Article de méthode

3D quantitative In Silico Modélisation (q3DISM) de Cerebral bêta-amyloïde phagocytose dans les modèles rongeurs de la maladie d'Alzheimer

DOI :

10.3791/54868

⸱

26 décembre 2016

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons développé une méthodologie pour la 3D quantitative dans la modélisation de silico (q3DISM) de amyloïde cérébrale-β (Aß) phagocytose par les phagocytes mononucléaires dans des modèles de rongeurs de la maladie d'Alzheimer. Cette méthode peut être généralisée pour la quantification de pratiquement tous les cas de phagocytose in vivo.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroinflammation est maintenant reconnu comme un facteur étiologique majeur dans les maladies neurodégénératives. Les phagocytes mononucléaires sont des cellules immunitaires innées responsables de la phagocytose et l'élimination des débris et de détritus. Ces cellules comprennent les macrophages CNS-résidents appelés microglie et phagocytes mononucléaires infiltrant de la périphérie. La microscopie optique a généralement été utilisé pour visualiser la phagocytose des rongeurs ou des échantillons de cerveau humain. Cependant, les méthodes qualitatives ont pas fourni la preuve définitive de la phagocytose in vivo. Ici, nous décrivons 3D quantitative dans la modélisation de silico (de q3DISM), une méthode robuste permettant la vraie quantification 3D de l' amyloïde-β (Aß) phagocytose par les phagocytes mononucléaires dans rongeurs maladie d'Alzheimer (AD) modèles. Le procédé consiste à visualiser fluorescence Aß encapsulé dans phagolysosomes dans les sections rongeur du cerveau. Les grands ensembles de données confocale z-dimensionnelle sont ensuite reconstruits 3D pour la quantification de A &# 946; colocalisés dans l'espace à l'intérieur du phagolysosome. Nous démontrons l'application réussie de q3DISM à la souris et le rat des cerveaux, mais cette méthode peut être étendue à pratiquement tous les cas phagocytaire dans les tissus.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maladie d'Alzheimer (AD), la démence liée à l'âge le plus courant 1, est caractérisée par amyloïde cérébrale-β (Aß) accumulation sous forme de plaques "séniles" ß-amyloïde, chronique neuroinflammation de bas niveau, tauopathie, perte neuronale, et la perturbation cognitive 2 . Dans AD cerveaux de patients, neuroinflammation est affecté par les astrocytes et les phagocytes mononucléaires réactif (appelé microglie, bien que leurs centrales vs. origine périphérique reste incertaine) entourant les dépôts Aß 3. Comme les sentinelles immunitaires innées du SNC, les microglies sont positionnés centralement pour effacer le cerveau Aß. Cependant, le recrutement microglie aux plaques de Aß est accompagnée de très peu, le cas échéant, la phagocytose de Aß 4,5. Une hypothèse est que les microglies sont initialement neuroprotecteur par phagocytozing petits ensembles de Aß. Cependant, par la suite ces cellules deviennent neurotoxiques comme fardeau écrasant Aß et / ou d fonctionnelle liée à l'âgeECLINE, provoque la microglie dans un phénotype proinflammatoire dysfonctionnel, ce qui contribue à la neurotoxicité et déclin cognitif 6.

Association récentes Études de génome entier (GWAS) ont identifié un groupe d'allèles à risque AD appartenant aux principaux voies immunitaires innées 7 qui modulent la phagocytose 8-11. Par conséquent, la réponse immunitaire à un dépôt amyloïde cérébrale est devenue un domaine d'intérêt majeur, tant en termes de compréhension AD étiologie et pour développer de nouvelles approches thérapeutiques 12-14. Pourtant, il y a un besoin vital de méthodologie pour évaluer la phagocytose Aß in vivo. Pour répondre à ce besoin non satisfait, nous avons développé 3D quantitative dans la modélisation de silico (q3DISM) pour permettre vrai quantification 3D de phagocytose Aß cérébrale par les phagocytes mononucléaires dans des modèles de rongeurs de la maladie d' Alzheimer-like.

Limitée seulement par la mesure dans laquelle elles récapituler les maladies, les modèles animaux ontprouvé une valeur inestimable pour la compréhension de AD pathoetiology et pour évaluer les traitements expérimentaux. Compte tenu du fait que des mutations dans les présénilines (PS) et Amyloid Precursor Protein (APP), des gènes provoquent indépendamment AD autosomique dominante, ces transgènes mutants ont été largement utilisées pour produire des modèles de rongeurs transgéniques. Les souris transgéniques APP / PS1 coexpression simultanément "suédois" APP humaine mutante (APP SWE) et Δ exon 9 mutant de la préséniline 1 humaine (PS1ΔE9) présente avec l' amylose cérébrale accélérée et neuroinflammation 15,16. En outre, nous avons généré des rats bi-transgéniques APP avec co - injectés swe et constructions PS1ΔE9 (ligne TgF344-AD, sur un fond Fischer 344). Contrairement aux modèles de souris transgéniques de l' amylose cérébrale, rats TgF344-AD développent amyloïde cérébrale qui précède tauopathie, perte apoptotique des neurones, et les troubles du comportement 17.

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour immunostaining microglie, phagolysosomes et dépôts de Aß dans des coupes de cerveau de souris APP / PS1 et rats TgF344-AD, et l'acquisition de grandes images confocale z-dimensionnelle. Nous détaillons dans la production et l' analyse des véritables reconstructions 3D à partir des ensembles de données confocale permettant la quantification de Aß absorption dans phagolysosomes microgliales silico. Plus largement, la méthodologie que nous détaillons ici peut être utilisé pour quantifier pratiquement toute forme de phagocytose in vivo.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Déclaration d'éthique de la recherche: Toutes les expériences impliquant des animaux détaillés ici ont été approuvés par l'Université de Californie du Sud Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) et réalisée en stricte conformité avec les instituts nationaux de lignes directrices de santé et des recommandations de l'Association pour l' évaluation et l' accréditation des laboratoires animal Care international.

1. Rongeur Isolement du cerveau et préparation pour immunocoloration

JOUR 1:

  1. Placez rats TgF344-AD âgés (14-month-old) ou APP / PS1 souris (12-month-old) sous anesthésie isoflurane profonde continue (4%). Évaluer la profondeur de l'anesthésie par pincement de l'orteil et l'absence de réflexe de retrait.
  2. Couper à travers les deux côtés de la cage thoracique et soulever pour exposer le cœur. Insérez une aiguille 23 G dans le ventricule gauche du cœur et de faire une petite incision dans l'oreillette droite. Passez à l'exsanguination par perfusion transcardial avec un tampon phosphate salin glacé(PBS) en utilisant une pompe péristaltique (30 ml pour les souris; 150-200 ml pour les rats).
  3. Faire une incision médiane caudale dans la peau et déplacer la peau et le muscle de côté. Couper à travers le sommet du crâne, le long de la ligne médiane et entre les yeux. Retirez les plaques osseuses et d'isoler l'ensemble du cerveau du crâne.
  4. Placez le cerveau dans une matrice rongeur du cerveau coronal et couper en quartiers. Incuber quarts postérieurs O / N (16 h) dans paraformaldehyde fixateur (4% PFA dans du PBS) à 4 ° C. Laver 3x dans du PBS, puis transfert à l'éthanol à 70%. Attention: PFA est toxique et doit être manipulé sous une hotte chimique avec des équipements de protection individuelle approprié.

JOUR 2:

  1. Placer quarts du cerveau dans des cassettes d'enrobage et déshydrater progressivement dans les tissus successivement plus concentrées, 1 h bains d'éthanol (70%, 80%, 95% et 100% x 3).
  2. Effacer l'éthanol à partir du tissu avec trois successifs bains de xylène 100% (1 h chacun). Attention: Xylène est toxique et should être traitées sous une hotte chimique avec des équipements de protection individuelle approprié.
  3. Incluez tissu dans des blocs de paraffine après deux bains fondus de cire de paraffine (56-58 ° C, 90 min chacun).

JOUR 3:

  1. Couper 10 sections um d'épaisseur de cerveaux de paraffine en utilisant un microtome. sections Tremper dans un bain d'eau (50 ° C pendant 1 min) et d'appliquer des lames de microscope. Laissez les diapositives sécher O / N, assurant l'adhérence des tissus à la diapositive.

2. immunocoloration

Remarque: Les différentes combinaisons d'anticorps peuvent être utilisés pour la procédure de coloration décrit ci-dessous. Un cocktail d' anticorps compatibles avec les tissus cérébraux provenant de rats et de souris sont indiquées dans le tableau 1.

JOUR 4:

  1. sections Déparaffiner du cerveau en utilisant 2x 100% bains de xylène (12 min chacun).
  2. Réhydrater les coupes de cerveau dans des bains successifs d'éthanol - 100% pendant 10 minutes, 95% pendant 5 minutes, 80% pendant 10 min, et enfin 70% pendant 15 min - followed par des lavages 3x PBS [5 min à température ambiante, avec une légère agitation]. Pendant ce temps, la solution de récupération d'antigène de chaleur à 95-97 ° C sur une plaque chauffante avec barreau magnétique d'agitation.
  3. Incuber des coupes de cerveau dans une solution de récupération d'antigène à 95-97 ° C pendant 30 min. Ensuite, lavez 3x dans du PBS (5 min à température ambiante, avec une légère agitation).
  4. Rapidement diapositives sèches à l'aide des essuie-tâche délicate pour éviter le séchage des tissus, et d'en tirer une barrière hydrophobe autour de la zone de tissu avec un stylo à barrière hydrophobe. Remplir la région de tissu entouré d'un tampon de blocage [PBS contenant 0,3% de Triton X-100 et 10% de sérum d'âne normal (PDN)] et incuber à température ambiante pendant 1 heure dans une chambre humidifiée.
  5. Remplacer le tampon de blocage avec l'anticorps primaire Iba1 (dilué dans du tampon de blocage) pour marquer phagocytes mononucléés, et laisser incuber O / N à 4 ° C dans une chambre humidifiée. Pour les hôtes d'anticorps et des dilutions de travail, voir le tableau 1 et la Table des matières.

JOUR 5:

  1. Rinceranticorps primaire avec des bains 3x PBS (5 min à température ambiante avec une légère agitation). Incuber avec l'anticorps fluorescent secondaire (conjugué à un fluorophore émission 594 nm) pendant 1 h (dans un tampon de blocage à température ambiante dans l'obscurité), suivie par des bains 3x PBS (5 min à température ambiante avec une légère agitation). A ce moment, de maintenir des sections dans l'obscurité pour éviter fluorescent signal de blanchiment.

JOUR 6 - 7:

  1. Répéter les étapes 2.5 et 2.6 avec CD68 (cerveaux de rats) ou LAMPE1 (tissu de souris) et des anticorps secondaires appropriés (couplé à un fluorophore émission 488 nm) pour étiqueter les phagolysosomes.

Jour 7 - 8:

  1. Répéter les étapes 2.5 et 2.6 avec OC (tissu de rat) ou 4G8 (Les cerveaux de souris) et des anticorps secondaires appropriés (couplé à un fluorophore 647 nm) pour marquer des dépôts de Aß.
    NOTE: En variante, l'anticorps 6E10 peut être utilisé avec succès à la fois sur les tissus de la souris et le rat. Pour les combinaisons appropriées d' anticorps, voir la Table des Matières .
  2. Autoriser les sections à complètement O sec / N à la température ambiante dans l'obscurité. Ensuite, la couverture des spécimens avec une lamelle scellée par un milieu de montage de fluorescence contenant DAPI.

3. Acquisition de Grande Z-stack confocale datasets

Remarque: Ce protocole nécessite un microscope à balayage laser confocal entièrement automatique équipée d'un objectif 60X et 405 nm, 488 nm, 594 nm et 647 nm lasers. Tout le matériel est contrôlé par imagerie et contrôle laser de logiciels. Avant de commencer le protocole d'imagerie, la puissance sur l'ordinateur, lampe épifluorescence, microscope, les lasers et la caméra.

JOUR 9:

  1. Sélectionnez l'objectif du microscope 60X. Ajouter l'huile d'immersion à la lentille, et placer l'échantillon sur le porte-lame de platine du microscope. Soulever l'objectif jusqu'à ce que l'huile est en contact avec la lame. Ajuster le plan focal pour localiser les plaques d'amyloïde dans l'hippocampe ou du cortex cérébral en utilisant un éclairage à épifluorescence à travers les oculaires.
  2. Acquérir im confocalâges des phagocytes mononucléaires activées autour de dépôts d'amyloïde dans l'hippocampe ou du cortex de rongeurs par microscopie confocale (grossissement 60X, les étapes z pile: 0,25 um

4. q3DISM

Remarque: Afin d'obtenir des résultats significatifs, nous vous suggérons de l'analyse d'un minimum de 3 images par animal / région d'intérêt. Pour chaque image, l'abondance des cellules à analyser peut varier en fonction des paradigmes expérimentaux. Dans les résultats représentatifs indiqués dans le présent rapport, nous avons analysé 3 cellules / état (par exemple, les phagocytes mononucléaires éloignés ou associés à des plaques; voir les figures 1C - D et 2C - D).

JOUR 10:

  1. Analyser les ensembles de données confocale avec colocalisation traitement de l'image 3D et analyses scientifiques logiciels (coloc) module pour la proximité spatiale des Iba1 / CD68 (de tissu de rat) ou Iba1 / LAMP1 (tissu de la souris) coloration dans tous les z-plans simultanément.Créer Iba + / CD68 + ou + Iba / LAMPE1 + colocalisation canaux qui correspondent à phagolysosomes dans les phagocytes mononucléaires activées.
    1. Sélectionnez TRITC pour le canal A (correspondant à Iba1 coloration couplée à 594 nm fluorophore) et FITC pour le canal B (correspondant à CD68 ou LAMP1 coloration couplée à 488 nm fluorophore). Sur le côté droit de la fenêtre du logiciel pour 'vérification de mode,' 'seuil ", sélectionnez et pour' intensités de Coloc", sélectionnez "canaux de source».
    2. Cliquez sur "Modifier" pour sélectionner "la couleur de coloc 'sur le côté droit de la fenêtre du logiciel.
    3. Pour chaque canal indépendamment, ajuster les seuils d'inclure une coloration spécifique et d'exclure / signaux non spécifiques fond. Une fois ajusté, ne modifiez pas les seuils entre les images pour assurer une analyse impartiale. Les voxels colocalisés (pixels de tous les z-piles) apparaîtront dans la couleur sélectionnée dans l'étape 4.1.2 dans tous les z-piles SIMultaneously.
    4. Cliquez sur "construire le canal coloc '. Le canal de colocalisation créé apparaîtra dans la fenêtre de réglage de l'affichage.
    5. Cliquez sur le canal coloc pour ouvrir les statistiques de canal. Le «% du volume / matériau A au dessus du seuil colocalisés 'représente le% de signaux (Iba1 voxels correspondant au fluorophore 594 nm) colocalisés avec LAMPE1 ou un signal de CD68 (voxels correspondant à la fluorophore 488 nm). Plus simplement, cela est le volume de monocytes occupé par phagolysosomes (voir les figures 1C et 2C).
      NOTE: '% du volume / matériau B-dessus du seuil colocalisés' correspond à% du signal de LAMP1 ou CD68 colocalisés avec Iba1. Cela devrait être proche de 100%, comme phagolysosomes sont des structures intracellulaires. Les valeurs sont basées sur le ratio des signaux de tous les z-dessus du seuil des piles colocalisés.
  2. En utilisant le module de coloc, analyser le canal coloc créé à l'étape 4.1 pour la proximité spatiale avec OC (ti ratssu) ou 4G8 (tissu de souris) signaux Aß. Ceci permet une quantification de Aß encapsulé dans phagolysosomes.
    1. Sélectionnez le canal Un ensemble de données de coloc (correspondant à la Iba1 / CD68 ou d'un canal Iba1 / LAMPE1 de coloc créé à l'étape 4.1) et Cy5 pour le canal B (correspondant à OC ou 4G8 coloration couplée à 647 nm fluorophore).
    2. Construire un canal de coloc comme décrit dans les étapes 4.1.2 à 4.1.5.
    3. Cliquez sur le canal coloc pour ouvrir les statistiques de canal. Le «% du volume / matériau A au dessus du seuil colocalisés 'représente le% de Iba1 / ou LAMPE1 Iba1 / CD68 (voxels correspondant à la chaîne construite à l'étape coloc 4.1.5.) Colocalisés avec OC 4G8 ou d'un signal (voxels correspondant à la 647 nm fluorophore). Ceci est le volume occupé par phagolysosomique Aß (voir les figures 1D et 2D).
      NOTE: '% du volume / matériau B-dessus du seuil colocalisés' correspond% du signal de Aß totale colocalisés avec phagolysosomes.Ceci peut être utilisé pour évaluer la fraction de dépôts de Aß totaux encapsulées dans les phagolysosomes (non représentés dans les présents résultats représentatifs).
  3. Utilisez le module surpasser pour reconstruire les piles d'images confocale et de générer des modèles 3D de Aß encapsulées dans phagolysosomes monocytes.
    1. Dans la fenêtre 'de réglage de l'affichage ", sélectionnez TRITC (pour montrer que la coloration Iba1). Dans la fenêtre 'propriétés de volume », cliquez sur« ajouter une nouvelle surface.
    2. Dans l'étape «1/5 algorithme», dans les «paramètres», sélectionnez «surface». En outre, dans " la couleur" , sélectionnez le type de couleur dans la palette ou RGB et ajuster la transparence (rouge est fixé à 60% de transparence dans les figures 1B et 2B). Cochez la case 'select région d'intérêt ». Cliquez sur Suivant.
    3. Dans l' étape '2/5 région d'intérêt, «dessiner une fenêtre autour de la cellule d'intérêt en ajustant x, y et z les coordonnées (voir cases blanches dans les figures 1A et 2A). Cliquez sur Suivant.
    4. Dans l'étape '3/5 source de canal », sélectionnez le canal source TRITC. Cochez la case «lisse» et régler le niveau de détail de la zone de surface à 0,4 um. Pour 'seuillage ", sélectionnez l'intensité absolue. Cliquez sur Suivant.
    5. Dans l'étape «seuil 4/5, 'ajuster seuil de sorte que le volume créé recouvre parfaitement avec le signal de canal TRITC. Cliquez sur Suivant.
    6. Dans l'étape '5/5 classer surfaces,' dans la section «type de filtre", sélectionnez les objets en fonction de leur taille à inclure ou à exclure des volumes à créer. Cliquez sur Terminer, exécuter toutes les étapes de création, et quitter l'assistant.
    7. Répétez les étapes 4.3.1 à 4.3.6 pour créer une surface 3D pour le canal FITC (LAMP1 + ou CD68 + phagolysosomes).
    8. Répétez les étapes 4.3.1 à 4.3.6 pour créer une surface 3D pour le canal Cy5 (OC + ou dépôts 4G8 + Aß).

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Résultats

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En utilisant la méthodologie multi-scène pour q3DISM détaillée ci - dessus, nous sommes en mesure de quantifier Aß absorption dans phagolysosomes de monocytes dans le cerveau des APP / PS1 souris (figure 1) et les rats TgF344-AD (Figure 2). Par conséquent, la méthodologie de q3DISM a permis l'analyse des phagocytes mononucléaires dans des modèles de souris et de rat de la MA. Fait intéressant, le volume occupé par CD68 + phagolysosomes est sig...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole que nous décrivons dans ce rapport pour une véritable quantification 3D de Aß phagocytose in vivo par des phagocytes mononucléaires repose sur un étiquetage spécifique des compartiments cellulaires et intracellulaires ainsi que les dépôts Aß. Plus précisément, on utilise Iba1 (ionisée calcium Binding molécule adaptatrice 1), une protéine qui est impliquée dans fronçage de la membrane et une phagocytose lors de l' activation des cellules 18, 19, pour colorer phag...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M-V. G-S. est soutenu par une bourse de recherche sur la maladie d’Alzheimer de la Fondation BrightFocus (A2015309F) et une bourse de jeune chercheur de l’Alzheimer’s Association, California Southland Chapter. T.M.W. est soutenu par une fondation ARCS et une bourse postdoctorale commémorative Maggie McKnight Russell-JDFAF de la Fondation John Douglas French Alzheimer’s. Ce travail a été soutenu par le National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, à T.T.), un prix Zenith Fellows de l’Alzheimer’s Association (ZEN-10-174633, à T.T.) et un prix de mi-carrière Julie Martin de l’American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation pour la recherche sur le vieillissement (M11472, à T.T.). Nous sommes reconnaissants des fonds de démarrage de l’Institut de neurogénétique Zilkha, qui ont contribué à rendre ce travail possible.  

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
IsofluraneAbbottNDC 0044-5260-05
Ciseaux de dissectionVWR82027-582
Ciseaux de dissection Pointe émousséeVWR82027-588
Pince à épilerVWR94024-408
Aiguille 23 GVWRBD305145
pompe péristaltique FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02Saline tamponnée au phosphate ; Concentration de travail 1x
Matrice cérébrale de souris adulte, Coupes coronales, Acier inoxydable 1 mm  ;Kent ScientificRBMS-200C
Matrice cérébrale de rat adulte, tranches coronales, acier inoxydable 1 mm  ;Kent ScientificRBMS-305C  ;
Solution aqueuse de paraformaldéhyde (PFA) à 32 %EMS15714-SAttention : Toxique. Concentration de travail : 4 % dans PBS
EthanolVWR89125-188Concentrations diverses, voir protocole
Tissue-Tek Uni-cassettes SakuraVWR25608-774
Paraffine d’enrobage et d’infiltrationVWR15147-839
Microtome Leica RM2125Leica Biosystems
Lames de microtome jetables  ;VWR25608-964
Bain-marie Leica HI 1210Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plusVWR48311-703
XyleneSigma-Aldrich534056-4X4LAttention : Toxique  ;
Solution de récupération de cible 10xDAKOS1699Concentration de travail 1x
KimWipesVWR21905-026
Stylo PAP hydrophobeVWR95025-252
Triton X-100VWR97062-208
Sérum d’âne normal (NDS)Jackson Immuno017-000-121
Lamelles VWR48393081
Réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPILife TechnologiesP36935
Glass Slide RackVWR100492-942
Anticorps Iba1 (polyclonal, lapin)Wako019-19741  ;Concentration de travail 1:200
Anticorps Iba1 (polyclonal, chèvre)LifeSpan BioscienceLS-B2645Concentration de travail 1:200
Anticorps CD68 [KP1] de rat (monoclonal, souris)Abcamab955Concentration de travail 1:200
souris CD68 [FA-11] anticorps (monoclonal, rat)Abcamab53444Concentration de travail 1:200
souris CD107a (LAMP1) anticorps (monoclonal, rat)Affymetrix14-1071Concentration de travail 1:100
Anticorps bêta-amyloïde, 17 - 24 (4G8) (monoclonal, souris)CovanceSIG-39220Concentration de travail 1:200
Bêta-amyloïde, 1 - 16 (6E10) anticorps (monoclonal, souris)CovanceSIG-39320Concentration de travail 1:200
Anticorps OC (polyclonal, lapin)Offert par D. H. Cribbs et C. G. Glabe (UC Irvine)Concentration de travail 1:200
Alexa Fluor 488 souris anticorps secondaireInvitrogenA-11001Concentration de travail 1:1 000
Alexa Fluor 488 rat Anticorps secondaireInvitrogenA-11006Concentration de travail 1:1 000
Alexa Fluor 594 lapin anticorps secondaireInvitrogenA-11037Concentration de travail 1:1 000
Alexa Fluor 594 chèvre anticorps secondaireInvitrogenA-11080Concentration de travail 1:1 000
Alexa Fluor 647 Anticorps secondairede souris InvitrogenA-21235Concentration de travail 1:1 000
Alexa Fluor 647 Anticorps secondaire de lapinInvitrogenA-21443Concentration de travail 1:1 000
Huile d’immersionNikon  ;
Microscope confocal A1Nikon²
NIS Elements Advanced Research softwareNikon·s
Imaris :Bitplane version 7.6Bitplane"coloc » et « supass » sont utilisés.  ; Alternativement, le freeware open-source  ; ImageJ peut être utilisé pour la colocalisation  ; Analyse d’ensembles de données confocales Z-Stacks.
 ; Les modules

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
  4. Mawuenyega,, et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330 (6012), 1774(2010).
  5. Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
  6. Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
  7. Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
  8. Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
  9. Hazrati, L. -N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949(2012).
  10. Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
  11. Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393(2015).
  12. Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. , 314185(2012).
  13. Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
  14. Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
  15. Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
  16. Guillot-Sestier, M. -V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
  17. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
  18. Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
  19. Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
  20. Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
  21. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  22. Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
  23. Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
  24. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
  25. Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
  26. Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
  27. Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
  28. Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33(2015).
  29. Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46(2014).
  30. Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
  31. Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
  32. Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
  33. Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
  34. Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).

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