Modifié MicroSecure Vitrification: Une très procédure Cryoconservation sûre et efficace, simple et blastocystes humains

Summary

MicroSecure Vitrification a été développé en tant que système de dispositif de vitrification fermé aseptique non commercial, conforme aux bonnes pratiques de fabrication et de manipulation des tissus de la FDA. En raison du retrait des pailles d’embryons bouchés hydrophobes de l’industrie, la procédure de vitrification a été modifiée pour inclure un joint intérieur avant le bouchon intérieur en coton standard.

Abstract

Embryon vitrification clinique a évolué avec le développement de dispositifs de vitrification uniques dans le 21 ^ème siècle et avec l'idée fausse que le refroidissement ultra-rapide dans un système «ouvert» (c. -à- directe LN ₂ contacts) était une nécessité d'optimiser le succès de vitrification. Le dogme entourant l'importance des taux de refroidissement a conduit à des pratiques dangereuses soumises à des variations techniques et à la création de dispositifs de vitrification qui négligées importants facteurs de contrôle qualité (par exemple, la facilité d'utilisation, la répétabilité, la fiabilité, la sécurité de l' étiquetage, de sécurité et de stockage). Comprendre les défauts de contrôle de qualité des autres appareils autorisés pour le développement d'une méthode uS-VTF sûr, sécuritaire, reproductible et fiable visant à minimiser la variation intra- et inter-technicien. Tout aussi important, il combine la disponibilité de deux dispositifs conformes FDA existants: 1) un ionomère de paille d'embryons de résine 0,3 ml avec intériorisé, deux couleurs, trifouiller-pétiquetage sur le toit avec répétable potentiel de joint de soudure; et 2) raccourcie, couramment utilisé, 300 um ID flexipettes stériles pour charger directement l'embryon (s) afin de créer un dispositif de vitrification global très efficace. Comme les autres aseptique, les systèmes fermés de vitrification (par exemple, de haute sécurité vitrification (HSV), Rapid-i, et VitriSafe) effectivement utilisés en médecine reproductive, microSecure vitrification (pS-VTF) a prouvé qu'il peut atteindre la survie et la grossesse haute post-réchauffement résultats avec son attention à la simplicité, et la variation technique réduite. Bien que la paille de l'embryon 0,3 ml contenant un bouchon hydrophobe interne a été remplacé dans le commerce avec une paille de sperme norme possédant le coton-polyvinylpyrrolidone (PVP) bouchons, il a maintenu sa composition de résine ionomère pour assurer la soudure d'étanchéité. Cependant, les bouchons de coton peuvent évacuer le contenu fluide embryon des flexipettes lors d'un contact. Une méthode uS-VTF modifié a été adapté pour inclure une soudure interne supplémentairesceller avant le bouchon sur le côté dispositif de chargement. L'étape technique ajoutée à la procédure uS-VTF n'a pas affecté son application réussie, les taux de survie aussi élevé (> 95%) et les taux de grossesse se poursuivre aujourd'hui.

Introduction

La vitrification est la technologie assistée le plus d' impact unique de la reproduction dans l'industrie la fécondation in vitro (FIV) depuis le développement de l' injection intracytoplasmique de spermatozoïdes. Aujourd'hui, les blastocystes sont cryoconservés sans la perte de la viabilité des embryons précédemment associés aux méthodes classiques de congélation lente ^1. Avec embryon de survie post-réchauffement fiable, l'industrie de l'infertilité se transforme en l'utilisation préférée de cryoconservés cycles de transfert d'embryons, qui donnent des résultats de grossesse similaires ou plus élevés que le transfert traditionnel d'embryons frais. En association avec blastocyste biopsie et le dépistage génétique préimplantatoire (PGS), la vitrification est devenu un outil clinique essentiel pour optimiser les résultats de naissances vivantes en bonne santé via euploïde transfert d' un seul embryon ^{2, 3.}

Murine embryon vitrification a été développé au milieu des années 1980 ^{4, 5} et adapté à l' agriculture animale en 1990 , ^6. Partant du principe que les solutions de vitrification forment un état glasseous métastable, sans endommager la formation de cristaux de glace, il a prouvé à préserver plus efficacement l'intégrité cellulaire complète des embryons. Fait intéressant, l'acceptation prometteuse de vitrification en embryologie humaine n'a pas commencé à être réalisé jusqu'à ce que le 21 ^ème siècle. Les premières publications visant à promouvoir l'utilisation de vitrification a coïncidé avec le développement de dispositifs uniques «ouverts» du système ^{7, 8, 9.} Cependant, l'adoption de vitrification dans la pratique clinique a été lente, comme il est venu à un moment où l'amélioration de la lente blastocyste congélation ont également été produisent. Le succès de congélation conventionnelle lente taux, en plus de vitrification, ont été alignées avec des améliorations dans les systèmes de culture d'embryons, ainsi qu'avec l'incorporer l'ion d'approches blastocoele-effondrement, qui a amélioré à la fois la survie globale des trophectoderme et, par la suite, l' implantation ^10.

Dans la dernière décennie, la technologie de vitrification a rapidement supplanté les pratiques de congélation classiques. Dans une large mesure, cela était dû à la mise au point de dispositifs de vitrification spécialisés. Certains de ces appareils ont handicapé la sécurité, l' efficience et l' efficacité de la vitrification clinique en introduisant des défauts de conception inhérents aux dispositifs utilisés dans l'industrie de la FIV ^11. En effet, les nuances des différents dispositifs introduisent une variation technique significative entre les programmes, communément appelés «signatures techniques» ^12. Ainsi, des revues scientifiques, comme le Journal of Experiments Visualized (JoVE), peuvent servir comme une ressource précieuse pour démontrer les détails techniques, ce qui contribuera à réduire la variation des résultats. Un autre problème récurrent est que l'artertains embryologistes continuent d'être mal informé, aujourd'hui encore, sur la base de revendications que le "refroidissement ultra-rapide des embryons ou des ovocytes dans un« système de vitrification ouvert »(c. -à- contact embryon direct avec l' azote liquide _(LN2)) est une condition préalable à l' optimisation les taux de réussite. " De toute évidence, cette croyance est inexacte, basée sur le succès éprouvé des aseptique systèmes ^{13, 14, 15} fermé.

Sur la base des principes cryobiologiques de vitrification, l'efficacité de vitrification est plus fortement dépendant des taux de réchauffement que sur les taux ^{16, 17, 18} de refroidissement. D'une manière générale, indépendamment du dispositif de vitrification utilisé, le taux de chauffage doit être supérieure à la vitesse de refroidissement afin d'assurer des taux de survie élevés. Les taux élevés de réchauffement minimisent la possibilité pour toute croissance de la glace (ie, le recrystallization d'impuretés nucléées dans cryo-solutions) pendant la phase de réchauffement de la dévitrification. Certes, la stabilité de la solution de vitrification (ie, le type et la concentration des agents cryoprotecteurs utilisés) peut avoir un effet de confusion, mais cela est abordé dans une publication distincte ^11. Compte tenu des questions de taux-réchauffement refroidissement, MicroSecure vitrification (pS-VTF) a été développé en 2008 comme une méthode peu coûteuse, non-commerciale, conformes à la FDA qui optimise les aspects de contrôle de qualité de vitrification. Il était unique en ce qu'elle a offert inviolable, intériorisée, double étiquetage de couleur. En outre, en chargeant et en stockant les embryons directement dans le flexipette stérile utilisé pour le pipetage ( à savoir, sans pipetage sur une surface de dispositif secondaire) et en utilisant des pailles ionomère de résine qui scellent complètement soudé au moyen d' un scellement automatique, la variation technique a été effectivement éliminés.

Lors de l'évaluation de la completeness de dispositifs de vitrification pour une utilisation potentielle, il existe plusieurs facteurs de contrôle de qualité qui devraient être prises en compte, y compris: 1) Étiquetage étiquettes -Can potentiels être solidement respectées? Sont-ils inviolables? Ils offrent deux couleurs potentiel d'identification? Est - il besoin d' une étiquette secondaire, et peut l'étiquette facilement être enlevé à des fins de tenue de dossiers (c. -à- patients vérification) post-réchauffement? 2) la facilité technique des embryons -Peut être facilement chargés dans / sur le dispositif en temps opportun et simplement identifiés et suivis post-réchauffement? 3) simplicité procédurale / répétabilité -Est la méthode de vitrification offre la simplicité et la fiabilité qui permet facilement de répétabilité, ce qui minimise la variation entre les techniciens (internes) et les programmes (externes)? 4) la capacité de stockage LN ₂ -Pouvez les dispositifs facilement et en toute sécurité manipulé et identifié? Leur storage espace potentiel efficace? Est-ce que la sécurité de l'offre de l'appareil et la sécurité contre les dommages physiques ou contaminants possibles comme un système fermé aseptique? 5) Le potentiel de rétablissement / survivabilité -Est la conception sujettes à des problèmes potentiels dans la récupération garantie d'embryons de l' appareil, et seront - ils vitrifier de manière fiable et maintenir post-réchauffement complet de l' intégrité cellulaire? Cette dernière préoccupation de qualité spécifique, le taux de récupération, a effectivement été étonnamment minimisé dans les rapports publiés; cela se fait en se cachant généralement le résultat défavorable (c. -à- embryon perdu ou œuf) dans typiquement de bons taux de survie. Tout dispositif sujettes à récupération incompatibles (<99%) est gravement viciée et constitue une responsabilité procédurale.

Notre aseptique, fermée méthode uS-VTF a été stratégiquement conçu pour tenir compte de chaque mesure de contrôle de qualité. Cependant, après 5 ans de succès clinique supérieure et de validation ^14, la procédure avait to être modifié. Les pailles originales d'embryons de 0,3 mL (possédant un bouchon hydrophobe) ont été retirés de l'industrie de la FIV et remplacées par une paille de 0,3 ml de sperme possédant un bouchon de coton / PVP standard (c. -à- réétiqueté comme semence / embryon paille). Ce document décrit les étapes de la procédure et des stratégies spécifiques nécessaires pour mettre en œuvre uS-VTF en toute sécurité, tout simplement, et efficacement. En outre, nous mettons en évidence la modification (s) nécessaire pour tenir compte de manière fiable pour les limitations d'approvisionnement, jusqu'à ce que un récipient idéal de remplacement de paille est réintroduit dans le laboratoire clinique.

Protocol

Le développement de la procédure uS-VTF a été réalisée dans le cadre d'une étude approuvée Institutional Review Board (IRB) en 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) sur ovocyte humain et la cryoconservation des embryons. La procédure a depuis été régulièrement appliquée au traitement clinique des patients infertiles qui ont signé des formulaires de consentement éclairé.

1. Considérations de contrôle qualité

1. Utilisez des couleurs différentes (par exemple, des stylos, des étiquettes, ou identification (ID) tiges ou bouchons) pour distinguer les patients si cryoconservation plus d'un groupe d'embryons dans une journée.
2. Utilisez des plats différents et pipettes pour chaque patient. Réduire au minimum le volume de milieu transféré lors du déplacement des blastocystes d'une solution à l'autre.
3. Cryopreserve un blastocyste par paille ou périphérique. Maintenir une technique aseptique / stérile et respecter toutes les consignes de sécurité.
4. Confirmer le formulaire de recommandation des médecins et signé le consentement du patient avant initiating les procédures. Vérifiez la disposition de l'embryon (s) des patients dans l'inventaire.
5. Utilisez un "dégagement de responsabilité et de consentement pour les transports» si les blastocystes doivent être transférés dans un autre établissement. Veiller à ce que toutes les signatures sont témoins sur place ou notariée.
6. Confirmer les mesures appropriées de contrôle de qualité pour le milieu et les suppléments de protéines, selon le cas, y compris les essais biologiques, les déterminations d'endotoxines et expiration / lot vérification du numéro et le suivi.
7. Établir les limites critiques (c. -à de faibles niveaux de préoccupation) pour la surveillance clinique cryoconservation des résultats et de l' évaluation, tels que les taux de récupération: <95%, les taux de survie: <80%, et les taux de grossesses cliniques utilisant blastocystes simple euploïde: <50%.

2. Procédure Cryoconservation

1. Préparation
   1. Remplissez les documents appropriés, y compris les données entrantes dans les feuilles de calcul et la base de données de cryoconservation et journal d'inventaire(S).
   2. Préparer des solutions de cryoconservation fraîches ou utiliser une source commerciale (en respectant les recommandations les conditions de stockage et la durée de vie du fabricant).
   3. préparation de paille.
      1. Ouvrez le côté d'étiquetage des paquets stériles individualisés. Détacher la buse de remplissage se trouve sur le traditionnel 0,3 ml embryon paille en la saisissant contre l'emballage et partiellement en soulevant et en tirant hors de la paille; cela va exposer l'extrémité de l'étiquette aux conditions ambiantes tandis que la paille repose aseptique à l'intérieur de l'emballage en plastique.
         1. (Modification) Pour 0,3 ml de sperme / pailles d'embryons, pousser le bouchon vers le bas de 0,5 cm. Appliquer un joint interne en face de la fiche coton-PVP grâce à l'utilisation d'une impulsion de table de base de scellement.
         2. Fixer la paille sur la surface de l'électrode en téflon, juste en face du bouchon. Enfoncer la poignée pour activer la chaleur. Relâchez la poignée lorsque la lumière rouge apparaît. Pour assurer une étanchéité complète de la soudure, de la chaleur à une température suffisamment flattens les surfaces opposées, puis retournez- le sur 180 ° et reboucher la surface opposée ¹⁹ au besoin.
   4. L' utilisation d' un cryomarker, étiqueter chaque paille / appareil et cryogoblet avec le nom du patient, un numéro d'identification unique (par exemple, SSN, date de naissance, ou le numéro d'identification du patient), et la date de congélation. Inclure aussi un numéro unique sur chaque paille / appareil (par exemple, 1, 2, 3, etc.).
      1. Fixer l'étiquette (de préférence de couleur) sur un ID tige de couleur pondérée à insérer et scellés dans un embryon de paille de 0,3 mL. Retour de la paille dans son emballage individuel stérile jusqu'à utilisation.
         Remarque: Si seulement 30 mm de tiges d'identification de couleur pondérée sont disponibles, alors l'insertion supplémentaire de deux roulements à billes est nécessaire, au voisinage de chaque côté de la tige d'identification.
   5. Identifier chaque canne avec un numéro d'identification inscrit unique. Identifier un LN ₂ stockage numéro du réservoir et un numéro de cartouche où l'échantillon (s) de chaque patient peut être stà long terme ORed.
   6. Préparer des plats cryo frais (100 mm) par marquage de la surface inférieure avec le nom du patient, la solution ID, et de l' embryon / gouttelette tenant ID (figure 1A). Plus précisément, mis en place 4 rangées de gouttelettes: isotoniques Hepes tamponné milieu (en haut), V1 (solution d'équilibration (ES)), V2 (solution intermédiaire (IS)), V3 (solution de vitrification (VS), en bas). Ecrire l'ID de l'embryon sur le côté supérieur droit avec des colonnes marquées.
      Remarque: Une série de 25 à 50 uL de lavage gouttelettes (n = 3) est utilisé pour faire en sorte que chacun finale de 10 à 15 pi de maintien gouttelette / type de solution ( par exemple, V1, V2 ou V3) est pur et non dilué. En utilisant cette approche, jusqu'à cinq embryons individuels peut par vitrifié en utilisant un seul plat. Gardez chaque plat couvert lorsqu'ils ne sont pas utilisés afin d'éviter toute température ambiante évaporation / déshydratation des gouttelettes.
   7. Préparer flexipettes stériles en coupant 3 cm de leur extrémité de base (appelés «conseils de VTF»). Insérez-les sur personnepipettes (fixé à 3 pi) et fixer les embouts de pipette-VTF verticale dans un rack tube de styromousse (figure 1B).
2. Sélection d'embryons
   1. Confirmer le patient / identification de l'échantillon.
   2. En utilisant un microscope inversé (200 - 400X), le grade et classer les blastocystes selon le système de notation Gardner ^20, en utilisant une classification numérique de 1 à 6 pour le début de blastocystes éclos, respectivement, et un A, B ou C grade attribué à la masse cellulaire interne (ICM) et trophectoderme (TE).
      Remarque: En préparation de blastocyste biopsie et analyse euploidy, la zone pellucide est pré-couvé par ablation laser au jour 3 de promouvoir l'hernies précoce de la TE et nécessite une classification de classement modifié ² ainsi. En bref, 3 e année pleine blastocystes exposition jusqu'à 10% TE hernies, 4 e année étendu blastocystes sont 10-50% éclos, et 5 e année blastocystes à couver ont> 50% TE extrusion (figure 2A-C).
      Note: Notre préférence est de cryoconservation de grade 3 ou blastocystes de qualité plus élevées ≥BB le jour 5 ou 6. Cependant, blastocystes vitrifiés de qualité inférieure (C) et d' embryons post-compactage à des stades antérieurs (y compris morula tard pour 2 blastocystes Grade 1 ou ) peut certainement survivre à réchauffer complètement intact et produire des embryons viables capables d'atteindre les naissances vivantes.
   3. Réduire le blastocèle de chaque blastocyste avant le début du processus de cryodilution par micropuncturing une jonction trophectoderme ou en effectuant une ablation par impulsion laser d'une cellule trophectodermal ²¹ si l'on utilise des solutions de vitrification à faible molarité (<6,5 M , soit 40% v / v).
      Remarque: La nécessité de s'effondrer les blastocystes ne dépend pas de l' appareil. Dans notre propre développement précoce de uS-VTF (2008), nous avons d'abord utilisé l'éthylène glycol (EG) / solutions de DMSO avec succès ovocytes (1 sur 1 grossesse à terme), mais un sous-optimal (<80%)survie / développement de blastocystes de souris ¹⁶ a été vécue par d' autres ^21. Depuis des solutions à base de glycérol-molaires élevées (dépassant 7,9 M) sont utilisés dans notre système de VTF actuel (depuis 2009), blastocoele effondrement physique est inutile. Toutefois, l'éclosion sélective de blastocystes éclos est conseillé en général.
3. Cryodilution et Blastocyste Loading
   1. Retirer la boîte de culture du patient de l'incubateur et de confirmer l' identification du patient / échantillon avec une autre personne (c. -à- témoin par une source secondaire) avant de retirer l'embryon (s) à vitrifier.
   2. Confirmer le développement de blastocyste par étape 2.2.2, mettre à jour la fiche de données de cryo, et, sous stéréomicroscopie, pipette blastocyste (s) à partir de la boîte de culture dans une gouttelette de maintien isotonique du plat de cryo.
   3. Déplacez chaque blastocyste en gouttelettes de maintien individuelles en utilisant l'flexipette de vitrification (ie, la pointe de VTF).
   4. Déplacez chaqueblastocyste dans V1 (ES) solution.
      1. Préremplir la flexipette avec une solution de V1 (3 pi) et placer la moitié du contenu sur l'embryon.
      2. Aspirer l'embryon et de passer à la première des trois V1 gouttelettes de lavage (visées à l'étape 2.1.6), pipette l'embryon 2 - 3 fois autour du périmètre, et effacer le contenu de la pipette dans la gouttelette (en évitant la formation de bulles) ou à l'extérieur sur la surface plat.
   5. Remplissez la pointe de VTF avec la prochaine chute de lavage de V1 et répéter l'aspiration de l'embryon (s). Répétez une troisième fois et déplacer le blastocyste (s) à une baisse V1 de maintien individuel. Les étapes de dilution / lavage devrait prendre de 30 à 45 s. Pré-charge chaque pointe VTF à la solution suivante (par exemple, V2), insérer la pipette dans un rack, et utiliser la pipette suivante (selon la configuration de l'étape 2.1.7) (figure 1B).
      Remarque: La durée totale d'exposition en sulfoxyde non diméthyle (DMSO) contenant les solutions V1 et V2 est 5 min à chaque fois , le pipetage de individeux blastocystes doivent être décalés de manière uniforme dans cet intervalle, étant donné que l'étape de V3 finale, il faudra au moins 1 min par blastocyste à effectuer. Par exemple, s'il y a 4 blastocystes dans un groupe de vitrification, des blastocystes de pipette # 1-2-3-4 à 75 s d'intervalle.
      Remarque: Le Cryo Enterprises (ICE) protocole de dilution innovant décrit ci - dessus est nettement différente de la plupart des autres procédures de vitrification commerciale, qui impliquent généralement des solutions contenant du DMSO. Ces protocoles obtenir les mêmes dilutions progressives à travers une progressive, mais moins contrôlés, la fusion de la solution de lavage (c. -à- milieu isotonique), ES et VS.
   6. Répétez les étapes 2.3.4 et 2.3.5 en utilisant V2 (IS) des solutions.
   7. Répétez les étapes en utilisant V3 solutions 2.3.4 et 2.3.5 (VS).
   8. Sur plaçant chaque blastocyste dans la V3 tenant gouttelette, décochez la solution résiduelle et des bulles de la pointe de VTF (en dehors de la goutte), puis remplissez la pointe complètement avec V3 propre autour de l'embryon. Expel environ un tiers du volume (1 pi) et la pipette blastocyste (s) et le reste du V3 complètement dans la pointe VTF.
   9. Retirer la pointe de la pipette VTF, essuyez la pointe sèche de V3 résiduelle sur la surface extérieure à l'aide d'un tampon de gaze stérile, et insérez la pointe de bout en premier dans l'extrémité ouverte de la paille pré-étiquetés. Une «pointe sèche» est essentielle pour prévenir l'adhésion possible de la paille intérieure.
   10. Inversez la paille (étiquette fin vers le bas), observer la pointe au niveau du bouchon interne ou le sceau, et sceller l'extrémité ouverte en toute sécurité avec 1 cm de l'espace aérien. De préférence, utiliser un dispositif d'étanchéité automatique (par exemple, Syms I) pour éliminer la variation technique.
       Note: L'avantage d'utiliser des pailles qui sont composées d'une matière plastique de résine ionomère (par exemple, HSV ou uS-VTF) est que l' utilisation de toute chaleur correctement actionné dispositif d' étanchéité crée une étanchéité fiable "de soudure", comme indiqué à l' étape 2.1.3.1.
   11. Une fois scellé, plonger la paille fermée directement dans LN ₂ dans un stainlacier ess Dewar de ballon et placer la paille (s) dans le bol ouvert attaché à la canne du patient pour le stockage.
       Note: En raison des pailles uS-VTF utilisent 40 mm tiges d'identification pondérées pour compenser la flottabilité de la paille rempli d'air, l'utilisation de gobelets inversées ou cryovials vides pour couvrir l'échantillon (s) ne soit pas nécessaire , sauf si le transport est impliqué.
4. Réchauffement et Cryo-solution Elution / Dilution
   1. Confirmer le formulaire des médecins de recommandation concernant vitrifiés embryon date de transfert, le temps prévu, et les détails de l' embryon (nombre de dégeler / transfert, le nombre d'embryons spécifique si PGS testé, etc.).
   2. Préparer des solutions de réchauffement frais (1,0 M de saccharose solution mère) et / ou utiliser une source commerciale (recommandée 1 semaine 1 mois de la durée de vie, une fois utilisé, 4 ° C stockage).
      1. Aliquoter 17,1 g de saccharose dans 50 ml des flacons stériles lors de l' ouverture initiale (par exemple, la source d'approvisionnement hebdomadaire) en raison des risques d'accumulation d'endotoxine dans le saccharose granules lors d'une exposition répétée ambiante.
      2. Mélanger le saccharose granulaire pré-pesé dans la solution (1,0 M = 3,42 g / 10 ml de tampon HEPES fluide tubaire humain [H HTF]) et chauffer la solution jusqu'à 37 ° C pour augmenter la solubilité des granulés. À plusieurs reprises inverser le récipient pour aider à accélérer et terminer le mixage final.
         Note: Filtration (filtre de 0,22 um) effectuée en utilisant des unités de filtration de pression positifs est recommandé pour les solutions visqueuses (> 0,5 M de saccharose) ou des volumes élevés. pompes à pression à la main sont suffisants et peu coûteux, alors une pompe électrique est bruyant, provoque des vibrations, et est tout simplement pas nécessaire.
   3. Tube chaud (37 ° C), une 10 ml chacune de solution 1,0 M de saccharose et le milieu H HTF par patient pour uS-VTF utilisation du bain de chauffage.
   4. Préparer des plats de décongélation frais (plaque de 6 puits) par marquage de la surface de couverture avec le nom du patient et les ID de solution.
      Remarque: Dans ce cas, nous avons utilisé: (1) Lavage de T1 (200 μ; L sans couche d'huile (2), T1 (100 pi) avec 1 ml d'huile (3), T2 (100 ul) avec de l'huile (4) T3 (100 ul) avec de l'huile, (5) T4 (100 ul) avec de l'huile, et (6) support T5 / 200 ul de tampon HEPES isotoniques avec 10% de sérum albumine humaine (SAH) ou 20% de substitut de sérum sans une superposition d'huile. Appliquer une sucrose universelle solution step-down protocole T1 = 1,0 M, T2 = 0,5 M, T3 = 0,25 M, et T4 = 0,125 M-si l'ICE ou d'une autre source commerciale ne sont pas disponibles, comme l'a proposé pour les embryons lente congelés ²² . En outre, notez que le lavage de T1 initiale et les équilibrages T5 finales peuvent être effectuées en 30 mm des boîtes de Pétri et le plat 4 puits utilisés pour les étapes 2-5 ci-dessus, impliquant une couche d'huile.
   5. Décongeler l'embryon (s) de un seul patient à la fois.
      1. Consultez le formulaire de recommandation des médecins et confirmer le cycle avant le réchauffement du nombre (ie, 1 ou 2 blastocystes) indiquée; évaluer la survie / viabilité probable en observant les changements osmotiques (ie, shrinkage et la réhydratation) et des membranes intactes, et, en cas de doute, contacter le médecin et / ou patient avant réchauffement autre blastocyste.
   6. Confirmer l' identification du patient / échantillon avec un collègue de travail (c. -à- témoin par une source secondaire).
   7. Placez la canne patient dans un flacon Dewar rempli de LN ₂ et isoler identifier la paille pour être réchauffé.
   8. Apportez le plat de dilution de 6 puits au centre de la scène de stéréomicroscope. Placer un plat de 60 mm de Pétri d'un côté (ie, en fonction de la main gauche ou droit de préférence à la main du technicien), ajouter le saccharose réchauffé (1,0 M) et des solutions H-FASS pour créer un réchauffement de 0,5 M de saccharose salle de bain (non couvert).
      Remarque: des conseils VTF ne sont réchauffées de 0,5 M solutions de saccharose comme un QC sauvegarde, pour assurer le maintien de la viabilité des embryons dans les rares cas où un embryon est expulsé à la suite du réchauffement rapide ^22.
   9. Tenir le sceau de paille supérieure au dessus du niveau de liquidepour confirmer l'identité, puis saisir et fixer la paille dessous du bouchon interne à l' aide de ciseaux de Mayo (la pointe VTF devrait encore être immergé dans LN _2).
      1. appuyez fermement les ciseaux sur le flacon Dewar (quelques fois) pour enlever la pointe de VTF de la paroi latérale de paille intérieure comme QC précaution; si la pointe VTF est adhérente, le taraudage assure que la base de la pointe tombe à l'extrémité scellée opposée à l'extrémité marquée, fournissant ainsi un espace d'air à proximité de l'extrémité de la fiche.
   10. Soulevez la paille avec les ciseaux dans l'air ambiant dans une position horizontale (à côté ou au-dessous de la surface de la stéréoscopie) et saisir l'extrémité non marquée (étiquette sur le côté droit). Couper la paille au bouchon intérieur ou sceller et le soulever au-dessus du plat de bain de réchauffement. Versez la pointe de VTF dans le bain de saccharose chaud à un angle de 60 ° jusqu'à ce qu'il soit complètement extrudée et a été rapidement réchauffé (> 6000 ° C / min); la base du flexipette reposera au-dessus de l'assiette latérale.
       1. Laisser le ti VTFp en chute libre dans le bain. Tapoter doucement la surface de paille supérieure si la pointe ne sort pas immédiatement. Si elle apparaît seulement en partie, d'aider à l'extrusion en saisissant l'arbre du flexipette avec des ciseaux ou d'une pince fine.
   11. Après 5 - 10 s, saisir la base de la pipette et l'insérer dans un dispositif de pipetage jetable; un trou dans l'ampoule agit pour libérer la pression lors de l'insertion. Couvrez le trou de l'ampoule avec un index et presser doucement l'ampoule pour libérer le blastocyste vitrifié dans le lavage de T1 (# 1) tout en regardant par stéréomicroscopie. Une fois confirmé, désactivez la V3 (VS) solution et bulles résiduelle par pression positive, évacuer le contenu dans le centre, défausse utilisé bien. Démarrer une minuterie 5 min.
       Remarque: Toutes les étapes de dilution de saccharose sont réalisées à température ambiante (21 ± 2 ° C).
   12. Retirer la pointe VTF et placez-le sur une pipette. Passez en déplaçant l'embryon dans T1 # 2 dans l'huile pour le temps restant (environ 3 - 4 min).
       1. Si un second blastocyste est nécessaire pour le transfert, réchauffer immédiatement une seconde paille et pointe VTF (à répéter les étapes 2.4.9 - 2.4.11) du patient avant d'initier l'étape 2.4.12. Déplacer les deux blastocystes ensemble pour une élution minimum T1 (1,0 M de saccharose) d'au moins 3 min.
   13. Pré-remplir le flexipette avec la solution suivante, puis déplacer et diluer le blastocyste (s) en T2, T3 et T4 à intervalles de 3 min. Si la zone pellucide n'a pas été préalablement laser ablatée (ie, hachurée), faites - le en T4. Placer le plat sur la scène d'un microscope inversé et de l'image de l'embryon sur un écran d'ordinateur. Alignez le zona dans un cercle rouge désigné et activer 2 ou 3 impulsions d'un laser à diode ( en commençant par le bord de l'espace périvitelline et se déplaçant vers l' extérieur) pour créer une ouverture ^{2, 19.}
   14. Equilibrer les blastocystes dans les T5 (c. -à- milieu isotonique) pendant 5 minutes sur une surface chaude (37 ° C).
   15. Évaluer la survie de l'embryon initial basé sur la présence prédominante des membranes cellulaires intactes avec cytoplasms même, translucides dépourvues d'assombrissement pycnotique. Placez l'embryon (s) dans la culture pour 2 - 6 h avant le transfert d'embryon, à ce moment, le développement embryonnaire / survie devrait être ré-évaluées et documentées.
       Remarque: Si plus de 1 blastocyste viable existe au moment du transfert et le patient choisit de procéder à seulement 1 blastocyste, le blastocyste supplémentaire peut alors être correctement ré-vitrifiés (rVTF) en répétant les étapes 2.3.3 - 2.3.11. Nous avons plusieurs naissances vivantes confirmées suite à des événements de rVTF simples.
       Note: rVTF a été expérimentalement effectuée jusqu'à 5 fois sans effet significatif sur la survie / viabilité des blastocystes humains aneuploïdie vitrifiés dans une solution à base de glycérol-métastable.

Results

1,341 blastocystes vitrifiés ont été réchauffées entre 2012 à Juin 2014, et 1.341 embryons récupérés (100%), tandis que 1.316 ont survécu (98,1%). blastocystes biopsiées connu plus de 99,5% de survie. Lorsque le transfert est essentiellement unique, génétiquement testés, euploïde, embryons vitrifiés, nous avons pu atteindre certains des taux les plus élevés d'implantation et taux de naissances vivantes aux Etats - Unis, indépendamment de l' âge (figure 3) ^20, selon les statistiques nationales récentes communiquées par le Centre for Disease Control et la Société pour Assisted reproductive Technologies (tableaux 1 et 2). L' évaluation d' une population de patients bonne pronostic (moins de 35 ans) pour les cycles cryoconservés seuls (tableau 1), notre laboratoire a dépassé la moyenne nationale pour les deux taux d'implantation ( par exemple, l'efficacité d'un embryon pour établir une grossesse) et , finalement , vivent taux de natalité de plus de 30%. En outre, la première validation / vérification de nos pailles de stockage modifiés à la mi-2014 en utilisant 70 recherche consentit blastocystes aneuploïdes re-vitrifiés a donné lieu à 100% de récupération et de survie de 100%.

Figure 1. MicroSecure VTF Setup. Le plat de VTF (A) est assemblé avec 3 rangées distinctes de solutions de vitrification, qui utilisent 3 gouttes de lavage avant de les placer dans différents, des gouttelettes de maintien numérotées. En outre, des pipettes individuelles avec des conseils de VTF raccourcis (ie, flexipettes 300 um ID) sont fixés et organisés dans un rack tube de styromousse (B), qui peut être tourné pour une utilisation ordonnée. A noter qu'un ensemble de pipetage jetable de l'ampoule de la micropipette représentative est en appui sur le support de mousse de polystyrène. Arget = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. modification Blastocyste système de classement. comptes Notre système de classement blastocyste Gardner modifié pour la hernie induite des cellules TE pour faciliter blastocyste biopsie. La modification considère l'éclosion prématurée des blastocystes complètes (A: grade 3 = moins de 10% hernies) et blastocystes expansé (B: grade 4 = jusqu'à 50% hernies), tandis qu'un blastocyste éclosion (C) a plus de 50% Hernie ^16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Issues de la grossesse comparatifs. Au cours d'un intervalle cumulatif de 1,5 ans, les données de la grossesse ont été comparées pour évaluer les effets du transfert de blastocystes euploïdes vitrifiés réchauffé (n = 172 cycles / 144 transferts) par rapport aux cycles non-PGS (n = 160 cycles / 153 transferts) impliquant principalement frais transfère ^18. Pour nos fins expérimentales, ces données révèle clairement que blastocystes biopsiées vitrifiés par la procédure uS-VTF maintiennent leur viabilité. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La source de données	# Cycles	Moyenne Nombre d'embryons transférés	Implantation Tarifs (%)	Taux de natalité en direct (en%)
NB Lab *	144	1.2	74.00%	74.50%
Moyenne nationale	20423	1.7	39.60%	44.10%
* Les données ont été en moyenne sur la base des performances 2014 Orange County Fertilité, Californie du Sud Centre de fertilité et le Centre sud de la Californie pour les cliniques de médecine de la reproduction à l'aide du laboratoire de fertilité Ovation actuelle (NB Lab) qui a fondé la procédure microSecure de vitrification en 2008.

Tableau 1. 2014 CDC assistée Statistiques sur la reproduction. données transfert d'embryons congelés de la grossesse des femmes de moins de 35 ans de trois rapports cliniques médicales utilisant notre laboratoire NB par rapport aux États-Unis 2013 moyenne nationale de plus de 450 cliniques de déclaration.

Moyennes nationales SART
Clinique - État	Femmes	Femmes	Femmes	Femmes
	<35 ans	35-37 ans	38-40 ans	41-42 ans
SCCRM-CA *	63,1%	58,3%	40,6%	32,3%
CCRM-CO *	64,7%	61,5%	40,4%	32,2%
RMA-NJ *	63,2%	59,7%	34,6%	18,7%
Moyenne nationale	48,6%	38,3%	24,3%	12,3%
California Center SCCRM-Sud pour la médecine reproductive; Centre CCRM-Colorado for Reproductive Medicine; et RMA-Reproductive Médecine Associés
* Ces principales cliniques ont tous mis en œuvre principalement cycles de transfert d'embryons vitrifiés, en association avec le test génétique préimplantatoire, dans leur pratique courante des soins aux patients afin d'optimiser le succès de naissances vivantes par embryon transplanté.

Tableau 2. 2014 taux de naissances vivantes cumulatifs, tel que rapporté par la Société pour Assisted Reproductive Technologies (SART), pour la clinique SCCRM utilisant notre fertilité Lab Ovation à Newport Beach, CA, en contraste avec plusieurs autres programmes respectés, ainsi qu'avec la SART moyennes nationales.

Discussion

Aujourd'hui, il y a une forte attente d'atteindre la survie de blastocyste complète (> 95%) et la réussite d'une implantation similaire à celle d'embryons frais. Certains groupes ont suggéré que les taux de naissances vivantes de cycles de transfert d'embryons vitrifiés sont peut-être encore plus élevé que les blastocystes frais lorsque l'embryon cryoconservé intact est transplanté dans un utérus sain non hormonale stimulée. Nos données indiquent clairement que la vitrification maintient efficacement et de manière fiable la viabilité de l'embryon frais. De plus, nous avons prouvé que notre aseptique, méthode fermée, appelée MicroSecure vitrification (pS-VTF), peut obtenir un résultat optimal comparable ou supérieure aux normes commerciales (c. -à- systèmes de dispositifs ouverts) utilisés dans l'industrie de la FIV.

La variation est associée à la répétabilité et la fiabilité techniques entre les individus en utilisant une multitude de vitrification appareils / méthodes. À son tour, cela a abouti à inconsistencies entre les programmes d'application vitrification. Par conséquent, il est peu surprenant que la familiarité de l'appareil est un facteur important en ce qui concerne la compétence des laboratoires et des résultats positifs. Il est cette notion de «signature technique» ¹¹ qui explique pourquoi la répétabilité entre les programmes peut être problématique. Non seulement le développement de plus d'une douzaine de dispositifs commerciaux compliqués ce phénomène, il a créé des préoccupations de contrôle de qualité. Heureusement, les systèmes fermés de vitrification, comme uS-VTF, Rapid-I, et VitriSafe, sont maintenant révèle être tout aussi efficace pour ouvrir les systèmes de l' appareil ^{12, 13, 14.}

MicroSecure VTF est une nouvelle technique de vitrification aseptique développé avec aisance technique, la fiabilité et cryo-sécurité à l'esprit. En combinant l'utilisation de deux approuvés antérieurement, les dispositifs conformes FDA, il existe un système de vitrification non commercial wvec l'avantage d'avoir un faible coût établi, contrairement aux dispositifs spécialisés. En outre, son unique et infalsifiable système d'étiquetage à double couleur intériorisé, ainsi que de nombreux autres avantages de contrôle de qualité, ont fait uS-VTF une option globale attrayante ^11. En tant que dispositif de VTF non-commercial, cependant, son application de l'industrie répandue évolue lentement. Seule la publication continue de sa sûreté, la sécurité et l'efficacité clinique sera un gain uS-VTF croissante utilisation.

En Août 2014, face à l'incapacité d'acquérir les 0,3 ml embryon de paille d'origine fabriqué avec un non-évacuation de bouchon intérieur, hydrophobe, nous avons pu modifier de façon fiable la méthode uS-VTF. En bref, le nouveau sperme 0,3 mL / pailles d'embryons avec leurs bouchons de coton-PVP ont effectivement été adaptés. Ceci a été obtenu simplement en créant un joint interne avant la prise de coton, empêchant ainsi le contact et le liquide de mèche avec leembout ouvert VTF (ie, le flexipette contenant l'embryon ou les œufs). En outre, si les tiges d'identification de 40 mm ne sont pas accessibles, la question de flottabilité associée avec les plus légères tiges de 30 mm peut être contrebalancé en utilisant deux roulements à billes.

Ces étapes supplémentaires ont fait la technique un peu moins simple, mais très efficace. Aujourd'hui, l'économie et l'efficacité sont de plus en plus importantes préoccupations, comme blastocystes biopsiées sont généralement vitrifiés individuellement jusqu'à ce que leur statut euploidy est confirmée sur un rapport de la génétique. Blastocystes avec un statut aneuploïdie non viable confirmé obtiennent généralement jetés, avec le consentement du patient, dans quelques semaines. Ainsi, la majorité (> 50%) des dispositifs de VTF sont rejetés après un stockage à court terme, ce qui provoque un coût annuel escalade lors de l'utilisation des dispositifs commerciaux. Dans l'ensemble, uS-VTF est une procédure très efficace, fiable et reproductible pour la cryoconservation des blastocystes humains. Le supérieur Securel de conception de contrôle de qualitéétiquettes y et en toute sécurité stocke les ovocytes / embryons, tout en éliminant l'échec de la récupération et l'optimisation de la survie et la viabilité post-réchauffement, ce qui justifie l'utilisation du système comme une approche universelle de l'embryon vitrification.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Canne en aluminium	IVM	XC055
Roulements à billes, 3/32"	VXB.com	KIT15977	paille
sperme/embryon CBS, 0,3 mL	CryoBioSystems	25292	stérile individuel
Couleur, tiges d’identification, 30 mm	CryoBioSystems	019021-26	de culture pondérés
, 15 mL	Falcon	352099	Conique
Tubes de culture, 10 mL	Falcon	352057	Snap-cap
Cryosleeves	Nalgene	5016-001
Filtre, 250 mL	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 &mu ; m
Flacons, Culture tissulaire 50 mL	Falcon	353014
Flexipettes, 300 &mu ; m ID	Cuisinier Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Pince stérile, 20/paquet
Pince, Grande	pince Miltex	6-30TC
, Écharde - fine	Miltex	17-305
Gobelet	IVM	PA003
Thermosoudeuse, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V ou 220 V avec adaptateur
Média tamponné Hepes  ;	Life Global ou	LGGH-100 ; 100  ; mL, ou	stocké à 2 - 8 º ; C
	Irvine Scientific	H-HTF ; 90126 ; 100 mL	avec étiquettes AA non
essentielles, Cryo	GA International	CL-23T1	couleurs
Réservoir d’azote liquide, 40  ; L	MVE ou Taylor Warton	divers	stockages liquides  ;
LN2 ; Fiole de Dewar, 0,5 L	Hampton Research	HR4-695
Plats Custer 6 puits	Biogenics	015/020	Vaisselle en plastique par étui
Pipette Bulbe, Micro Cap	Drummond	Fisher#13681451	Trou sur l’apex de l’ampoule
Boîtes de Pétri, 35 mm	Boîtes	351006
58 mm	Nunc	150288
Boîtes de Pétri, 100 mm	Pointes	de
, ART long	Fisher Sci.	02-707-80	10 - 100 &mu ; L
Pipet Aid	Drummond ou Falcon	divers
appareils de pipetage rechargeables, décapant	Cooper Surgical	MXL3-STR
Pipettes, sérologique 1  ; mL	Falcon	357521
Pipettes, sérologique 2  ; mL	Falcon	357507
Pipettes, sérologique 5  ; mL	Falcon	357543
Pipettes, sérologique 10  ; mL	Falcon	357551
ciseaux, Stéréomicroscope chirurgical Mayo	Miltex	5-SC-16
	Nikon, Olympus, Leica	divers
tampons de gaze stériles, 4 » x 4"	Kendall Healthcare	6939
Sérum synthétique	Life Global, ou	LGPS-20 ; 20 mL, ou	stocké à 2 - 8 º ; C
	Irvine Scientific	SS-99193 ; 12 x 10 mL	acheter lot à faible teneur en endotoxines
Sucrose	Sigma Chemical Co.	#S9378	Aliquote en 50  ; flacons de mL, 1 an ; 17,1 g/flacon + Moyen à 50 mL ; produit une solution de 1 M ; Filtre avec 0.22 µ ; m unité
Minuterie	Nalgene	5016-001
Solution de décongélation	Entreprises cryogéniques innovantes	BL-TS (&le ; 1,0 m saccharose)	T1, T2, T3, T4 ; toré à 2 - 8 º ; C comme &le ; 1 mois après l’ouverture de
la solution de vitrification*,**	Innovative Cryo Enterprises	BL-VS (&ge ; 7,9 M [Glycérol/EG])	V1, V2, V3 ; stocké à 2 - 8 º ; C comme &le ; 1 mois après l’ouverture
* Les additifs cryoprotecteurs non perméants peuvent inclure : du saccharose, du ficoll et de l’hyaluronate de sodium  ;
** Les autres préparations commerciales sont généralement de l’éthylène glycol (EG)/diméthylsulfoxyde (DMSO ; 30 % v/v ; 4,8 M), mais pourraient être de l’EG/propylène glycol (32 % v/v ; 5,2 M). Les solutions mixtes sont généralement utilisées pour réduire les problèmes de cryotoxicité d’une solution à molaire élevée. Les solutions commerciales comprennent généralement une solution ES et VS. La formulation d’une préparation commerciale est généralement une propriété exclusive.