La stimulation du nerf vague s’est avérée avoir une forte efficacité pour diminuer l’inflammation périphérique. Ici, nous présentons un protocole modifié de stimulation du nerf vague qui permet des examens plus approfondis des mécanismes anti-inflammatoires cholinergiques dans des réponses inflammatoires limitées.
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Article de méthode
Augmentation du temps de récupération et une diminution de LPS administration à étudier les mécanismes de stimulation du nerf vague dans les réponses inflammatoires limitées
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’inflammation est une réponse locale à l’infection et aux lésions tissulaires médiée par des macrophages activés, des monocytes et d’autres cellules immunitaires qui libèrent des cytokines et d’autres médiateurs de l’inflammation. Pendant longtemps, les mécanismes humoraux et cellulaires ont été étudiés pour leur rôle dans la régulation de la réponse immunitaire, mais les progrès récents dans le domaine de l’immunologie et des neurosciences ont également mis au jour des mécanismes neuronaux spécifiques au potentiel thérapeutique intéressant. La voie anti-inflammatoire cholinergique (CAP) a été décrite pour contrôler les réponses immunitaires innées et l’inflammation d’une manière très puissante. Au début des années 2000, Tracey et ses collaborateurs ont mis au point une technique qui stimule le nerf vague et imite l’effet de la voie. La méthodologie est basée sur la stimulation électrique du nerf vague à basse tension et fréquence, afin d’éviter tout effet secondaire de surstimulation, tel que la dérégulation de la variabilité de la fréquence cardiaque. Des appareils électriques pour la stimulation sont maintenant disponibles, ce qui facilite la mise en place de la méthodologie en laboratoire. L’objectif de cette recherche était d’étudier l’implication potentielle des prostaglandines dans la PAC. Malheureusement, sur la base de tentatives antérieures, nous n’avons pas réussi à utiliser le protocole original, car la réponse inflammatoire induite était soit trop élevée, soit ne convenait pas aux propriétés du métabolisme enzymatique. Les différents paramètres du protocole chirurgical original sont restés pratiquement inchangés, mais les conditions concernant l’induction inflammatoire et le moment avant le sacrifice ont été améliorées pour répondre à nos objectifs (c’est-à-dire pour étudier l’implication de la CAP dans des réponses inflammatoires plus limitées).
La version modifiée du protocole original, présentée ici, comprend une plage de temps plus longue entre la stimulation du nerf vague et l’analyse, ce qui est associé à une induction plus faible des réponses inflammatoires. De plus, tout en diminuant le niveau de lipopolysaccharides (LPS) à injecter, nous avons également constaté de nouvelles observations concernant les propriétés mécanistes de la rate.
Introduction
L'immunité innée fournit une première ligne de défense immédiate contre les infections et les maladies dans un large éventail d'organismes. Elle initie non seulement la réponse immunitaire primaire pour éliminer la menace, mais il joue également un rôle central dans l'activation et l'éducation de l'immunité adaptative qui réalise des réponses immunitaires secondaires d'une manière spécifique des agents pathogènes. L'inflammation est orchestrée par une pléthore de cytokines et chimiokines, qui à leur tour ont la capacité d'attirer d'autres cellules immunitaires sur le site d'infection et d'induire les signes cardinaux de l'inflammation, tels que la rougeur, l'enflure, la douleur, la perte de la fonction et de la fièvre . La durée et l'intensité de l'inflammation dépendent de plusieurs facteurs, mais la résolution de l'inflammation et la restauration de l'homéostasie est une étape essentielle pour éviter l'apparition de maladies inflammatoires chroniques. Les progrès récents dans le domaine des neurosciences et de l'immunologie ont élucidé les mécanismes neuronaux spécifiques avec un immense potentiel thérapeutique pour contrôler inflinflammation à la fois dans le système nerveux central et à la périphérie. L' un de ces mécanismes est la voie anti-inflammatoire cholinergique (CAP), également connu sous le réflexe inflammatoire, qui est entraîné par le système nerveux autonome 4, 5.
On pense actuellement que les médiateurs inflammatoires activent les nerfs sensoriels et envoient des signaux sur l'état de l'inflammation au système nerveux central. Une réponse réflexe est ensuite activé par l'intermédiaire du nerf efférent pneumogastrique. Une étude approfondie des détails anatomiques de la PAC a mis en évidence un modèle parasympathique-sympathique composé de deux nerfs, le nerf vague et les nerfs splénique, respectivement 6. Dans le CAP, le nerf cholinergique vagal efférente activé se termine dans le ganglion mésentérique-cœliaque, ce qui entraîne l'activation du nerf adrénergiques splénique par un mécanisme encore à explorer. Le nerf splénique, ainsi activé, est connu pour intérieurevée à proximité des cellules immunitaires dans la pulpe blanche, la zone marginale et la pulpe rouge de la rate, le principal organe et obligatoire de la PAC 7, 8. Norépinéphrine (NE) à partir des terminaisons nerveuses spléniques se lie aux récepteurs β 2 adrénergiques correspondantes exprimées sur les lymphocytes T spléniques. Ceci induit la libération choline acétyltransférase (ChAT) médiée par l' acétylcholine (ACh), qui à son tour active les récepteurs nicotiniques de l' acétylcholine a7 (α7nACh) sur les macrophages, ce qui limite la production et l' inflammation cytokine 2. Par conséquent, il est maintenant clair que le système nerveux est capable de réguler l'inflammation dans les tissus périphériques et de rétablir l'homéostasie immunitaire locale.
Comme le nom de la voie indique, le système acétylcholine est d'une importance capitale pour le bon fonctionnement de cette voie de régulation neuro-immunitaire. Fait intéressant, les mécanismes impliqués dans l'activation desla PAC semble être différente dans la périphérie et dans le système nerveux central. Bien que l'importance des récepteurs nicotiniques (α7nAChR) dans la rate a été démontré plus haut 9, les récepteurs muscariniques (mAChR) sont obligatoires pour l'activation de la voie centrale 10, 11. Plus récemment, l' administration périphérique d'un facteur de nécrose tumorale sériques et de la rate agoniste muscarinique M1 à action centrale sensiblement supprimée α (TNF) au cours de l' endotoxémie létale murine, une action requise nerf vague intact et le nerf splénique de signalisation 12. Nous avons également montré récemment que les souris dépourvues prostaglandine E 2 (PGE 2) ne sont pas en mesure de répondre à la stimulation du nerf vague et ne régulent la libération induite par le LPS de cytokines dans le sérum et la rate 3. Par conséquent, la PAC pourrait également être réglementé par des systèmes autres que les principaux pathw Achay.
Le nerf vague a été nommé en tant que tel en raison de son parcours de déambulation dans le corps, innervant principaux organes , y compris le foie, les poumons, la rate, les reins et l' intestin 13. Compte tenu de cette grande innervation et l'effet immunosuppresseur très puissant du nerf pneumogastrique, le potentiel thérapeutique de la PAC pourrait couvrir un large éventail de conditions inflammatoires. Le nerf vague peut être électriquement (ou mécanique) activé, avec contrôle de la tension et la fréquence, et contrairement aux traitements classiques, sans médicaments ajoutés au corps. Des essais sont en cours chez les patients rhumatismales, par exemple, pour tester la signification clinique de VNS dans le traitement de l' inflammation chronique 14. Au total, la communication neuro-immunitaire et régulation de l'inflammation sont actuellement à l'étude, qui fournira un traitement alternative possible au traitement conventionnel. Par conséquent, l'analyse du nerf vague stimulationeffet n dans les différents organes innervé, mais aussi la caractérisation de l'action thérapeutique potentielle dans des modèles animaux d'inflammation chronique, serait certainement donner un aperçu et l'espoir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.
La méthodologie originale développée par Tracey et ses collègues 4 ne pouvait pas être transposée à notre domaine de la recherche en raison de surstimulation de la réponse inflammatoire (par une dose létale de LPS) et une plage de temps trop court entre l' activation CAP et la lecture. Dans le présent document, nous allons présenter les modifications apportées au protocole d'origine, comparer les deux méthodes différentes sur les taux de cytokines, et mettre en évidence une nouvelle observation et à l'opposé de l'organe cible (la rate).
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Protocole
Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux approuvés par le Comité local d'éthique à l'Institut Karolinska, Stockholm. Le Comité d'éthique local suit les directives de l'Union européenne sur les soins des animaux.
REMARQUE: Les principaux changements par rapport au protocole initial est le temps de récupération après la chirurgie (6 heures par rapport à 1 h) et le niveau de LPS injectées (2 mg / kg par rapport à 15 mg / kg). Dans le cas contraire, les différents paramètres liés à la chirurgie elle-même n'a pas été modifié.
1. Préparation du matériau pour la stimulation
- Allumer l'ordinateur et le système d'acquisition de données relié à l'électrode de stimulation (figure 1A).
- Entrez le Acquitter programme.
- Préparer une solution mère de LPS à une concentration de 5 mg / ml dans 1 x PBS, aliquote, et stocker à -20 ° C. Le jour de l'expérience, dégeler une aliquote et préparer un adequate échantillon de LPS (0,5 mg / ml) afin d'injecter autour de 100 ul dans l'animal, en fonction du poids.
2. Préparation de l'animal pour l'anesthésie
- Utilisation des souris C57BL / 6. Maintenir les conditions climatiques contrôlées avec une lumière de 12 heures / cycle d' obscurité, les nourrir pour rongeurs standard, et leur donner ad libitum de l' eau.
- Effectuer la chirurgie sur des souris qui pèsent environ 25 g le jour de l'expérience.
REMARQUE: Lorsque des réactions inflammatoires sont induites, il est particulièrement important d'effectuer des contrôles réguliers et observations des réactions cliniques chez les animaux. L' euthanasie prématurée par inhalation de CO 2 est nécessaire si la condition animale ne répond pas aux critères éthiques. - Régler la machine anesthésique.
- Assurez-vous que le tube est correctement connecté et n'est pas endommagé de quelque façon. Assurez-vous que la zone aérée fonctionne correctement. Branchez le filtre clé à la bouteille isoflurane et remplir le vapoRizer avec une quantité suffisante d'isoflurane.
- Ouvrez l'alimentation en gaz (air et de l'oxygène) et assurez-vous que les bouteilles contiennent suffisamment de gaz pour l'expérience. Un connecteur à trois voies est alors en mesure d'envoyer le flux isoflurane à la chambre d'induction ou le masque.
- Tourner le connecteur à trois voies à la chambre d'induction. Choisir une souris de la cage et introduire l'animal dans la chambre. Ajuster le régulateur de débit de 1,0 L / min d'oxygène et de 1,0 L / min d'air. Ajuster la concentration de l'isoflurane à 4-5%.
- Lorsque le niveau souhaité de l'anesthésie est atteinte, lorsque le niveau souhaité de l'anesthésie est atteinte, raser la zone chirurgicale et déplacer l'animal de la chambre vers le masque. Tournez le connecteur à trois voies à l'écoulement du masque. Ajuster le régulateur de débit de 0,25 L / min d'oxygène et 0,25 L / min d'air.
- Ajuster la concentration en isoflurane à 1.5 à 2.5%. Vérifier le niveau de l'anesthésie par le contrôle réflexe et la fréquence respiratoire avant de commencer le procedur chirurgicale.
- Fixer les pattes de la souris sur le banc de travail en utilisant du ruban adhésif. Assurez-vous que le nez de l'animal est toujours bien positionné dans le masque.
3. La chirurgie et la stimulation du nerf vague
- Désinfecter la zone chirurgicale avec 70% d'éthanol.
- L'utilisation d'un scalpel, inciser soigneusement la peau au niveau du cou (incision d'environ 1 à 1,5 cm).
Remarque: Dans le protocole, la procédure de chirurgie se termine ici pour les animaux opérés de manière fictive. En effet, il a été démontré que juste toucher le nerf avec un outil métallique stimule déjà dans une certaine mesure. Par conséquent, pour obtenir un animal témoin de la chirurgie plus précise lors de l'utilisation d'une petite quantité de LPS, arrêter la chirurgie à cette étape. - Avec l'aide d'un microscope (objectif 12,5X), isoler le nerf vague gauche de l'artère carotide en utilisant une pince à disséquer. Tout d'abord localiser le muscle sterno en éliminant les couches de la peau et la graisse, puis se rétracter dansafin de mettre le forceps derrière les deux le nerf et l'artère.
Remarque: L'étape suivante est très délicate, car le nerf et l' artère sont étroitement collées les unes aux autres. Par conséquent, il est très facile de couper le vaisseau et tuer l'animal. Cependant, en plaçant la pince très soigneusement entre le nerf et l'artère, ils se séparent finalement, et il est possible d'isoler le nerf. - Placer l'électrode (figure 1B) dans le cadre du nerf vague. L'électrode à aiguille est assez long, même si le nerf se déplace légèrement au cours de la stimulation, il sera toujours en contact avec l'électrode.
- Effectuer une injection intraperitoneale (ip) de LPS (2 mg / kg) à l'aide d'une seringue (pour la lecture sur les taux de cytokines, à savoir, pour mesurer l'effet de la régulation à la baisse).
- Attendre 5 minutes avant de commencer la stimulation.
- Stimuler le nerf vague pendant 5 minutes à 5 V et 1 Hz en appuyant sur le bouton de démarrage dans l'acquittement programme.
- Rédéplacer l'électrode et le fil de suture de la plaie de l'animal avec un fil de suture chirurgical.
- Vaporisez une barrière Film Non Sting (NSBF) sur la plaie afin d'améliorer la guérison et à protéger contre les infections.
4. Récupération de l'animal
- Après la chirurgie, déplacer l'animal à sa cage pour le réveil et la récupération. Sous la lumière infra-rouge afin de maintenir la température du corps, assurez-vous de surveiller l'animal jusqu'à la pleine conscience a été retrouvé.
- Laissez l'animal récupérer dans sa cage pendant 6 heures avant le sacrifice pour l'analyse.
Note: L'effet de la stimulation du nerf vague est très rapide et a également été démontré que de longue durée (jusqu'à 48 heures), de sorte que le temps de récupération peut être réglée par l'expérimentateur en fonction des besoins de l'étude.
5. Sacrifice aux fins d'analyse
- Placer l'animal dans une cage reliée à un dispositif d'administration de CO 2.
- Réglez l'appareil sur un 5Cycle -min d'inhalation de CO 2.
- Lorsque l'euthanasie est fait, collecter les organes d'intérêt et les congeler directement sur de la glace sèche pour une analyse ultérieure (par exemple, la mesure des taux de cytokines dans les extraits de la rate en utilisant un TH1 de la souris / TH2 dosage 9-Plex) 3.
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Résultats
Niveau de TNFa et Interleukin-1β (IL-1β) après avoir augmenté le Accéléré après la chirurgie et la diminution de la dose de LPS
Comme montré précédemment, en utilisant le protocole d'origine, VNS a diminué les niveaux de TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg dans SHAM par rapport à 39,7 ± 10,8 pg / mg dans VNS, p <0,001) et l'IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg de SHAM contre 191,7 ± 27,2 pg / mg dans VNS, p <0,01) dans la rate après injecti...
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Discussion
Depuis sa découverte au début des années 2000, les mécanismes de la PAC ont été soigneusement étudiés. Nous avons maintenant une bonne image de la voie, et en particulier, l'organe cible, la rate, où NE, les cellules T mémoire, Ach et macrophages travail en équipe très efficace pour réguler négativement les médiateurs inflammatoires 2. Nous avons récemment publié des données sur l'importance d'un système de prostaglandine fonctionnelle chez les souris, en particulier PGE2, ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
L’étude a été financée par le Conseil suédois de la recherche, l’Association suédoise des rhumatismes, les fondations de l’Institut Karolinska, le conseil départemental de Stockholm, la Fondation Wallenberg et la Fondation GV 80 Years' pour la recherche. Les auteurs tiennent également à remercier Hannah Aucott pour la relecture du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ordinateur | Toshiba-N’importe | quel ordinateur est en fait compatible | |
| Système d’acquisition de données MP-150 | Biopac Systems | MP150WSW | |
| Acknowledge software | Biopac Systems | ||
| Mice C57Bl/6 | Charles River | ||
| Anesthésie Simtec | Engineering | ||
| Bouteille d’oxygène médical | AGA | 107563 | |
| Bouteille d’air médical ; | AGA | 108639 | |
| Vetflurane (1 000 mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Saline | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493 | Dilué 10 fois pour la concentration utilisée |
| Seringue (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Aiguilles 23 G | KD-FINE | 0,6 x 30 mm (bleu) | |
| Pince de microdissection (courbée) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Ciseaux de dissection | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Suture chirurgicale 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Unité d’euthanasie | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon No Sting Barrier Film | 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex assay, kit ultrasensible | MesoScale Discovery | K15013C-1 | |
| Dispositif d’électrode stimulante | Biopac Systems | STIMSOC | |
| Aesculap Isis rasoir | Agnthos | GT420 | |
| R70 | Régime alimentaire pour rongeurs de Lantmannen, Stockholm, Suède |
Références
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Réimpressions et autorisations
