Article de méthode

Un modèle In Vitro pour étudier la Transformation cellulaire par Herpesvirus sarcome de Kaposi

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DOI :

10.3791/54828

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25 août 2017

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1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Dans cet article

Résumé

Le sarcome de Kaposi (KS) est une tumeur induite par l’infection par l’herpèsvirus virus oncogènes de KS-8/herpesvirus humain (HHV-8/KSHV). Le modèle de culture de cellules endothéliales décrit ici est particulièrement bien adapté pour étudier les mécanismes par lesquels KSHV transforme les cellules hôtes.

Résumé

Arcome de Kaposi (SK) est une tumeur rare composée de cellules en prolifération broche qui est déclenchée par l’infection des cellules endothéliales (EC) avec KSHV et développe le plus souvent dans le cadre de l’immunosuppression. Malgré des décennies de recherche, un traitement optimal de KS reste mal défini et les résultats cliniques sont particulièrement défavorables à ressources limitées. Les lésions de KS, résultent de l’angiogénèse pathologique, l’inflammation chronique et oncogenèse et différents des modèles in vitro cell culture ont été développées pour étudier ces processus. KS provient de cellules infectées par KSHV d’origine endothéliale, pour fournissent à des cellules de lignée EC les plus appropriée en vitro substituts du précurseur cellules fusiformes. Cependant, parce que les EC ont une durée de vie limitée in vitro , et comme les oncogènes mécanismes employés par KSHV sont moins efficaces que ceux des autres virus tumorigènes, il a été difficile d’évaluer les processus de transformation dans le primaire ou télomérase-immortalisé EC. Par conséquent, un modèle de nouvelle culture axée sur l’EC a été développé qui supporte facilement transformation suite à une infection avec KSHV. L’expression ectopique des gènes E6 et E7 du virus du papillome humain type 16 permet la culture prolongée d’appariés selon l’âge et le passage mock et KSHV-infectés par EC et soutient le développement d’une véritable transformation (c.-à-d. tumorigènes) phénotype dans des cultures cellulaires infectées . Ce modèle souple et hautement reproductible de KS a facilité la découverte de plusieurs voies de signalisation essentielles à fort potentiel pour la traduction en milieu clinique.

Introduction

Le sarcome de Kaposi (KS) est une tumeur angioproliférative multi-focal affectant les sites par voie cutanée, muqueuses et viscérales qui se développe le plus souvent dans le cadre d’immunodépression avancé1. Quatre formes épidémiologiques ont été décrites : classique, une forme indolente qui touche généralement les personnes âgées du patrimoine méditerranéen et du Moyen-Orient ; iatrogène, résultant du traitement avec des médicaments immunosuppresseurs après transplantation d’organes ; épidémie, un cancer définissant le sida ; et endémiques, une forme indépendante du VIH fréquente chez les enfants dans les régions endémiques en Afrique. Avec l’avènement de régimes de médicaments anti-rétroviraux combinaison efficace pour le traitement du VIH, épidémie KS est beaucoup moins souvent diagnostiquée chez les pays en développement. Cependant, les formes endémiques et épidémiques cliniquement agressifs demeurent parmi les plus couramment des cancers diagnostiqués dans plusieurs pays d’Afrique,2,3,4. Identification des médicaments efficaces axés sur la pathogenèse, pour le traitement de KS est donc une priorité de recherche.

Histologiquement, les lésions de KS sont caractérisées par la néovascularisation vaste mais anormale par lequel des cellules de tige d’origine ce formulaire réseaux vasculaire discontinue5. Ces vaisseaux anormaux (« fentes vasculaires ») permettre l’extravasation des érythrocytes, qui donnent des lésions leur couleur caractéristique. En outre, les lésions contiennent nombreux leucocytes qui caractérisent l’inflammation chronique (c'est-à-dire, lymphocytes, macrophages et plasmocytes). Régression des lésions de KS après la reconstitution immunitaire a été décrit, ce qui suggère que KS a des fonctions d’une lésion hyper-proliférative et une véritable tumeur6,7,8,9.

L’herpèsvirus KS (KSHV), l’agent causal de KS, a été identifié en 1994,10. Depuis puis nombreux in vitro culture cellulaire modèles ont été développés pour permettre des études de pathogenèse, y compris les cellules explantées de matériel de biopsie tumorale et primaire ou EC exprimant le télomérase infectés par KSHV dans vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. aucun des modèles actuellement disponibles entièrement récapitule le microenvironnement tumoral de KS, mais tous ont contribué des connaissances précieuses à notre compréhension de la pathologie de l’infection de KSHV. À la différence des autres connus tumorigènes herpèsvirus humain virus Epstein - Barr (EBV), KSHV ne transforme pas facilement les cellules en culture après nouvelle infection19,20,21, 22. Toutefois, cette limitation a été surmontée par transduction primaire EC humaine soit mélangé origine microvasculaire ou lymphatique le E6 et E7 des gènes du virus du papillome humain de type 16 avant l’infection de KSHV23,24 . Expression des ces oncogènes exogènes augmente considérablement le potentiel de transformation de KSHV in vitro en partie en fournissant d’autres inhibition du rétinoblastome protéine et p5323,24. Cette méthode de transduction EC a permis à plusieurs laboratoires pour identifier les altérations clées hôte l’expression génique cellulaire qui sont induits par l’infection de KSHV et qui semblent faciliter KS cellule survie et la prolifération25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. les protocoles décrits sont simples et très reproductible et se traduira par la génération d’appariés selon l’âge et le passage des EC KSHV-infectés et infectés par le simulacre des contrôles qui peuvent être cultivées pendant beaucoup plus de cellules primaires et seront permettent l’étude des oncogènes mécanismes employés par KSHV. Bien que le protocole inclut une méthode pour la production de type sauvage KSHV de la lignée effusion primaire de cellules lymphocytaires BCBL-1, EC E6/E7-immortalisé sont également très sensibles au Infectionà BACmid recombinante dérivées KSHV-BAC1630. Protocoles pour la préparation de BAC16 sont décrites ailleurs33,34.

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Protocole

Remarque : toutes les procédures décrites dans le présent protocole doivent être effectuées dans des conditions de BSL-2.

1. KSHV Stock préparation

tampon préparer TNE
  1.  : dissoudre 292,24 mg EDTA dans ddH 2 O, porter à 225 mL et ajuster le pH 8. Dissoudre 605,7 mg Tris dans FD 2 O, porter à 225 mL et ajuster le pH 8. Combiner les solutions EDTA et Tris, ajouter 4,38 g NaCl, ajuster le volume final à 500 mL, filtre, stériliser et conserver à 4 ° C .
  2. Culture le KSHV-positif, de la lignée de cellules de lymphome du primaire épanchement EBV-négatif BCBL-1 dans un incubateur à 37 ° C plus de 5 % de CO 2 dans RPMI additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) et antimicrobiens à environ 1 à humidifié à 1,2 x 10 6 cellules / mL.
  3. Pour induire la production de KSHV, diviser les cultures 1 / 2 avec un milieu frais et ajouter Phorbol 12-Myristate 13-acétate (PMA) à une concentration finale de 20 ng/mL et incuber les cultures pendant 5 jours. Comme alternative, traiter les cellules avec le butyrate de sodium (NaB ; 0,1 mM) pendant 3 jours pour induire la réplication virale lytique.
  4. Pour récolter les particules virales, tout d’abord Centrifuger le surnageant à 300 x g pendant 5 min à température ambiante pour les cellules de granule et transfert de surnageants à tubes frais de culture.
  5. D’expliciter le surnageant afin d’éviter le transfert des débris cellulaires, centrifuger à 2 500 g pendant 10 min à 4 ° C.
    Remarque : comme alternative à une centrifugation haute vitesse pour clarification des surnageants, filtration à travers un stérile 0,45 µm filtre peut être effectuée. Nous avons observé une baisse significative dans le titre à l’aide de filtration ; par conséquent, nous effectuons régulièrement la deuxième étape de centrifugation à la place.
  6. Ensuite superposer 5 mL de solution de saccharose de 25 % dans un tampon TNE avec environ 30 mL de la culture clarifiée surnageante dans 6 tubes ultracentrifugeuse.
  7. Centrifugeuse équilibré tubes à 75 000 x g pendant 2 h à 4 ° C sous vide.
  8. Décanter le surnageant de culture et la jante de chaque tube pour enlever autant surnageant et saccharose solution possible de la tache, puis Resuspendre le culot de virus, ce qui n’est peut-être pas visible, dans 150 µL de tampon de TNE.
  9. Virus de piscine toutes remises en suspension, bien mélanger et congeler à -80 ° C . 25 µL d’extraits

2. Transduction de ce avec E6 et E7 Papillomavirus gènes

Remarque : nous utilisons systématiquement flacons de culture de tissus standard pour la culture primaire EC. Toutefois, si la croissance insatisfaisante d’EC est obtenue alors l’utilisation de flacons de culture commerciale devrait considérer.

  1. Culture primaire humain cutanée microvasculaire ou lymphatique EC dans un incubateur humidifié à 37 ° C plus de 5 % de CO 2 dans le milieu EC (EGM ; contient le milieu basal EC [EBM] additionné de EGM-2 BulletKit [contenant des BF, hydrocortisone, facteur de croissance de fibroblaste humain-B, facteur de croissance vasculaire ce, facteur de croissance 1 analogue à l’insuline, acide ascorbique, facteur de croissance épithélial humain, antibiotiques et héparine]) dans un flacon de culture cellulaire T75 à environ 50 % confluent.
  2. Pour la transduction, la culture PA317 LXSN 16E6E7 cellules 24 ,, 35, dans un incubateur humidifié à 37 ° C plus de 5 % de CO 2 en DMEM additionné de 10 % FBS et antimicrobiens dans un Flacon de culture cellulaire T150 jusqu'à ce qu’ils sont environ 90 % anastomosé. Puis incuber pendant la nuit dans 16 mL de milieu.
  3. Préciser le moyen de PA317 par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
  4. Supprimer la réunion d’experts provenant des cellules de culture et de la superposition des EC avec 12 mL de milieu PA317 clarifié et incuber pendant 4 h.
    NOTE : Centrifugation 16 mL de milieu conditionné à 300 g pendant 5 min résultats dans un granulé compact qui n’a pas été dérangé par le prudent retrait subséquent de 12 mL du surnageant clarifié. Toutefois, si le transfert des cellules de 16E6E7 de PA317 LXSN à des cultures primaires d’EC est une préoccupation (la lignée cellulaire de conditionnement sera rapidement dépasser EC), puis filtration du liquide surnageant conditionné à travers un filtre de 0,45 µm avant le transfert est possible.
  5. Remplacer les 6 mL de milieu PA317 par EGM fraîche et incuber pendant la nuit.
  6. Ce refeed avec 12 mL EGM fraîche et incuber une autre 48 h.
  7. À la pour sous culture de la Communauté européenne, éliminer le milieu et laver avec 12 mL de PBS sans les cations et ajouter 3 mL de solution commerciale dissociation enzymatique (p. ex., TrypLE) par et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
  8. Transfert de suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Resuspendre le culot de cellules qui en résulte dans frais EGM et répartir uniformément en 3 flacons de x T75 avec un volume final de 12 mL EGM par fiole.
  9. Pour sélectionner pour EC transduite avec E6 et E7, ajouter G418 à une concentration finale de 200 µg/mL pour les deux passages, après quoi le ce transduite peut être plaqué pour une infection ou congelé dans l’azote liquide.

3. Infection de ce transduites avec KSHV

  1. le jour avant l’infection récolter EC par digestion enzymatique à l’aide de la solution commerciale de dissociation enzymatique comme décrit ci-dessus. Resuspendre le culot dans 1 mL de EGM. 5 µL de cellules permet de préparer une dilution au 1/10 dans le bleu Trypan. Compter les cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre et 2,5 x 10 5 cellules vivantes dans 2 mL d’EGM / puits dans 6 assiettes bien des graines.
  2. Le jour de l’infection, supprimer EGM et laver les cellules avec 3 mL de PBS avec le calcium et le magnésium par puits et puis ajouter 2 mL EBM.
    Remarque : Il est indispensable d’utiliser des EBM plutôt que EGM lors de l’infection, car l’héparine en EGM inhibent la fixation des particules virales et une infection ultérieure de cible EC.
  3. D’infecter des cellules avec KSHV, ajoutez le bouillon de virus de 5 à 20 µL à chaque puits et tournoyer plaque pour mélanger. Cellules infectées par le mock, ajouter un volume équivalent de tampon TNE dans chaque cupule.
  4. Centrifuger les plaques à 400 g pendant 30 min à température ambiante et puis incuber les plaques à 37 ° C pendant 90 min.
  5. Si l’objectif de l’étude consiste à enquêter sur les événements nécessitant une synchrone infection virale, par exemple, des événements précoces dans l’infection de novo, retirez l’inoculum viral à ce stade. Rincez et refeed les cellules avec 2 mL EGM fraîche. Dans le cas contraire, ajouter 2 mL EGM et incuber les cultures du jour au lendemain.
  6. Refeed cellules avec 2 mL EGM le jour après l’infection et puis tous les autres jours.
  7. Lorsque les cellules sont environ 90 % anastomosé, récolter par digestion enzymatique à l’aide de la solution commerciale de dissociation enzymatique comme décrit ci-dessus, puis les cellules de trois puits dans un T75, notant le nombre total de passage et le passage de la piscine après l’infection.
  8. Développez mock - et KSHV-infectés par EC 1:3 divisions au moins deux passages plus, date à laquelle les cellules peuvent être utilisés dans des expériences ou congelés dans l’azote liquide.
    Remarque : Comme pour la séparation des EC transduite avec E6 et E7, cultures de maintenance de mock et KSHV-cellules infectées par doivent être fractionnées avant d’atteindre le confluent (~ 85 à 90 %).

4. confirmant Infectionà KSHV par Immunofluorescence

Remarque : détection de l’antigène nucléaire de KSHV associé à latence (LANA-1/ORF73) fournit une mesure quantitative fiable de l’infection. Anticorps anti-LANA sont commercialement disponibles.

  1. Le jour avant la coloration, plaque deux puits chacun avec mock ou KSHV-infectés par EC sur une plaque de 24 puits à 1 x 10 5 cellules par bien dans 1 mL EGM et incuber jusqu’au lendemain.
  2. Cellules de laver deux fois avec 500 µL de PBS plus de calcium et de magniseum. Laver pendant 30 s sur une plate-forme bascule.
  3. Dans une hotte de laboratoire externe-ventillated, fixer les cellules avec 500 µL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min à température ambiante.
  4. Laver les cellules trois fois avec 500 µL de tampon de lavage (0,1 % X-100 Triton plus 0,02 % de sérum de chèvre dans PBS plus cations).
  5. Bloc de cellules avec 500 µL de sérum de chèvre de 2 % dans un tampon de lavage pendant 30 min à température ambiante.
  6. Laver les cellules trois fois avec 500 µL de tampon de lavage.
  7. Label un puits de simulacre ou KSHV-infectés par EC avec 200 µL d’anticorps primaire dilué 01:100 dans le tampon de lavage pendant 30 min à température ambiante sur une bascule. Incuber les deux autres cupules dans 200 µL de tampon de lavage seulement.
  8. Laver les cellules trois fois avec 500 µL de tampon de lavage.
  9. Étiqueter tous les quatre puits avec 200 µL d’anticorps secondaire dilué au 1/100 dans le tampon de lavage pendant 30 min à température ambiante sur une bascule.
  10. Laver les cellules trois fois avec 500 µL de tampon de lavage.
  11. Dans chaque cupule appliquer 20 µL de montage moyen contenant DAPI et un lamelle couvre-objet et d’évaluer la coloration à l’aide d’un microscope inversé à fluorescent.
  12. Déterminer le pourcentage d’infection des cellules infectées par KSHV en comptant le nombre de noyaux positifs LANA au moins 200 cellules. Infectionà recombinant KSHV-Bac16 peut être également surveillées par observation des cultures pour l’expression de GFP.

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Résultats

La morphologie des EC primaire est classiquement décrit comme « Pierre de galets », et cette morphologie n’est pas modifiée par l’expression du virus du papillome E6 et E7 gènes (Figure 1 a). L’expression des gènes E6 et E7 seuls n’induit pas un phénotype transformé ; ainsi, les cellules sont sensibles à l’inhibition de contact et cesseront divisant en arrivant à confluence dans la culture. Les cellules seront toutefois prolifèrent et les repoussent jusqu'à confluence try...

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Discussion

Oncogenèse est un processus multipas qui contourne les mesures de sécurité importantes au sein d’un organisme36. Comme les lésions de KS existent le long d’un spectre d’inflammation chronique au vrais sarcomes, élucidation de certains processus physiopathologiques médiée par KSHV exige que certaines études conduits dans des modèles de culture cellulaire qui prennent en charge la transformation9. Il est à noter que la perte d’inhibition de contact et de croissance dépendant ...

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Remerciements

Ce travail a été soutenu par le HD068322 K12 (SCM) ; R01 CA179921 et P51 OD011092 (AVM) ; et 14PRE20320014 les prix de l’Association coeur Amérique (SB).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules BCBL-1Programme de réactifs NIH SIDA3233
Cellules PA317ATCCCRL-2203
Cellules endothéliales microvasculaires dermiques néonatalesLonzaCC-2505
EBM-2 Milieu basalLonzaCC-3156
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73Avancé Biotechnologies13-210-100
TrypLETMExpress, sans rouge de phénolThermoFisher12604013
RPMI
DMEM
PBS avec calcium et magnésium

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Infection par le KSHVcellules endoth lialesoncogen se viraletransformation cellulaireexpression d E6 E7purification de particules viralesessai au g lose moller sistance l ano kismorphologie en cellules fusiformes

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