Développement d'un système de virus de l'hépatite B Reporter pour surveiller les premiers stades du cycle de réplication

Résumé

Nous décrivons ici un virus nouvellement mis au point contre l'hépatite B (VHB) système rapporteur pour surveiller les premiers stades du cycle de vie du VHB. Cette simplifiée système in vitro aidera dans le criblage d'agents anti-VHB en utilisant une stratégie à haut débit.

Résumé

Actuellement, il est possible de construire des formes recombinantes de divers virus, tels que le virus de l’immunodéficience humaine 1 (VIH-1) et le virus de l’hépatite C (VHC), qui portent des gènes étrangers tels qu’une protéine rapporteure ou marqueur dans leur génome. Ces virus recombinants imitent généralement fidèlement le cycle de vie du virus d’origine dans les cellules infectées et présentent la même dépendance à la gamme d’hôtes. Le développement d’un virus recombinant permet un criblage efficace d’inhibiteurs et l’identification de facteurs spécifiques de l’hôte. Cependant, jusqu’à présent, la construction du virus recombinant de l’hépatite B (VHB) a été difficile en raison de diverses limites expérimentales. La principale limitation est la taille compacte du génome du VHB, et une taille de génome assez stricte qui ne dépasse pas 1,3 taille de génome, qui doit être emballé dans des virions. Ainsi, la taille d’un gène étranger à insérer doit être inférieure à 0,4 kb si aucune délétion de l’ADN du génome ne doit être effectuée. Par conséquent, pour surmonter cette limitation de taille, la délétion d’une partie de l’ADN du VHB est nécessaire. Ici, nous rapportons la construction d’un VHB recombinant codant pour un gène rapporteur afin de surveiller le stade précoce du cycle de réplication du VHB en remplaçant une partie de la région codante du noyau du VHB par le gène rapporteur en supprimant une partie de la région codante du VHB pol. La détection de l’infection recombinante par le VHB, surveillée par l’activité du rapporteur, était très sensible et moins coûteuse que la détection à l’aide des méthodes conventionnelles actuellement disponibles pour évaluer l’infection par le VHB. Ce système sera utile pour un certain nombre d’applications, y compris le criblage à haut débit pour l’identification des inhibiteurs anti-VHB, des facteurs de l’hôte et des cellules sensibles au virus.

Introduction

L' infection chronique par le virus de l' hépatite B (VHB) est un facteur de risque majeur pour les maladies chroniques du foie ^1. Bien que des stratégies thérapeutiques actuelles sont basées sur des analogues de nucléotides qui inhibent la fonction du VHB pol et / ou l'administration d'interféron de type I qui activent les réponses immunitaires chez les individus infectés, ainsi que la suppression indirectement la prolifération du VHB par les fonctions des gènes d' interféron stimulées ^2, ces traitements ne peuvent pas éliminer le VHB ADN complètement ^3. En outre, l'émerg....

Protocole

1. Production recombinante de HBV codant pour la protéine reporter

1. Préparation des cellules HepG2
   1. Préparer un milieu de culture cellulaire (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 100 U / ml d'acides aminés non essentiels).
   2. Plaques 4 x 10 ⁶ cellules HepG2 dans un plat revêtu de collagène de 10 cm dans 10 ml de milieu de culture le jour avant la transfection. Incuber les cellules HepG2 à 37 ° C dans un humidifiée de 5% de CO ₂ incubateur.
      REMARQUE: Lorsque environ 4 x 10 ⁶

Résultats

La figure 1 montre une représentation schématique du génome du VHB, des ARN transcrits, protéines de virus et de leur région codante du génome. Le gène rapporteur et son emplacement dans le génome sont également indiqués. La figure 2 montre le plasmide rapporteur et un plasmide auxiliaire VHB contenant le gène rapporteur. Le pUC1.2HBV / NL reporteur a été construit en supprimant des positions de nucléotides 223-811 à partir du site d'initiation de tr.......

Discussion

Le génome du VHB a quatre trames primaires de lecture ouverts (ORF) , y compris le noyau, la polymerase, de surface et X ORFs (Figure 1). La transcription de ces ORFs quatre HBV est étroitement régulée par quatre promoteurs: le promoteur précore / noyau contenant activateur II, promoteur S1, S2 promoteur et X promoteur contenant activateur I ^18. Les 3,5 kb et 3,4 kb ARNm sont traduits en protéines Precore et Core, respectivement. La grande protéine d'enveloppe (L) est produit.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Pénicilline-Streptomycine Solution Mixte	Nacalai tesque	09367-34  ;
MEM Acides aminés non essentiels Solution	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I Sérum réduit Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/plat enrobé de collagène	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 Réactif de transfection	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polyéthylène glycol (PEG) 6000  ;	Sigma-Aldrich	81255
Polyéthylène glycol (PEG) 8000²	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45  ;
0,5 mol/L EDTA Solution	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0,45 &mu ; m, polyéthethersulfone, filtre	Merck Millipore	SLHP033RS
Diméthyl sulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Plaque 96 puits revêtue de collagène	Corning	NO3585
Lyse passive 5x Tampon	Promega	E1941
GloMax 96 Luminomètre sur microplaque	Promega	E6501
Saccharose	Nacalai tesque	30403-55
Plaque luminomètre	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Référence 15
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Référence 15
pUC1.2HBV/NL-		-	Référence 15
tube de 50 ml	Violamo	1-3500-02
Anti-Myc anticorps	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	Japan Blood Products	Organization-IFN
-&beta ;	Mochida Pharmaceutical	14987224005413
Héparine	Sigma-Aldrich	H3393