuber les puces dans un incubateur sans lumière à 37 ° C pendant 30 min.
4. Après l'incubation, rincer délicatement les morceaux avec de l'eau DI circulant pour éliminer un colorant fluorescent excessive.
5. Sécher les puces wie N ₂ flux de gaz.
6. Prenez fluorescence images microscopiques de 5 champs aléatoires de vue (321 × 240 um ²⁾ pour chaque puce en utilisant un microscope à épifluorescence, un objectif 40X, et une caméra CCD.
7. Obtenir l'intensité de fluorescence pour chaque image en utilisant un logiciel de traitement d'image tel que ImageJ. Dans ImageJ, utilisez la fonction "Background Soustraire" dans le menu "Process", et sélectionnez "densité intégrée" dans la fenêtre "Définir les mesures" dans le menu "Analyser". Faites la "mesure" dans le menu "Analyser" pour obtenir l'intensité de fluorescence.
8. Calculer l'efficacité d'élimination de biofilm selon la formule suivante: 100% × (I jetons de contrôle - I de puces traitées) / (I jetons de contrôle), où I est l'intensité de fluorescence calculée.
9. Obtenir la moyenne des rendements d'élimination et les écarts types. Utilisez aumoins 4 jetons pour chaque cas.

Résultats

CO ₂ aérosols ont été utilisés pour enlever le P. putida biofilms de SUS304 surfaces (figure 1). La plupart des surfaces étaient recouvertes de biofilm après 24 h de croissance. La majeure partie du biofilm a été éliminé en utilisant le CO ₂ aérosols (figure 2). Comme on s'y attendait, la figure 3 montre une augmentation de l'efficacité de l' élimination de biofilm que le CO ₂ temps de traitement d'aérosol accrue...

Discussion

Auparavant, nous avons mené des études d’optimisation de la pression du gaz CO₂ , de l’angle du jet et de la distance à la surface solide dans le nettoyage des aérosols de CO₂ ⁷. Contrairement à nos études précédentes, dans la présente étude, une purge à l’azote n’a pas été incluse dans l’aérosol (Figure 1). De plus, l’acier inoxydable 304 a été utilisé dans ce protocole, car c’est l’un des aciers inoxydables les plus courants et il est largement utilisé dans l’industrie ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
304 acier inoxydable	Steelni (Corée du Sud)		Polissés et coupés en dés
Nettoyeur à ultrasons	Branson (USA)	5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)	Becton, Dickinson and Company (USA)	244620	500 g
Agar	Becton, Dickinson and Company (USA)	214010	500 g
6 puits plaque de culture	SPL Life Sciences (Corée du Sud)	32006
Tampon d’acétate d’ammonium	Sigma-Aldrich (États-Unis)	667404	10 mM
Unité double gaz	Applied Surface Technologies (États-Unis)	K6-10DG	Une buse pour gaz CO2 & 8 buses pour gaz N2
SYTO9	Thermo Fissher Scientific (États-Unis)	Invitrogen	Excitaion : 480 nm Émission : 500 nm
Microscope à épifluorescence  ;	Nikon (Japon)	Objectif Eclipse 80i
40X	Nikon (Japon)	Plan Fluor	NA : Appareil photo CCD 0,75
	Photometrics (États-Unis)	Cool SNAP HQ2	Monochrome