Article de méthode

Utilisation Agarose linéaire Canaux pour étudier Drosophila Larvaire Ramper Comportement

DOI :

10.3791/54892

⸱

26 novembre 2016

 , 
1Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 2Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Dans cet article

Résumé

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La larve de drosophile est un système modèle puissant pour étudier le contrôle neuronal du comportement. Cette publication décrit l'utilisation de canaux d'agarose linéaires pour obtenir des combats soutenus de rampants et méthodes linéaires pour quantifier la dynamique des structures larvaires pendant un comportement répétitif ramper.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila crawling larvaire est en train de devenir un modèle puissant pour étudier le contrôle neuronal du comportement sensorimotrice. Cependant, le comportement de rampement larvaire sur des surfaces ouvertes à plat est complexe, y compris: une pause, se tournant et serpentant. Cette complexité dans le répertoire de mouvement empêche une analyse détaillée des événements qui se produisent pendant un cycle crawl enjambée unique. Pour surmonter cet obstacle, les canaux d'agarose linéaires ont été faites qui limitent le comportement des larves à droite, soutenue, crawling rythmique. En principe, parce que les canaux d' agarose et le corps des larves de drosophile sont tous deux optiquement clair, le mouvement des structures larvaires marquées par des sondes fluorescentes génétiquement encodés peut être contrôlée intacte, les larves librement en mouvement. Dans le passé, les larves ont été placées dans des canaux linéaires et rampants au niveau de l' organisme entier, un segment, et les muscles ont été analysés 1. Dans le futur, les larves rampant dans les canaux peut être utilisé pour l'imagerie du calcium pour surveiller la neurol'activité finale. De plus, ces méthodes peuvent être utilisées avec des larves d'un génotype et avec un canal de chercheur conçu. Ainsi , le protocole présenté ci - dessous est largement applicable pour les études utilisant la larve de drosophile comme modèle pour comprendre le contrôle moteur.

Introduction

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L'objectif global de cette méthode est d'étudier la drosophile crawling larvaire en détail. Des expériences sur la locomotion ont joué un rôle important dans le développement et tester des théories sur le contrôle moteur 2. Traditionnellement locomotion a été étudiée chez les animaux aquatiques (par exemple, sangsue, lamproie, têtard) 3. La nature répétitive de la locomotion chez ces animaux a permis l'étude de rythmogenèse, pour l'analyse des événements biophysiques locomotion de conduite, et pour la surveillance des modes de tir de neurones qui accompagnent la locomotion.

L'utilisation de larves de drosophile pour les études de locomotion présente une combinaison unique d'avantages par rapport à d' autres systèmes modèles: génétique faciles, le développement bien caractérisé, un corps qui est optiquement clair au premier et deuxième stades, et un électron de transmission en cours de reconstruction microscopique de l'ensemble système nerveux 4-6. Cependant, la drosophile larvaire locomouvement sur des surfaces ouvertes à plat est un peu complexe , y compris les pauses, tourne, et sinueuse rampe 7. Cette publication présente une méthode pour utiliser des canaux d'agarose linéaires pour guider Drosophila comportement locomoteur des larves de telle sorte que les larves effectuer soutenue, le comportement de rampement droite, rythmique.

Étudier le comportement des larves de Drosophila dans les canaux d' agarose, au lieu de comportement sur des surfaces plates ouvertes, présente plusieurs avantages. Premièrement, elle permet aux chercheurs de choisir spécifiquement ramper le comportement des nombreux mouvements qui font partie du répertoire comportemental larvaire. D'autre part, en réglant la largeur du canal par rapport à la taille du corps de la larve, la vitesse peut être ajustée en rampant. En troisième lieu, les canaux permettent la larve d'être vu à partir dorsale, ventrale ou latéral en fonction de la chenille est chargé et orienté à l'intérieur du canal. Cette polyvalence d'orientation larvaire permet pour chaque structure d'intérêt pour être continuellement visible pendant l'exploration. Quatrième,les canaux sont aptes à être utilisé avec une grande variété de microscopes et d'objectifs. Par exemple, les chaînes linéaires peuvent être utilisés pour l' imagerie à basse résolution sur stéréoscopes champ clair et / ou pour imagerie à haute résolution sur le filage-disque microscopes confocaux 1. Cinquièmement, cette méthode peut être utilisée en combinaison avec des manipulations neuronales optogénétiques / thermogénique dans tout contexte génétique. Enfin, parce que le corps de la larve (au premier et deuxième stades) et les canaux d'agarose sont optiquement clair, les canaux peuvent être utilisés lors de l'étude des mouvements dynamiques, ou des changements dans l'intensité de fluorescence des structures larvaires marquées par des sondes fluorescentes génétiquement encodés.

La méthode décrite est appropriée pour des études cinématiques détaillées de première et de deuxième stade Drosophila comportement des larves. Cette publication analyse les changements dynamiques dans l'intensité de fluorescence du système nerveux central au cours des larves rampant vers l'avant pour démontrer l'utilisation de canaux et comme un précurseur de neuimagerie calcique ronal.

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Protocole

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1. Préparation de Larves

  1. Une semaine avant le comportement d'enregistrement, mettre en place une croix (minimum de 25 vierges et 5 mâles). Maintenir tous les croisements et la descendance à 25 ° C.
    NOTE: La température des conditions de culture peut être modifiée, mais la ligne de temps décrite ci-dessous devrait être ajusté pour tenir compte des variations de la vitesse de développement.
  2. 5 jours avant l'enregistrement, la première chose le matin, placez la croix dans une collection cage avec un bouchon de gélose / jus et un dab (0,5-1 ml) de pâte de levure dans le centre de la calotte agar / jus.
    1. Pour faire une collection cage, percer des trous dans un 6 oz polyéthylène carré Drosophila de la bouteille.
    2. Pour bouchons agar / jus, mélanger 18 g d'agar-agar avec 600 de l'eau dans un flacon conique. Dans un ballon mélange 20 g de saccharose séparée avec 200 ml de jus de pomme. Micro-ondes jusqu'à ce que les solides soient dissous. Mélanger et remuer, permettant le mélange refroidir à 60 ° C. Ajouter 20 ml 10% de méthyl-p-hydroxybenzoate dans 95% d'éthanol, et remuer. Ajouter ~ 7ml à la moitié inférieure d'une boîte de Pétri ronde 35 x 10 mm. Laisser agar / jus de se solidifier pendant 1 heure à température ambiante. Conserver à 4 ° C.
    3. Pour faire de la pâte de levure, ajouter des parties égales en volume de levure sèche et de l'eau. Conserver à 4 ° C.
  3. Vérifiez la santé des collections larvaires.
    1. Dans la matinée, 4 et 3 jours avant l'enregistrement, retirez le bouchon et placer un nouveau cap sur la cage. Changez les bouchons à la même heure chaque jour pour obtenir une collection de 24 heures d'oeufs et de larves nouvellement écloses.
    2. Après chaque bouchon est enlevé, l'examiner pour voir combien d'oeufs la croix est la pose. Attendez-vous entre 500-2000 oeufs. Réglez le nombre d'adultes, si nécessaire.
      NOTE: Quelques oeufs devraient éclore en larves ont, et les larves nouvellement écloses seront trouvés loin de la pâte de levure.
    3. Âge chaque chapeau pendant 24 heures. Réexaminer le bouchon afin de déterminer si les larves sont en bonne santé.
      REMARQUE: La plupart des œufs devraient éclore en larves ont, et les larves auraient rampé dans le yepâte de ast. Les signes de mauvaise santé comprennent un grand nombre d'oeufs non éclos, morts organismes larvaires loin de la pâte de levure, et les larves avec des taches sombres significatives dans l'abdomen, ce qui indique une réaction immunitaire. Si les larves sont insalubres, changer la cage, assurez capsules fraîches / pâte de levure, et vérifier le génotype.
    4. Jeter les vieux chapeaux.
  4. Recueillir les larves pour les enregistrements de comportement.
    1. À la fois 2 et 1 jour avant l'enregistrement, retirez le bouchon et le remplacer par un bouchon frais.
    2. Etiqueter chaque capuchon retiré et maintenir à 25 ° C. Ceci va produire une série progressive de larves pour les enregistrements de comportement. Larves de nouvellement éclos (0-4 h après l'éclosion) par deuxième stade larvaire (24-48 h après l'éclosion) peut être utilisé dans les canaux. Enregistrer bouchons pour les enregistrements sur deux jours consécutifs.
    3. Jeter tous les bouchons après 48 heures.
    4. Si nécessaire, répétez les étapes 1.4.1-1.4.3 jusqu'à 5 d supplémentaire. Après que moins d'œufs fécondés sont produits.

2. Préparation de canaux

  1. Préparer PDMS linéaires de canal (Polydiméthylsiloxane, un élastomère de silicone) de moule de coulée (figure 1A). PDMS casting moules sont disponibles auprès du laboratoire Heckscher sur demande.
    1. Nettoyer le moule de coulée avec de l'alcool isopropylique. Sécher à l'air, séchez avec des lingettes de laboratoire, ou utiliser de l'air en conserve.
    2. Placez le moule de coulée dans une boîte de Pétri couvercle 10 cm ou un autre récipient.
  2. Préparer et verser la solution d' agarose.
    1. Faire une solution à 3% d'agarose dans de l'eau (3 g dans 100 ml) par micro-ondes jusqu'à dissolution complète.
    2. Laisser refroidir à 55 ° C, ce qui permet aux bulles de monter à la surface.
    3. Verser le mélange d'agarose dans la boîte de Pétri contenant le moule de coulée de sorte que le moule soit juste recouverte. Laissez ensemble agarose jusqu'à solidifié.
  3. Retirez les canaux d'agarose du moule de coulée. Rogner les bords du disque d'agarose avec une lame de rasoir.
    1. Mettez le canals dans un plat de 10 cm Petri immergé dans l'eau. Ils peuvent être conservés à 4 ° C pendant 7 jours.

3. Charger un Larve dans un canal à enregistrer Comportement

NOTE: Si le stockage des canaux à 4 ° C, permettent de venir à canaux RT avant d'utiliser pour l'enregistrement du comportement.

  1. Utilisez une lame de rasoir propre pour couper un seul canal de ceux préparés à l' étape 2 (figure 2A).
  2. Utiliser une paire de pinces pour placer le canal latéral rainuré sur une lamelle de verre (figure 2B). La taille et l'épaisseur de la lamelle dépend de la portée spécifique utilisée pour l'imagerie.
  3. Utilisez une pince fine pour sélectionner une larve du bouchon agar / jus préparé à l' étape 1 et le placer dans le canal de coupe (figure 2C).
    1. Ne pas presser la larve. Prenez-le délicatement avec la pointe de la pince tine. Il est également possible de manipuler la larve avec un pinceau à pointe fine.
      NOTE: Ceci est important car les larves sont très senSitive au toucher. Si elles ne sont pas manipulés avec soin, les réponses nociceptives pourraient dominer leur comportement pendant les premières secondes de l'expérience.
    2. Laver les larves par brièvement immergeant dans l'eau.
    3. Après avoir placé la larve sur le canal de coupe, utilisez la pointe de la pince tine pour taquiner doucement la larve dans le bosquet de canal.
      REMARQUE: Pour la plupart des applications de la largeur de la larve et la largeur du canal doivent correspondre. La largeur moyenne des larves à différents stades de développement suit: 0 h après l' éclosion - 140 um, 24 h après l' éclosion - 180 um, 48 h après l' éclosion - 320 um, 72 heures après l' éclosion - 500 um, 96 h après l' éclosion - 750 um 8. Canaux viennent dans les largeurs suivantes: 100, 150, 200, 250, et 300 um, et tous les canaux sont de 150 um de profondeur.
    4. Utilisez la pointe d'une dent ou d'un pinceau pince pour ajuster la position de la larve dans le canal. Il peut être orienté dans toutes les directions: ventralejusqu'à ventral vers le bas, d'un côté ventral, en fonction de la structure doit être imagée.
  4. En utilisant des pinces, retournez doucement le canal sur de telle sorte que la larve est maintenant sur le verre de protection. Placez une ou deux gouttes d'eau aux extrémités du canal de sorte qu'il se remplit d'eau (figure 2D).
    1. Soulevez doucement les côtés du canal pour éliminer les bulles d'air.
    2. Ajuster l'orientation de la larve. Pour ce faire, pousser doucement le canal, mais pas le verre de couverture pour rouler la larve. Si cela ne change pas l'orientation, retirez le couvercle en verre et d'ajuster la position larvaire. La larve est prête à être imagé.
    3. Image du canal / lamelle sur un microscope inversé. Si l'imagerie sur un microscope droit, inverser simplement le canal / lamelle.

4. Mesurer entité d'intérêt dans l'enregistrement du comportement

  1. Pour une structure d'intérêt (par exemple, la queue, CNS), mesurer une caractéristique d'intérêt (par exemple ,, L'intensité de fluorescence, l'emplacement) au fil du temps.
    NOTE: Des structures telles que la tête et la queue peuvent être annotées manuellement. Par exemple, la tête peut être identifié comme contenant buccaux sombres crochets en forme de H, la queue peut être identifié comme contenant spiricles trachéales postérieures. Ce document met l'accent sur le cordon nerveux. Utilisez la ligne de GAL4 elav-GAL4 neuronal pour conduire un transgène UAS-myr-GFP (elav> GFP) 9,10 pour marquer par fluorescence du système nerveux central (SNC). Le CNS contient deux lobes du cerveau antérieur attachés à la moelle épinière, qui se prolonge à la partie postérieure (Figure 3).
  2. Mesurer l'intensité de pixel du nerf cordon (f (NC)) à chaque point de temps (t). Ci-dessous décrit une approche manuelle d'annotation, mais cette étape peut être automatisée.
    1. Aux Fidji (ou un logiciel similaire) dans le menu 'Analyser' utiliser les "Mesures Set ..." boîte de dialogue pour indiquer la valeur de gris moyen et slice position.
    2. Dessiner manuellement une boîte dans le centre de la moelle épinière dans la première image du film (Figure 3). Cette étape pourrait également être automatisé avec des algorithmes de segmentation d'image et d'enregistrement.
    3. Utilisez la commande "Mesure" dans le menu "Analyser" pour signaler l'intensité moyenne de pixels dans la région encadrée d'intérêt. Cela génère une fenêtre "Résultats".
    4. Dans l'image suivante, repositionner manuellement la boîte sans redimensionnement à l'aide des touches fléchées. Utilisez à nouveau la commande "Mesure". Les résultats mis à jour seront affichés dans la fenêtre "Résultats". Répétez cette étape pour chaque trame d'intérêt.
    5. Enregistrer la commande "Résultats" en utilisant "Enregistrer sous ..." dans le menu Fichier. Les résultats seront exportés sous forme de fichier .xls.

5. Analyser les mesures

  1. Normaliser chaque f (NF) de la valeur à une valeur comprise entre 0 et 1 (z (t) </ Em>).
    1. Dans une feuille de calcul (ou un autre programme), ouvrez le fichier Results.xls. Ce fichier aura deux colonnes représentant le numéro d'image et de l'intensité de fluorescence moyenne.
    2. Faire une nouvelle colonne et utiliser la formule z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / max (f [NC]) -min (f [NC]) pour générer une valeur de fluorescence normalisée correspondant à chaque point temporel.
  2. Déterminer la période foulée pour chaque foulée dans l'enregistrement.
    NOTE: Un cycle de foulée est l'unité de mouvement du corps entier répétitif pour l'avant (et arrière) ramper. Par convention un terme commence foulée (et extrémités) avec le mouvement vers l' avant de la queue, la tête, et d' autres organes internes tels que l'intestin ou CNS 1.
    1. Inspecter manuellement l'enregistrement du comportement et enregistrer les temps d'initiation (i) de chaque foulée (i (Stride Cycle [n])).
      NOTE: Dans l'exemple ci-dessous, le mouvement vers l'avantdu système nerveux central comme l'ouverture d'un cycle de foulée a été utilisé (Figure 3).
    2. Pour chaque foulée calculer la période: Δ t (cycle Stride) = i (Stride Cycle [n + 1]) -i (Stride Cycle [n]).
  3. Calculer le pourcentage du cycle de foulée écoulé pour chaque point de l'enregistrement du temps.
    1. Faire une colonne supplémentaire dans le fichier de feuille de calcul représentant le temps écoulé depuis le début d'un cycle de foulée (c). Régler l' heure depuis le début de foulée à zéro au début de chaque foulée (c (Stride Cycle [n]) = 0). Régler les temps après l'initiation en conséquence.
    2. Faire une colonne supplémentaire dans le fichier de feuille de calcul représentant le cycle pour cent de foulée écoulé (cycle de foulée%) Divisez fois ajustés par période foulée et multiplier par 100 pour convertir en pourcentage du cycle de foulée écoulée:.% Cycle de foulée = (c (Stride Cycle [n] )) / (Δ t (Cycle Stride) * 100).

6. Générer coordonnées polaires Parcelles pour représenter la dynamique des structures d'intérêt au cours du cycle de Crawl

  1. Dans MATLAB, utilisez dialogue 'importation de données »dans l'onglet Accueil pour importer le Results.xls mis à jour.
  2. Faire un nouveau tableau "Theta" Valeurs de cycle de foulée contenant pour cent (cycle de foulée%). ( "Theta = Var1" où Var1 représente le cycle de foulée%).
  3. Faire un nouveau tableau "Rho" contiennent des valeurs de fluorescence normalisés (z (t)). ( "Rho = Var2" où Var2 représente z (t)).
  4. Utilisez la commande 'polarplot' pour faire de coordonnées polaires parcelles avec le cycle pour cent de la foulée que l'angle, et la fluorescence que le rayon ( "polarplot (Theta, Rho)").

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Résultats

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Cet article décrit une méthode pour guider le comportement des larves de drosophile en utilisant des canaux d' agarose et pour mesurer la dynamique des structures larvaires sur un cycle d'analyse. Larves dans les canaux linéaires effectuer des épisodes soutenus de crawling rythmique (Figure 3). Parce que les larves et les canaux sont optiquement clair, les canaux peuvent être utilisés avec des larves exprimant des sondes fluorescentes exprimées dans toute struct...

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Discussion

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Un dispositif microfluidique a été construit pour faire des canaux d'agarose linéaires qui peuvent accueillir des larves de drosophile (Figure 1). Lorsque les larves de drosophile sont placés dans ces canaux d' agarose linéaires leur répertoire comportemental est limité à l' exploration, ce qui permet une observation détaillée de la dynamique des structures larvaires au cours du cycle d'exploration.

Un enregistrement réussi se produit quand ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous tenons à remercier Chris Wreden et Michelle Bland pour leurs commentaires sur le manuscrit et pour leur aide technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bouteille carrée de drosophile de 6 ozScimartDR-103
agarsigmaA1296
saccharosesigmaS9378
jusde pomme non à base de concentré
TegoseptFisherT2300méthyl-p-hydroxybenzoate
35 x 10 mm boîte de Pétri rondeFisher351008
de boulanger
PDMS moule de couléeFlowJempeut être demandé aux auteurs
Alcool isopropyliqueFisherA417-1
lingettes de laboratoireFisher06-666-11
air compriméFisher18-431
10 cm boîte de PétriBioPioneerGS82-1473-001
agaroseFisher50-444-176
lame de rasoirFisher12-640
pinceFST11241-40
22 x 40 verre de protection, #1.5Fisher50-365-605
Fidji (version 1.51d)NIHfiji.sc
Excel 2016Microsoftwww.microsoftstore.com
MATLAB R2016Mathworkswww.mathworks.com
levure

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

D veloppement des circuits neurauxsondes fluorescentesimagerie calciquelign e GAL4fluorescence du cordon nerveuxcycle de foul e de rampeanalyse de l organisme entieranalyse des muscles segmentaires

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