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Inductibles stables lignées cellulaires LAP marqués pour Enquêter la fonction des protéines, Spatiotemporal Localisation et Interaction Networks Protein

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DOI :

10.3791/54870

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24 décembre 2016

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode de génération de lignées cellulaires stables inductibles marquées par la localisation et la purification d’affinité (LAP) pour étudier la fonction des protéines, la localisation subcellulaire spatio-temporelle et les réseaux d’interaction protéine-protéine.

Résumé

Des complexes multiprotéiques, plutôt que des protéines uniques agissant de manière isolée, régissent souvent les voies moléculaires régulant l’homéostasie cellulaire. Sur la base de ce principe, la purification des protéines critiques nécessaires au fonctionnement de ces voies avec leurs partenaires d’interaction natifs a non seulement permis de cartographier les constituants protéiques de ces voies, mais a également permis une compréhension plus approfondie de la façon dont ces protéines se coordonnent pour réguler ces voies. Dans ce contexte, la compréhension de la localisation spatio-temporelle d’une protéine et de son réseau d’interaction protéine-protéine peut aider à définir son rôle dans une voie, ainsi que la façon dont sa mauvaise régulation peut conduire à la pathogenèse de la maladie. Pour répondre à ce besoin, plusieurs approches de purification des protéines, telles que la purification d’affinité en tandem (TAP) et la purification de localisation et d’affinité (LAP), ont été conçues et utilisées avec succès. Néanmoins, afin d’appliquer ces approches à des analyses protéomiques à l’échelle de la voie, ces stratégies doivent être complétées par des développements technologiques modernes en matière de clonage et de génération de lignées cellulaires stables de mammifères. Ici, nous décrivons une méthode de génération de lignées cellulaires stables humaines inductibles marquées au LAP pour étudier la localisation subcellulaire des protéines et les réseaux d’interaction protéine-protéine. Cette approche a été appliquée avec succès à la dissection de plusieurs voies cellulaires, y compris la division cellulaire, et est compatible avec les analyses protéomiques à haut débit.

Introduction

Pour étudier la fonction cellulaire d’une protéine non caractérisée, il est important de déterminer sa localisation subcellulaire spatio-temporelle in vivo et ses partenaires protéiques en interaction. Traditionnellement, des marqueurs d’épitopes simples et en tandem fusionnés à l’extrémité N ou C d’une protéine d’intérêt ont été utilisés pour faciliter les études de localisation et d’interaction des protéines. Par exemple, la technologie de purification par affinité en tandem (TAP) a permis d’isoler des complexes protéiques natifs, même ceux qui sont en faible abondance, dans les lignées cellulaires de levure et de mammifère1,2. La technologie de localisation et de purification d’affinité (LAP) est un développement plus récent qui modifie la procédure TAP pour inclure un composant de localisation par l’introduction de la protéine fluorescente verte (GFP) comme l’une des étiquettes d’épitope3. Cette approche a permis aux chercheurs de mieux comprendre la localisation subcellulaire d’une protéine dans les cellules vivantes, tout en conservant la capacité d’effectuer des purifications complexes TAP pour cartographier les réseaux d’interaction protéine-protéine.

Cependant, il existe de nombreux problèmes associés à l’utilisation des technologies TAP/LAP qui ont entravé leur utilisation généralisée dans les cellules de mammifères. Par exemple, le temps nécessaire pour générer une lignée cellulaire stable exprimant une protéine d’intérêt marquée TAP/LAP ; qui repose généralement sur le clonage du gène d’intérêt dans un vecteur viral et la sélection d’intégrants stables de cellule unique avec le niveau d’expression souhaité. De plus, de nombreuses voies cellulaires sont sensibles à la surexpression des protéines constitutives (même à de faibles niveaux) et peuvent arrêter les cellules ou déclencher la mort cellulaire au fil du temps, ce qui rend impossible la génération d’une lignée cellulaire stable TAP/LAP. Ces contraintes et d’autres ont empêché les méthodologies LAP/TAP de devenir des systèmes à haut débit pour la localisation et l’élucidation de complexes protéiques. Par conséquent, le développement d’un système de marquage LAP inductible à haut débit pour les cellules de mammifères qui tire parti des innovations actuelles en matière de clonage et de technologies de lignées cellulaires a suscité un intérêt considérable.

Nous présentons ici un protocole permettant de générer des lignées cellulaires stables avec des protéines d’intérêt marquées au LAP inductibles par Doxycycline/Tétracycline (Dox/Tet) qui applique les avancées dans les technologies de clonage et de lignées cellulaires de mammifères. Cette approche simplifie l’acquisition de données en ce qui concerne la localisation subcellulaire des protéines marquées LAP, la purification de complexes protéiques et l’identification des protéines en interaction4. Bien que la protéomique d’affinité utilise un large éventail de techniques pour l’élucidation des complexes protéiques5, notre approche est bénéfique pour accélérer l’identification de ces complexes et de leurs réseaux d’interaction natifs et se prête au marquage des protéines à haut débit qui est nécessaire pour étudier des voies biologiques complexes contenant une multitude de constituants protéiques. La clé de cette approche sont les progrès réalisés dans les stratégies de clonage qui permettent une haute fidélité et un clonage accéléré des gènes cibles dans un éventail de vecteurs pour l’expression génique in vitro, dans divers organismes comme les bactéries et les baculovirus, et dans les cellules de mammifères6,7. De plus, la collaboration ORFeome a cloné des milliers de cadres de lecture ouverts validés en séquence dans des vecteurs qui intègrent ces avancées dans le clonage, qui sont disponibles pour la communauté scientifique8-11. Dans notre système, le vecteur de marquage LAP pGLAP1 permet le clonage simultané d’un grand nombre de clones, ce qui facilite le marquage LAP à haut débit. Cette procédure de clonage accélérée est couplée à une approche simplifiée pour générer des lignées cellulaires avec des gènes d’intérêt marqués par LAP insérés à un seul locus génomique prédéterminé. Cela utilise des lignées cellulaires qui contiennent un seul site de reconnaissance de flippase (FRT) dans leur génome, qui est le site d’intégration des gènes marqués LAP. Ces lignées cellulaires expriment également le répresseur de tétracycline (TetR) qui se lie aux opérateurs de Tet (TetO2) en amont des gènes marqués LAP et réduit au silence leur expression en l’absence de Dox/Tet. Cela permet l’expression inductible par Dox/Tet de la protéine marquée LAP à un moment donné. Il est essentiel d’avoir la capacité d’exprimer des protéines inductibles marquées au LAP, car de nombreuses voies cellulaires sont sensibles aux niveaux de protéines critiques régissant la voie et peuvent arrêter la croissance cellulaire ou déclencher la mort cellulaire lorsque ces protéines sont constitutivement surexprimées, même à de faibles niveaux, ce qui rend impossible la génération de lignées cellulaires stables non inductibles marquées au LAP12.

Protocole

NOTE: Une vue d' ensemble de la génération de lignées cellulaires stables inductibles LAP marqués pour toute protéine d'intérêt est illustrée à la figure 1 et la vue d' ensemble de l' expression de la protéine LAP-tagged, la purification et la préparation de protéomique de masse analyses est illustrée à la figure 3.

1. Clonage du cadre de lecture ouvert (ORF) du gène d'intérêt dans le LAP-tag Vector

  1. Clonage de l'ORF du gène d'intérêt dans la navette Vector.
    1. Utiliser la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour amplifier l'ORF d'intérêt avec les attB1 et attB2 des sites appropriés dans les amorces pour l'une ou l'autre fusion N-terminale ou une fusion C-terminale. Voir le tableau 1 pour les séquences d'amorces et le tableau 2 pour les conditions de PCR.
    2. Gel purifie les produits PCR par leur résolution sur un gel d'agarose à 1%. Exciser la bande amplifiée qui est la taille correcte du gel et l'extraire de la tranche de gel en utilisant un ADN gkit d'extraction el selon les instructions du fabricant.
    3. Incuber le attB purifié contenant des produits de PCR avec un attP contenant le vecteur navette et la recombinase qui permet aux produits de PCR se recombiner dans le vecteur selon les instructions du fabricant (voir M atières Table).
      NOTE: Les vecteurs navettes vides et LAP-marquage vecteurs contiennent le gène ccd B et doivent être propagé dans des cellules bactériennes résistantes ccd B (voir tableau des matériaux). Toutefois , le gène ccdB est recombinée quand un ORF est inséré dans ces vecteurs, donc utiliser des cellules standard DH5a de E. coli lors de la propagation des vecteurs avec des ORFs clonées.
    4. Transformer des cellules DH5a de E. coli avec 1 pl du produit de la réaction et de la plaque les cellules transformées sur un bouillon de Luria (LB) gélose avec 50 mg / ml de kanamycine 13.
    5. Sélectionnez les colonies résistantes à la kanamycine.
    6. Cultivez les colonies sélectionnées dans LB-moide diamètre avec 50 mg / ml de kanamycine, faire une mini-préparation d'ADN et confirmer l' intégration du gène par un séquençage d'ADN en utilisant les amorces de séquençage énumérées dans le tableau 3.
  2. Transfert du gène d'intérêt de la navette du vecteur dans le LAP-tag Vector.
    1. Incuber le vecteur navette contenant le gène de la séquence vérifiée d'intérêt ORF avec le vecteur LAP-tag (pGLAP1 pour la fusion N-terminal) et la recombinase qui médie le transfert du gène d'intérêt du vecteur navette dans le vecteur LAP-tag selon les instructions du fabricant (voir Matériaux).
      NOTE: Une série de vecteurs LAP / TAP qui peuvent être utilisés en fonction du promoteur désiré, épitope-étiquette, et N ou le marquage C-terminal peuvent être trouvés dans le tableau 4.
    2. Transformer des cellules DH5a de E. coli avec 1 pl du produit de la réaction et de la plaque les cellules transformées sur une plaque d'agar LB contenant 100 mg / ml 13 d' ampicilline.
    3. Sélectionnez la colo résistant à l'ampicillineNEI.
    4. Cultivez les colonies sélectionnées dans un milieu LB avec 100 mg / ml ampicilline, faire une mini-préparation d' ADN, et de confirmer l' intégration du gène par séquençage d'ADN en utilisant les amorces de séquençage énumérées dans le tableau 5.

2. Génération d'un inductible cellulaire Stable ligne qui exprime le gène LAP-étiqueté d'intérêt

  1. Sélectionnez la ligne qui convient le mieux pour le projet d'intérêt de la cellule. En variante, créer une lignée de cellules d'hôte à partir d'une quelconque lignée cellulaire existant qui exprime de manière constitutive le TetR et contient un site FRT qui permet au gène LAP marqués d'intérêt devant être intégré de manière stable dans le génome (voir Matériaux).
    Remarque: Ce protocole utilise une lignée de cellules HEK293 qui contient le TetR et un site FRT, qui est cultivé dans -tet DMEM / F12 [faite avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) qui est dépourvu de tetracycline (-tet)] 4 .
  2. Déterminer la concentration minimale de hygromycine nécessaire pour tuer la lignée cellulaire hôte en 1 à 2 weeks après addition de la drogue. La concentration peut varier entre les lignées de cellules hôtes, la majorité se situant entre 100 pg / ml et 800 pg / ml.
    NOTE: les cellules HEK293 cultivées dans -tet DMEM / F12 avec 100 pg / ml d' hygromycine à 37 ° C et 5% de CO 2 va mourir dans les 1-2 semaines.
  3. Co-transfecter le vecteur qui exprime la recombinase flippase (médie l'intégration du gène LAP étiquetée d'intérêt dans le site FRT dans le génome de la cellule) avec le vecteur LAP étiqueté dans des cellules HEK293 en utilisant un réactif de transfection selon les instructions du fabricant . Utiliser un ratio de 4: 1 du vecteur de recombinase à vecteur LAP 14.
    NOTE: Le rapport optimal dépend de la lignée cellulaire hôte et le procédé de transfection, et peut nécessiter un titrage. Un rapport de 4: 1 fonctionne bien pour la plupart des lignées cellulaires. Inclure une plaque maquette transfectées comme témoin négatif.
  4. Un jour après la transfection, remplacer le support / F12 -tet DMEM avec des milieux frais.
  5. Deux jours après transfectile fractionnement de cellules, à 25% de confluence. Laisser les cellules ~ 5 h à attacher, puis ajouter hygromycine contenant -tet DMEM / F12 à la concentration prédéterminée dans l'étape 2.2. Pour HEK293 cellules utilisent 100 pg / ml d'hygromycine.
    REMARQUE: Le TRAF contenant une lignée cellulaire HEK293 contient également le TetR qui est associée à la résistance à la blasticidine, par conséquent, 5 ug / ml de blasticidine est utilisé pendant le processus de sélection de lignées cellulaires stables pour choisir le TetR et pour minimiser l'expression qui fuit.
  6. Remplacer hygromycine contenant -tet DMEM / F12 selon les besoins jusqu'à ce que des foyers de cellules distinctes apparaissent qui ressemblent à des taches opaques contre la plaque transparente.
  7. Ajouter 20 pi de trypsine au-dessus de chacun des foyers de cellules et de haut en bas pipeter 2 fois avec une pointe de pipette de 200 pi. La place des cellules dans une plaque 24 puits et étendre les cellules par une croissance continue dans hygromycine contenant -tet DMEM / F12.
  8. cellules d'écran pour inductible expression de la protéine LAP marqués par cellule fixe ou des cellules vivantes de microscopie par fluorescence et / ouWestern blot pour la balise GFP dans le LAP-tag 15.

3. Purification des complexes de protéines LAP-tagged

NOTE: Les LAP-tagged purification de protéines détails protocolaires recommandations suivantes sur les conditions et les volumes utilisés pour une protéine purification typique LAP-tagged basé sur l'expérience précédente. Cependant, il faut être prudent pour veiller à ce que l'optimisation empirique est effectuée pour tout niveau d'intérêt expression complexe de protéines et de protéines pour fournir les meilleurs résultats.

  1. La croissance cellulaire et la cellule de récolte.
    1. Développez la lignée cellulaire LAP-tagged validé pour l' isolement du TAP de complexes protéiques, par passage en permanence toutes les cellules HEK293 dans des plaques plus grandes et / ou des bouteilles à rouleaux dans -tet DMEM / F12 à 37 ° C et 5% de CO 2.
    2. Pour les souris Tet / Dox lignées cellulaires inductibles, pour induire de 10 à 15 heures à une concentration de 0,2 pg / ml Tet / Dox lorsque les cellules ont atteint ~ 70% de confluence avant harvesting de cellules.
      NOTE: Le temps de concentration et de l'induction doit être déterminé pour chaque protéine, un titrage de 0,1-1 pg / ml Tet / Dox pendant 10-15 heures est recommandé.
    3. Récolte des cellules par agitation ou trypsinisation et pellets cellules à 875 g pendant 5-10 min.
  2. Accouplement anti-GFP anticorps à des billes de protéine A
    1. Utilisez 40 ug d'anticorps pour l'immunoprécipitation d'un lysat préparé à partir d'une pastille de 0,5 ml de cellules, hématocrite (PCV).
      NOTE: La quantité d'anticorps nécessaire dépendra de l'abondance de la protéine LAP-marqué, entre autres facteurs, et nécessitera l'optimisation. Un titrage de 10 à 40 pg est recommandée.
    2. Equilibrer 160 ul de volume compressé (PV) des billes de protéine A dans du PBST (PBS + 0,1% de Tween-20) dans un tube de 1,5 ml. Laver 3 fois avec 1 ml de PBST.
      NOTE: Tous les lavages des présentes sont réalisées par centrifugation des perles à 5000 xg pendant 10 sec.
    3. Remettre les billes dans 500 pi PBST et ajouter 80 pg d'affinitélapin anti-GFP purifié à anticorps à chaque tube de 160 perles ul. Mélanger pendant 1 heure à la température ambiante (RT).
    4. Laver les billes 2 fois avec 1 ml de PBST. Ensuite, les perles de lavage 2 fois avec 1 ml de 0,2 M de borate de sodium, pH 9 (20 ml 0,2 M borate de sodium + 15 ml de 0,2 M d'acide borique). Après le lavage final, ajouter 900 pi de borate de sodium 0,2 M, pH 9 pour amener le volume final à 1 ml.
    5. Ajouter 100 ul de 220 mM dimethylpimelimidate (DMP) à une concentration finale de 20 mM. Tournez doucement les tubes à température ambiante pendant 30 min. Pour mM DMP 220, resuspendre contenu d'un flacon de 50 mg dans 877 ul de 0,2 M borate de sodium, pH 9 et ajouter immédiatement à la suspension de billes.
    6. Après incubation avec le DMP, laver les perles 1 fois avec 1 ml de 0,2 M d'éthanolamine, 0,2 M de NaCl, pH 8,5 pour inactiver l'agent de reticulation résiduel. Resuspendre les billes dans 1 ml du même tampon et tournent pendant 1 heure à température ambiante. perles de granules et de perles de remettre en suspension dans 500 ul de 0,2 M éthanolamine, 0,2 M de NaCl pH 8,5. Perles sont stables pour several mois à 4 ° C.
  3. Préparation de tampons pour Lyse des cellules et purification du complexe
    1. Préparation des tampons LAPX (où X est la concentration en sel désirée [KCI mM] du tampon LAP; 300 mM pour la lyse des cellules, 200 mM pour la plupart des lavages de talon, et 100 mM pour les billes de lavage des protéines avant l'élution) en faisant un 7,4 solution à pH contenant mM d' acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-50 piperazineethanesulfonic (HEPES), X mM de KCl, 1 mM d' acide éthylèneglycol tétraacétique (EGTA) 1 mM de MgCl2 et 10% de glycérol.
      REMARQUE: Les composants de ce tampon sont utilisés pour rapprocher l'environnement dans les cellules vivantes. HEPES est utilisé comme un tampon dans la rage de pH de 7,2-8,2. KCI est un sel utilisé pour maintenir la force ionique du tampon. EGTA est un agent chélatant qui lie les ions calcium pour réduire les niveaux de calcium par rapport au magnésium. Le glycérol et MgCl2 sont utilisés pour améliorer la stabilité des protéines.
    2. Préparer tampon LAPX N en ajoutant 0,05% nonyle phenoxypolyethoxylethanol au tampon de LAPX.
      REMARQUE: nonyl phenoxypolyethoxylethanol est un détergent qui solubilise les protéines, mais préserve les interactions protéine-protéine, ainsi une concentration plus élevée est utilisée pendant le processus d'extraction et il est ensuite abaissée au cours des étapes de liaison et de lavage.
  4. Préparation des lysats cellulaires
    1. Remettre en suspension 500 pi de CVP dans 2,5 ml de LAP300 avec du dithiothréitol 0,5 mM (DTT) et les inhibiteurs de protéase. Ajouter 90 ul de 10% nonyle phenoxypolyethoxylethanol (0,3% final) et mélanger par retournement.
    2. Placer sur la glace pendant 10 min. Centrifugeuse à 21.000 xg pendant 10 min. Recueillir ce surnageant à faible vitesse (LSS). Prélever un échantillon de 10 ul du LSS pour l'analyse sur gel.
    3. Transfert LSS à un tube de TLA100.3 et de spin à 100.000 xg pendant 1 h à 4 ° C. Recueillir ce surnageant à grande vitesse (HSS), dans un tube et le placer sur la glace. Prélever un échantillon de 10 pi de la SSC pour l'analyse sur gel.
      REMARQUE: Évitez de prendre le plus haut sommet lipidique couche d'und de la couche inférieure la plus débris cellulaires. La couche lipidique doit être éliminé par aspiration sous vide avant de recueillir le HSS.
  5. Première capture d'affinité: Reliure à Perles Anti-GFP
    1. Pré-éluées des billes d'anticorps couplés (utilisent 160 ul de perles par 0,5 ml de culot cellulaire (PCV)) en les lavant 3 fois avec 1 ml de tampon d' élution [3,5 M de MgCl2 à 20 mM de Tris, pH 7,4] pour se débarrasser de découplée anticorps et réduisent fond. Faites vite. Ne laissez pas des perles en sel élevée pendant une longue période.
    2. Laver les billes 3 fois avec 1 ml de N LAP200. Mélanger HSS extrait avec des billes d'anticorps pendant 1 heure à 4 ° C. Centrifugeuse à 21.000 xg pendant 10 min. Prélever un échantillon de 10 ul du surnageant ( par exemple, le débit (FT)) pour une analyse sur gel.
    3. Lavez perles 3 fois avec 1 ml de LAP200 N avec des inhibiteurs de 0,5 mM de DTT et de la protéase. Lavez perles 2 fois (5 min chacun) avec 1 ml de LAP200 N avec des inhibiteurs de 0,5 mM de DTT et de la protéase. Laver rapidement 2 times avec 1 ml de N LAP200 avec 0,5 mM de DTT et sans inhibiteurs de protéase avant d' ajouter la protéase du virus etch du tabac (TEV).
  6. TEV Décolleté
    1. Diluer 10 ug protéase TEV dans 1 ml de N LAP200 et faire tourner les tubes à 4 ° C pendant une nuit.
      REMARQUE: Cette étape peut être optimisée pour toute protéine LAP-étiqueté à être complété en quelques heures en ajustant la concentration de la protéase TEV, qui peut aider à la préservation des complexes de protéines LAP-tagged.
    2. perles à granulés et le transfert surnageant à un nouveau tube. Rincer perles deux fois avec 160 ul LAP200 N avec 0,5 mM de DTT et les inhibiteurs de la protéase (concentration triple) pour éliminer toute protéine résiduelle. Prélever un échantillon de 10 ul du surnageant pour l'analyse sur gel.
  7. Deuxième Capture d'affinité: Reliure à S Protein Agarose
    1. Laver 1 tube de 80 ul de protéine S agarose suspension (40 pi de résine emballé) 3 fois avec 1 ml de N LAP200.
      REMARQUE: S protliaison ein à l'étiquette S va reconstituer une RNase active et une deuxième étiquette d'épitope alternatif doit être pris en considération pour l'ARN contenant des complexes protéiques.
    2. Ajouter TEV élue surnageant à S billes de protéine d'agarose et de roche pendant 3 heures à 4 ° C. Perles de granules et laver 3 fois avec 1 ml de LAP200 N avec des inhibiteurs de 0,5 mM de DTT et de la protéase. Laver les billes 2 fois avec 1 ml de LAP100.
  8. On élue la protéine
    1. Éluer des protéines de la protéine S d'agarose en ajoutant 50 pi de Laemmli 4x tampon d'échantillon et on chauffe à 97 ° C pendant 10 min.
      REMARQUE: Les protéines peuvent être éluées à partir des billes avec du tampon d'élution (3,5 M de MgCl2 à 20 mM de Tris, pH 7,4).

4. Identifier les protéines interagissant par analyse de spectrométrie de masse

  1. Tester la qualité de la purification par l'analyse des échantillons prélevés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE), coloration à l'argent du gel (voir Matériaux de table) et par immunotransfert éluats et le sondage avec des anticorps anti-GFP pour faire en sorte que la purification LAP-tagged travaillé 16, voir la figure 4.
  2. Pour identifier les espèces co-purifiantes stoechiométriques et stoechiométriques, prélever l'échantillon final d'élution et le séparer par SDS-PAGE. Colorer le gel avec une spectrométrie de masse de protéines compatible tache. Exciser les groupes les plus importants et l'espace entre eux à partir du gel et de les traiter pour l' analyse par spectrométrie de masse séparément 16.
    NOTE: Il existe de nombreuses approches pour séparer les éluats finales de purification et de les préparer à la spectrométrie de masse 5. Par exemple, les complexes LAP purifiés peuvent être élues à partir de perles S-protéine en utilisant haute teneur en sel (3,5 M MgCl 2) et l' ensemble de la population de protéines en masse peut être analysé par spectrométrie de masse 17. Alternativement, éluats finaux peuvent être séparés pour 1 mm par SDS-PAGE et une seule bande de 1 mm peut être excised et analysés. Cela efface le mélange complexe de toutes les billes ou les matières particulaires qui interfèrent avec l'analyse.

Résultats

Pour mettre en évidence l'utilité de ce système, le cadre de lecture ouvert (ORF) de la protéine de liaison de tau aux microtubules a été clone dans le vecteur navette en amplifiant le Tau ORF avec des amorces contenant attB1 et attB2 emplacements (tableau 1) et l' incubation des produits de PCR avec le vecteur navette et une recombinase qui médie l'introduction des produits de PCR dans le vecteur navette. Les produits de réaction ont été utilisés pour transformer des bactéries DH5a 13 et l' ADN de plasmide à partir des colonies résistantes à la kanamycine a été séquencée pour assurer une insertion Tau. Une séquence validée navette Tau vecteur a été ensuite utilisé pour transférer le Tau ORF dans le vecteur pGLAP1, qui fusionne Tau dans le cadre avec le LAP (EGFP-TEV-S-Protein) tag, en incubant le vecteur navette Tau avec le vecteur pGLAP1 et la recombinase qui médie le transfert de l'ORF à partir du vecteur navette pour pGLAP1. Les produits de réaction ont été utilisés pour transformer des bactéries DH5a13 l' ADN et le plasmide à partir des colonies résistantes à l' ampicilline a été séquence pour s'assurer que la fusion LAP-Tau est dans le cadre. Séquence validé pGLAP1-LAP-Tau a ensuite été co-transfectées avec un vecteur qui exprime l'enzyme flippase de recombinaison dans des cellules HEK293 qui contenait une cible de reconnaissance de flippase unique (FRT) du site dans leur génome, qui est le site de l'intégration des gènes LAP-tagged 14. Cette lignée cellulaire a également exprimé l'TetR qui se lie aux opérateurs Tet en amont des gènes LAP-marqués et fait taire leur expression en l'absence de Tet / Dox. intégrants stables ont été sélectionnées avec -tet du milieu DMEM / F12 avec 100 pg / ml d'hygromycine pendant 5 jours. Hygromycine foyers de cellules résistantes individuelles ont été récoltées en ajoutant 20 pi de trypsine sur le dessus et pipetant 2 fois. Les cellules ont été placées dans une plaque de 24 puits et développées par la croissance continue des -tet DMEM / F12.

Pour vérifier que la cellule résistant à l'hygromycines étaient capables d'exprimer LAP-Tau, des cellules HEK293 LAP-Tau ont été induites avec 0,1 pg / ml de Dox pendant 15 heures et des extraits protéiques ont été préparés à partir de cellules non induites et induites par Dox. Ces extraits ont été séparés par SDS-PAGE, transférés sur une membrane de PVDF, et immunotransférés pour la GFP et la tubuline en tant que témoin de chargement. Comme on le voit sur la figure 4A, LAP-Tau (visualisée à l' aide des anticorps anti-GFP) a été exprimé seulement en présence de Dox. Pour valider LAP-Tau est correctement localisée à la broche de microtubules mitotique lors de la mitose, comme cela a été montré précédemment pour Tau endogène 18, HEK293 LAP-Tau ont été induites avec 0,1 pg / ml de Dox pendant 15 heures et les cellules ont été fixées avec 4% paraformaldéhyde et co-colorées pour l'ADN (Hoechst 33342) et microtubules (anticorps anti-tubuline). Systématiquement, LAP-Tau a été localisé sur le fuseau mitotique lors de la métaphase de la mitose (figure 4B). Pour vérifier que le LAP-Tau et ses protéines interagissant pourrait être purifiée avec ce system, des cellules HEK293 LAP-Tau ont été cultivées dans des flacons roulants à ~ 70% de confluence, induites avec 0,1 pg / ml de Dox pendant 15 heures, récoltées par agitation, lysées avec un tampon LAP300 et LAP-Tau a été purifié en utilisant le protocole ci-dessus. Éluats de la purification LAP-Tau ont été résolus par SDS-PAGE et le gel a été coloré à l'argent. Figure 4C montre la purification LAP-Tau, marqué d'un astérisque est LAP-Tau et plusieurs autres bandes indicatives de protéines interagissant Tau peut être vu.

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Figure 1: Vue d' ensemble de la génération de inductibles lignées cellulaires stables LAP marqués pour toute protéine d'intérêt. Le cadre de lecture ouvert (ORF) de gènes d'intérêt sont amplifiés avec attB1 et attB2 les sites flanquant 5 'et 3' des séquences terminales, respectivement (les séquences d'amorce sont données en Tableau 1) et clone dans le vecteur navette. La séquence vérifiée des vecteurs navette avec le gène d'intérêt sont ensuite utilisés pour transférer le gène d'intérêt dans le vecteur pGLAP1. La séquence vérifiée pGLAP1 vecteur avec le gène d'intérêt est alors co-transfectées avec le vecteur contenant la recombinase de flippase dans la lignée cellulaire désirée qui contient une cible de reconnaissance de flippase unique (FRT) du site dans leur génome, qui est le site d'intégration pour les LAP gènes -tagged. Ces lignées cellulaires expriment également le répresseur Tet (TetR) qui se lie aux opérateurs de Tet (TetO 2) en amont des gènes LAP marqués et des silences leur expression en l'absence de Tet / Dox. Le gène LAP-marqué d'intérêt est ensuite recombinée dans le site FRT et intégrants stables sont sélectionnés avec hygromycine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2: Vue d' ensemble des applications pour stables lignées cellulaires LAP-étiquetés. inductibles lignées cellulaires stables LAP-tagged sont induites pour exprimer la protéine LAP-tagged d'intérêt par addition Dox et peuvent être synchronisés à différents stades du cycle cellulaire ou peuvent être stimulées avec des produits chimiques ou des ligands pour activer toute voie de signalisation souhaitée. La localisation subcellulaire de la protéine LAP étiquetée d'intérêt peut être analysé par imagerie des cellules vivantes ou des cellules fixes. protéines LAP-marqués peuvent également être tandem purifié par affinité et leurs protéines interagissant peut être identifié par chromatographie tandem liquide spectrométrie de masse (LC-MS / MS). Enfin, Cytoscape peut être utilisé pour générer un réseau d'interactions protéine-protéine de la protéine appât. Dox indique Doxycycline, IP immunoprécipité indique, EGFP indique renforcée protéine fluorescente verte, Tev indique la protéase TEV site de clivage, et S indique S-tag.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3: Vue d'ensemble des LAP-tagged Protein Expression, purification et préparation pour la spectrométrie de masse. Le protocole a 9 étapes: 1) la croissance et l'induction de l'expression des protéines LAP-tagged, 2) la récolte de cellules et la lyse, 3), la préparation de lysats, 4) la liaison de lysats à des billes anti-GFP, 5) TEV protéase clivage de la GFP-tag, 6) la liaison de lysats à des billes de protéine S, 7) l'élution de la protéine appât et les protéines qui interagissent, et 8-9) la préparation d'échantillons pour les analyses protéomiques basée spectrométrie de masse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-3
Figure 4: Vérification de l' expression LAP-Tau. (A) Western Blot (WB) l' analyse des échantillons de protéines à partir de cellules non induites et Dox induite LAP-Tau HEK293 sondées avec des anticorps anti-tubuline l' anti-GFP et pour détecter la protéine Tau LAP-marqués et le contrôle de la tubuline de chargement, respectivement. Notez que LAP-Tau est seulement exprimé lorsque les cellules sont induites avec Dox. Les cellules (B) mitotiques exprimant LAP-Tau ont été fixées et colorées pour la co-ADN (Hoechst 33342) et la tubuline (Tub) avec des anticorps anti-tubuline et la localisation subcellulaire de la protéine tau-LAP ont été analysés par fluorescence microcopie. A noter que LAP-Tau se localise sur la broche et la broche pôles mitotique lors de la mitose. (C) Argent gel coloré de la purification LAP-Tau. MW indique le poids moléculaire, CL indique lysats défrichées et E indicates éluats finales. Les échantillons ont été analysés sur SDS-PAGE à 4-20% et le gel a été coloré à l'argent pour visualiser les protéines purifiées. Notez qu'une bande correspondant au LAP-Tau est marqué d'un astérisque et plusieurs autres bandes correspondant aux protéines co-purification peut être vu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
N-terminal fusion
Vers l'avant 5'GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 '
Sens inverse 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (> 18gsn) -3 '
C-terminal fusion
Vers l'avant 5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 '
Sens inverse 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 '

Tableau 1: avant et arrière Amorces pour Amplifier ORFs ou intérêt pour l' insertion dans la navette du vecteur. Les sites attB sont indiqués en caractères gras, GSN signifie que les nucleotides spécifiques de plus de 18 géniques sont ajoutées à l'amorce.

Étape Température Temps
dénaturation initiale 94 ° C, 2 minutes
Cycles Amplification PCR (35) Dénaturer 94 ° C, 30 sec
Recuire 55 ° C (en fonction de l'amorce Tm) 30 sec
Étendre 72 ° C, 1 min / kb
Tenir 4 ° C indéfiniment

Tableau 2: Conditions de PCR pour l' amplification des ORF d'intérêt.

Vecteur Sequencing Primer Forward Inverser Sequencing Primer
Vecteur navette 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' CAGGAAACAGCTATGAC 5'-3 '

Tableau 3: directe et inversée Séquençage Amorces pour Shuttle vecteur.

ID Structure Parental organisateur Bac Res mam Res Tet reg?
pGLAP1 N-term EGFP-TEV-S peptide pcDNA5 / FRT / TO CMV Amp Hyg Oui
pGLAP2 N-term Flag-TEV-S peptide pcDNA5 / FRT / TO CMV Amp Hyg Oui
pGLAP3 N-term EGFP-TEV-S peptide; C-term V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a Amp Hyg Non
pGLAP4 N-term Flag-TEV-S peptide; ; C-term V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a Hyg Non
pGLAP5 C-term S peptide-PreProt x2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1a Amp Hyg Non

Tableau 4: Liste des vecteurs disponibles LAP / TAP avec les promoteurs variables, Epitope-tags, et Dox inductibles capacités d'expression pour N ou protéine de marquage C-terminal. Les vecteurs sont disponibles dans le commerce. Bac Res indique marqueur de résistance bactérienne, mam Res indique mammifère marqueur de résistance cellulaire, Tet reg? indique si l'expression est Tet / Dox régulable.

Vecteur Sequencing Primer Forward Inverser Sequencing Primer
pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTAGAA-3 ' TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC 5'-3 '
pGLAP2 CGAACGCCAGCACATGGACAGGG 5'-3 ' TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC 5'-3 '
pGLAP3 AGAAACCGCTGCTGCTAA 5'-3 ' TAGAAGGCACAGTCGAGG 5'-3 '
pGLAP4 AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC 5'-3 ' TAGAAGGCACAGTCGAGG 5'-3 '
pGLAP5 CGTAATACGACTCACTATAG 5'-3 ' TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG 5'-3 '

Tableau 5: directe et inversée Séquençage Apprêts pour pGLAP vecteurs.

Discussion

Le protocole décrit décrit le clonage de gènes d'intérêt dans le vecteur LAP-tagging, la génération de lignées inductibles cellulaires stables LAP-marqués, et la purification des complexes de protéines LAP marqués pour les analyses protéomiques. En ce qui concerne d'autres approches LAP / TAP-tagging, ce protocole a été simplifié pour être compatible avec les approches à haut débit pour cartographier les interactions de localisation des protéines et protéine-protéine dans aucune voie cellulaire. Cette approche a été largement appliquée à la caractérisation fonctionnelle des protéines essentielles pour la progression du cycle cellulaire, l' assemblage du fuseau mitotique, broche pôle homéostasie et ciliogenèse pour ne citer que quelques - uns et a aidé à la compréhension de la façon dont misregulation de ces protéines peut conduire à des maladies humaines 15, 16,19,20. Par exemple, notre groupe a récemment utilisé ce système pour définir la fonction et la régulation de la kinésine STARD9 mitotique (une cible de cancer du candidat) dans l' assemblage de broche 15,21, pour définir unnouveau lien moléculaire entre la chaîne Tctex1d2 dynein de lumière et courts syndromes polydactylie de nervure (SRPS) 19, et de définir une nouvelle liaison moléculaire pour comprendre comment la mutation du ubiquitine ligase Mid2 peut conduire à une déficience intellectuelle liée à l' X 16. D' autres laboratoires ont également appliqué cette méthode avec succès, y compris celui qui a déterminé que Tctn1, un régulateur de souris signalisation Hedgehog, est une partie d'un complexe protéique ciliopathie associé à ce que la composition de la membrane ciliaire régulée et ciliogenèse d'une manière tissu-dépendante 22,23. Par conséquent, ce protocole peut être largement appliqué à la dissection d'une voie cellulaire.

Une étape cruciale dans ce protocole est la sélection des lignées cellulaires stables LAP-marqués qui sont résistantes à l'hygromycine. Des précautions particulières doivent être prises pour veiller à ce que toutes les cellules de la plaque de commande sont morts avant de sélectionner des foyers dans la plaque expérimentale pour l'amplification. Hygromycine peut également être Added pendant la culture cellulaire de routine de lignées cellulaires stables LAP-tagged pour assurer en outre que toutes les cellules conservent le gène LAP-marqué d'intérêt sur le site FRT. Nous avertissons que toutes les protéines non LAP marqués seront fonctionnels et qu'il est important d'avoir des essais en place qui peuvent être utilisés pour tester la fonction des protéines. Des exemples de tests utilisés pour tester la fonction des protéines comprennent le sauvetage de phénotypes induits par siRNA et des tests d'activité in vitro. Pour faire face à d'éventuels problèmes avec l'ajout d'un grand LAP-tag, nous avons déjà généré des vecteurs TAP-tag compatibles avec ce système qui contiennent des petites étiquettes, comme FLAG, qui sont moins susceptibles d'inhiber la fonction et la localisation de la protéine d'intérêt 4. En outre, des vecteurs LAP-tagging existent pour générer des protéines LAP-tagged C-terminal ou de protéines TAP marqués C-terminaux qui sont compatibles avec ce système, qui peut être utilisé dans les cas où un / TAP tag LAP est pas tolérée au N -terminale d'une protéine. En outre, econcentrations de sel e et détergentes des tampons de purification (LAPX N) peuvent être modifiés pour augmenter ou diminuer la sévérité de purification si aucun ou trop nombreuses interactions sont observées. De même, le tandem procédure de purification d'affinité est plus rigoureuse que seule des procédures de purification et interacteurs faibles peuvent être perdues, donc un schéma de purification unique peut être utilisée lorsque peu ou pas interacteurs sont identifiés.

Il est important de noter que d' autres approches épitope GFP de marquage existent qui permettent la protéine GFP à grande échelle de marquage pour la localisation des protéines et de purification des études 24,25. Ceux - ci comprennent l'approche BAC TransgenOmics qui utilise les chromosomes bactériens artificiels pour exprimer des gènes GFP-tagged d'intérêt à partir de leur environnement natif qui contient tous les éléments de régulation, qui imite l'expression du gène endogène 24. Plus récemment, cas9 / ARN simple guidée (ARN sg) complexes de ribonucléoprotéines (RNP) ont été utilisés pour mettre fin àtag ogenously gènes d'intérêt avec un système split-GFP qui permet l'expression des gènes GFP-marqués de leur locus génomique endogène 25. Bien que ces deux approches permettent l'expression des protéines marquées dans des conditions endogènes, par rapport au protocole LAP-tagging décrit ici, ils ne permettent pas d'expression inductible et accordable des gènes marqués d'intérêt. En outre, ils doivent encore être appliquées à épitope tandem de marquage pour les TAP. Il est également important de noter que d'autres systèmes de marquage peuvent également être modifiés pour devenir compatible avec le système décrit ici pour produire des lignées cellulaires stables inductibles marquage épitopique. Par exemple, l' identification de la biotine proximité dépendant (BioID) a suscité une attention considérable en raison de sa capacité à définir des relations spatiales et temporelles entre les protéines interagissant 26. Cette technique exploite des protéines de fusion à une souche promiscuité de l'Escherichia coli biotine ligase BirA, qui biotinylers toute protéine dans un rayon ~ 10 nm de l'enzyme. Les protéines biotinylées sont ensuite purifiés par affinité en utilisant biotine-capture par affinité et analysée pour la composition par spectrométrie de masse. BirA sera biotinyler une protéine quelconque à proximité, même transitoirement, ce qui le rend particulièrement adapté à la détection de partenaires d' interaction les plus faibles au sein d' un complexe 27. En outre, le schéma de purification ne nécessite pas que les interactions protéine-protéine endogènes restent intacts et peuvent être effectuées dans des conditions de dénaturation, réduisant ainsi le taux de faux positifs. Au sein de notre protocole actuel, la substitution du vecteur pGLAP1 par un vecteur BirA marquage peut transformer ce système à partir de l'identification des interactions protéine-protéine sur la base de l'affinité pour les détecter sur la base de la proximité. Un tel système serait très avantageux pour la détection des interactions protéiques transitoires, comme cela est le cas, entre les multiples interactions enzyme-substrat et pour cartographier l'inté spatiotemporelle protéine-protéineractions au sein des structures définies comme cela a été effectué pour le centrosome et cilia 26,28.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation NSF-MCB1243645 (JZT), toutes les opinions, constatations et conclusions ou recommandations exprimées dans ce matériel sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flp-In T-REx Core KitInvitrogenK6500-01Kit pour la génération de lignées cellulaires contenant un site FRT et une expression de TrtR
PETG, 5xNunc, Inc.  ;73520-734Flacon roulant pour cellules de culture
PETG, 2.5xNunc, Inc.  ;73520-420Flacon roulant pour cellules en croissance
Empileurs de cellulesCorning CellSTACK3271Empileur de cellules pour cellules en croissance
500 ml tubes à centrifuger coniquesCorning  ;431123Tubes pour la récolte de cellules
Anticorps anti-GFPInvitrogenA11122Anticorps anti-GFP pour lapin
Perles de protéine A AffiprepBiorad156-0006Utilisé comme matrice pour la conjugaison d’anticorps anti-GFP
Diméthylpimelimidate (DMP)ThermoFisher Scientific21667Utilisé pour conjuguer des anticorps anti-GFP avec des billes de protéine A
Tubes TLA100.3Beckman349622Tubes pour la centrifugation des lysats de protéines pendant l’étape de clarification
TEV protéaseInvitrogen12575-015Utilisé pour le clivage de l’étiquette GFP des protéines N-terminales marquées LAP
Précession ProtéaseGE Healthcare27-0843-01Utilisé pour le clivage de l’étiquette GFP des protéines C-terminales marquées LAP
Protéine S agaroseNovagen69704Utilisé comme matrice de seconde affinité lors de la purification de complexes protéiques marqués LAP
Kit d’extraction de gel d’ADN QIAquickQiagen28704/28706Pour la purification de produits PCR à partir d’un gel d’agarose
BP clonase IIInvitrogen11789020Utilisé pour le clonage de produits de PCR ORF dans le vecteur navette pDONR221
LR clonase IIInvitrogen11791020Utilisé pour cloner l’ORF du gène d’intérêt dans le vecteur de marquage LAP pGLAP1
ccdB Survival 2 T1R E. coliInvitrogenA10460Utilisé pour la propagation des vecteurs navettes et des vecteurs vides pGLAP Fugene
6PromegaE2691Réactif de transfection pour la transfection de vecteurs dans des cellules humaines
TetracyclineInvitrogenQ100-19Médicament pour induire l’expression de protéines inductibles Dox/Tet  ;
DoxycyclineClontech631311Médicament pour induire l’expression de protéines inductibles Dox/Tet.
Hygromycine BInvitrogen10687010Médicament pour la sélection d’intégrants stables marqués LAP
KanamycinCorning61-176-RGMédicament pour la sélection de colonies bactériennes résistantes à la kanamycine
AmpicillineFisherBP1760-5Médicament pour la sélection de colonies bactériennes résistantes à l’ampicilline
4-20 % Tris Glycine SDS-PAGE gelsBiorad4561094Utilisé pour la séparation des échantillons de protéines et des éluats finaux de purification par marquage LAP
Kit Silver Stain Plus Biorad1610449Utilisé pour la coloration à l’argent des éluats des pufications marquées LAP et des échantillons collectés tout au long du processus de purification
Coloration au bleu CoomassieInvitrogenLC6060Utilisé pour la coloration des gels SDS-PAGE afin de visualiser les purifications marquées LAP et de découper les bandes de protéines, compatible avec la spectrométrie de masse
Vecteur navette pDONR221Invitrogen12536017Vecteur navette pour cloner les ORF des gènes d’intérêt
Vecteur exprimant la flippase pOG44InvitrogenV600520Vecteur exprimant la Flippase recombinase pour l’intégration de gènes marqués LAP dans le génome du site FRT contenant des lignées cellulaires
Platinum Taq DNA PolyméraseThermoFisher Scientific10966018Utilisé pour l’amplification par PCR des ORF des gènes d’intérêt
4x Laemmli Tampon d’échantillonBiorad1610747pour éluer des complexes protéiques purifiés marqués LAP à partir de la matrice de billes
Bouillon Luria (LB)FisherBP9723-2Utilisé pour la culture de bactéries DH5&alpha ;
Kit miniprep d’ADNPromegaA1222Utilisé pour la fabrication de minipreps de plasmides d’ADN
DMEM/F12milieu HycloneSH30023.01Pour la culture de cellules humaines Hek293
FBS manquant de TetAltanta BiologicalsS10350Utilisé pour la fabrication de milieux -Tet DMEM/F12 pour la génération et la croissance de lignées cellulaires stables inductibles marquées LAP
TrypsinHycloneSH30042.01Pour lever les foyers cellulaires Hek293 des plaques
Comprimés inhibiteurs de protéaseRoche11836170001Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole, sans EDTA
10 % nonyl phénoxypolyéthoxyléthanol  ;Roche11332473001Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole
PBSCorning21-040-CMUtilisé pour la fabrication de tampons de protocole
Tween-20FisherBP337-500Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole
Borate de sodiumFisherS249-500Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole
Boric AcidFisherA78-500Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole
ÉthanolamineCalbiochem34115Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole
NaClFisherP217-3Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole
KClFisherBP358-10Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole
Dithiothreitol (DTT)FisherBP172-25Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole
MgCl2FisherM33-500Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole
Tris baseFisherBP152-5Utilisé pour la fabrication de tampons de protocole

Références

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