Article de méthode

L'optimisation d'un micro-neutralisation quantitative de dosage

DOI :

10.3791/54897

⸱

14 décembre 2016

 ,  , 
1Mill Hill Laboratory, The Francis Crick Institute

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude décrit un à base d'imagerie-dosage micro-neutralisation pour analyser les relations antigéniques entre les virus. Le protocole utilise un scanner à plat et comporte quatre étapes, dont le titrage, titrage quantification, la neutralisation et la neutralisation quantification. Le test fonctionne bien avec un courant circulant de la grippe A (H1N1) pdm09, A (H3N2), et les virus B.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le test de microneutralisation (MN) est une technique standard pour mesurer l’infectivité du virus de la grippe et l’inhibition de la réplication du virus. Dans cette étude, nous présentons le protocole d’un test MN basé sur l’imagerie pour quantifier les véritables relations antigéniques entre les virus. Contrairement aux tests typiques de réduction des plaques qui reposent sur des plaques visibles, ce test quantifie l’ensemble de la population cellulaire infectée de chaque puits. Le protocole fait correspondre le type ou le sous-type de virus avec la sélection de lignées cellulaires pour obtenir une infectivité maximale, ce qui améliore le contraste de l’échantillon pendant l’imagerie et le traitement de l’image. L’introduction du titrage quantitatif définit la quantité de virus d’entrée de neutralisation et permet de comparer les résultats de différentes expériences. La configuration de l’imagerie avec un scanner à plat et un logiciel téléchargeable gratuitement rend l’approche à haut débit, rentable, conviviale et facile à déployer dans la plupart des laboratoires. Notre étude démontre que le dosage amélioré de la MN fonctionne bien avec les virus grippaux A(H1N1)pdm09, A(H3N2) et B actuellement en circulation, sans être significativement influencé par les substitutions d’acides aminés dans la neuraminidase (NA) des virus A(H3N2). Il est particulièrement utile pour la caractérisation des virus qui se développent jusqu’à un faible titre d’HA et/ou qui subissent une infection abortive entraînant une incapacité à former des plaques dans les cellules en culture.

Introduction

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Micro-neutralisation (MN), les dosages sont utilisés en virologie pour le dosage d'anticorps neutralisants et des activités antivirales. Comme une alternative d'inhibition de l' hémagglutination (HI) des essais, des essais de MN peuvent surmonter les effets non-antigéniques influencés par les changements d'affinité de liaison aux récepteurs de virus de la grippe, ce qui peut compliquer l'interprétation des résultats de HI 1,2,3. Jusqu'à récemment, la plupart des essais de MN ont été basées sur des effets cytopathiques (CPE) ou des dosages immuno-enzymatiques (ELISA) 4,5. Essais MN basé sur la réduction de la concentration et la plaque ont été développés en 1990 6,7,8. des dosages de réduction de plaque reposent sur le comptage des plaques visibles pour quantifier l'infectivité. Cependant, les chiffres visuels ne couvrent que les grandes plaques qui sont résoluble par des yeux humains, même si la majorité des plaques sont petites et invisibles pour de nombreux virus circulant actuels. Cette couverture incomplète peut provoquer des variations importantes entre les examinateurs et entre les expériences, conduisant à iRésultats ncomparable. Il est également impossible d'utiliser la méthode lorsque certains virus montrent infection abortive de cellules individuelles ou de très petites plaques.

La résolution de comptage pauvre peut être améliorée par la mise en place d'un protocole basé sur l'imagerie. Avec les progrès de la technologie, la microscopie optique et à haut débit lecteurs bien-plaques peuvent fournir des moyens précis pour compter les cellules infectées 9. Sous un microscope trans-éclairé, les cellules infectées marqués avec certains marqueurs peuvent être visualisés par leur absorption ou de fluorescence contraste dans la résolution sub-cellulaire. Un échantillon peut ensuite être analysé sur un écran d'ordinateur.

Malheureusement, en raison de la limitation dans le champ de vision, plus d'une centaine d'images carrelés sont nécessaires pour couvrir un seul puits. L'analyse d'une plaque de 96 puits nécessiterait l'imagerie et le traitement d'une dizaine de milliers d'images. Un tel processus laborieux est longue et coûteuse, et la résolution est acquise dans les genresl inutile pour la caractérisation de routine des infections virales. Laboratoires avec un budget limité peuvent constater que l'approche construite autour d'un scanner à plat fournit un, à haut débit alternative rentable.

Dans cet article, on décrit une amélioration de dosage MN réduction de plaque qui est appropriée pour la caractérisation antigénique d'un grand nombre de virus et pour mesurer quantitativement les activités antivirales et les anticorps de neutralisation. Le dosage présente plusieurs avantages: d'une part, il est un essai basé sur l'imagerie, qui est capable de mesurer les infections virales au niveau cellulaire, quelle que soit la taille de la plaque. Le comptage de la population cellulaire totale infectée (PCI) à l'intérieur d'un puits augmente considérablement la sensibilité de détection, permettant ainsi de caractériser les virus à faible infectivité. D'autre part, un dosage quantitatif plus précis est introduit avant la neutralisation afin de déterminer la quantité de virus d'entrée. Le virus quantitative d'entrée réduit de manière significative le variation entre les différentes expériences et rend les résultats plus comparables entre les laboratoires. Troisièmement, les titres de neutralisation peuvent être déterminés directement par l'analyse des images, ce qui rend la quantification rapide et facile à utiliser. Enfin, le protocole fournit une alternative rentable et à haut débit avec la résolution et la précision requise. La quantification est basée sur un scanner à plat et le logiciel libre de traitement de données. La configuration entière a un faible encombrement et est déployable dans la plupart des laboratoires.

Le protocole présenté dans le présent document se compose de quatre étapes principales, y compris le titrage du virus, le titrage de quantification, la neutralisation du virus, et la neutralisation quantification. Titrage du virus est une expérience de préparation qui détermine la quantité de virus d'entrée à utiliser dans la neutralisation. Au cours d'un titrage, un certain nombre de concentrations virales sont appliquées sur les monocouches de cellules dans une plaque à 96 puits. Les cellules infectées sont ensuite quantifiées dans la section 2. La dilu viraletion qui produit 20% -85% PCI est à son tour appliqué en tant que virus d'entrée pour la neutralisation correspondante section 3. Les titres du protocole de neutralisation sont quantifiés en utilisant la section 4. Les expériences qui ont suivi les protocoles ci-dessus sont présentés dans les résultats représentatifs. L'essai a été testé à fond au cours des deux dernières années avec la plupart des virus grippaux circulants actuels, tels que A (H1N1) pdm09, A (H3N2), et les virus B. Les résultats de la caractérisation des virus de la grippe ont été inclus dans les rapports de la réunion de consultation de l'OMS qui a donné des recommandations sur les vaccins contre la grippe pour une utilisation dans l'hémisphère Sud en 2016 et l'hémisphère Nord en 2016-2017.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTE: Le niveau de biosécurité (BSL) pour le protocole suivant est BSL 2 pour les virus de la grippe saisonnière et BSL 3+ pour les virus potentiels de la grippe pandémique. titration virale est exigé à l'avance d'une expérience de neutralisation pour décider de la concentration virale de la suppression virale (VC).

1. Virus Titration

NOTE: En fonction du nombre de virus et le nombre de doublons, une plaque bien peut être mis en place avec les flexibilités suivantes: (1) La dilution virale peut être organisé le long des rangées ou des colonnes (figure 1). Chaque virus devrait occuper une ligne / colonne séparée. (2) L'augmentation virale de dilution est flexible, mais il devrait commencer par la concentration virale la plus élevée dans le coin supérieur gauche. (3) Il n'y a aucune restriction sur le nombre de doublons.

NOTE: Madin Darby rein de chien (MDCK) et MDCK-SIAT1 (SIAT), les cellules ont été aimablement fournies par le Dr M. Matrosovich, Marburg, Allemagneun grand nombre 10. cellules SIAT sont des cellules MDCK transfectées de façon stable avec le CMP-N-acétylneuraminate humaine: le gène ß-galactoside α-2,6-sialyltransférase pour une meilleure expression de l'acide sialique (SA) oligosaccharides α2-6Gal terminés.

  1. Aliquotes suffisamment de cellules MDCK ou des cellules MDCK-SIAT 8 dans des plaques à 96 puits (200 pl / puits). Incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 2 ou 3 jours pour atteindre la confluence. Propager les cellules dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum inactivé à la chaleur de veau foetal (FCS) et des antibiotiques (100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine). Incuber les cellules SIAT à 37 ° C avec 5% de CO 2 et 1 mg / ml de G418 sulfate.
    NOTE: Le facteur de dilution dépend de l'expérience et de la lignée cellulaire utilisée. La monocouche cellulaire confluente doit être (pas de paroi cellulaire ou de contours visibles pour les cellules MDCK et une disposition étroitement tassé pour des cellules MDCK-SIAT1) au moment de l' inoculation du virus. Des exemples de dilution basées surla sous - culture des fioles confluentes de cellules MDCK ou des cellules MDCK-SIAT1 sont donnés dans le tableau 1.
  2. Laver les cellules 3 fois avec 200 pi de milieu de croissance du virus (VGM) par puits. Stériliser la rondelle plaque multiplis avec 70% EtOH pendant 30 minutes, puis rincez-le dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) ou VGM avant le lavage.
  3. Aspirer le VGM et ajoutez immédiatement 50 pi de VGM à chaque puits.
  4. Ajouter 900 ul de VGM à chacun des 6 tubes stériles (ou moins, en fonction du nombre de virus d'essai et les doublons). Pipeter 100 pi de virus dans le premier tube, bien mélanger et diluer en série, en changeant les conseils entre chaque dilution. Répétez l'opération pour chaque virus à titrer.
    NOTE: Cela donnera des dilutions de virus de 10 -1 à 10 -6.
  5. Ajouter 50 pi de chaque dilution de virus, à partir de la dilution la plus élevée (1 x 10 -5 sur la figure 1), aux puits dupliqués (colonnes 9 et 10 sur la figure 1) d'un 9plaque de 6 puits.
  6. Placer la plaque à 37 ° C pendant 2 à 3 heures pour permettre au virus d'infecter les cellules.
    NOTE: Une incubation de 2 à 3 h est nécessaire pour s'assurer que les virus dans l'inoculum ont suffisamment de temps pour atteindre la monocouche.
  7. Préparer le recouvrement (10 ml / plaque)
    NOTE: La superposition se compose de 5 ml de 2x DMEM, trypsine (2 pg / ml de concentration finale), 20 pi de 1 mg / stock ml et 5 ml de linters de coton de cellulose (voir la liste des matériaux).
  8. Retirer l'inoculum.
  9. Ajouter la superposition (200 pi à chaque puits). Incuber une nuit à 37 ° C, PAISIBLE.
    NOTE: Le bourgeonnement du virus a lieu après environ 4 heures, il est donc important que la plaque ne soit pas perturbé après cette heure.
  10. Aspirer la superposition des puits.
  11. Ajouter de la glace froide 4% de paraformaldehyde dans PBS A (200 pl / puits). Placer à 4 ° C pendant 30 minutes, ou à la température ambiante pendant 20 min.
    NOTE: PBS A est naturel pH tampon phosphate salin avec 10 gof NaCl, 0,25 g de KCl, 1,437 g de Na 2 HPO 4, 0,25 g de KH 2 PO 4, et 1 L d'eau distillée (voir la liste des matériaux).
    NOTE: Le paraformaldéhyde est nocif en cas d'inhalation et peut provoquer des brûlures en cas d'ingestion. Il y a aussi des preuves limitées d'un effet cancérogène, et il peut entraîner une sensibilisation par contact cutané.
  12. Aspirer le paraformaldehyde et laver les plaques deux fois avec PBS A (200 pl / puits).
  13. Stocker les plaques dans PBS A à 4 ° C pour une utilisation ultérieure, ou continuer avec les étapes suivantes.
  14. Ajouter un tampon de perméabilisation (100 pl / puits). Laissez-le à température ambiante pendant 30 min.
  15. Laver la plaque deux fois avec PBS A (200 pl / puits).
  16. Ajouter 50 ul du premier anticorps, un anticorps monoclonal de souris contre la grippe de type A (1: 1000 dans du tampon ELISA) par puits. Incuber à température ambiante pendant 1 heure (ou 4 ° C pendant la nuit), avec agitation.
  17. Laver 3 fois dans 100 pi de tampon de lavage (0,05% de Tween 80 dans du PBS A, v / v) per bien. Incuber à température ambiante pendant 5 min entre les lavages. Sinon, laver 3 fois sans incubation en utilisant 300 pi par puits.
  18. Ajouter 50 ul du second anticorps de chèvre anti-IgG de souris (H + L) conjugué HRP (1: 1000 dans du tampon ELISA) par puits. Incuber à température ambiante pendant 1 h, avec agitation.
  19. Lavez 3 fois comme décrit à l'étape 1.17.
  20. Ajouter le substrat (50 pl / puits). Incuber à température ambiante pendant 30 minutes ou jusqu'à ce que le développement d'une couleur bleue est clairement visible.
  21. Pour arrêter la réaction, laver la plaque deux fois avec 200 pi d'eau distillée par puits, incubation à température ambiante pendant 2 -3 min entre les lavages.
  22. Air-sécher la plaque et l' entreposer dans un endroit sombre (par exemple, l' envelopper dans une feuille d'aluminium).

2. Titration Quantification

  1. Placer une plaque de puits dans la zone de balayage d'un scanner à plat, comme représenté sur la figure 2a. Utilisez la limite de position en forme de L àassurer un emplacement optimal et reproductible imagerie.
    NOTE: Il est possible de l'image deux plaques et en un seul scan.
  2. Numériser une image.
    REMARQUE: Les paramètres sont présentés dans le tableau 2.
  3. Lancez le logiciel "Wellplate Reader" pour calculer la concentration de virus requise (Figure 3).
    1. Cliquez sur le bouton "Charger l'image" pour charger une image. Faites glisser la barre rouge dans l'histogramme de l'onglet "Seuil global" pour régler le seuil d'échantillonnage. Cliquez sur le bouton "Mettre à jour" pour examiner l'effet sur l'image.
    2. Cochez la case "Calculer Neutralisation / Titration". Cliquez sur le bouton "Sampling" pour quantifier l'ICP. Cliquez sur le bouton "Enregistrer" pour enregistrer les résultats de l'échantillonnage lorsque vous êtes invité.
      NOTE: Après le processus d'échantillonnage, une nouvelle fenêtre appelée "Neutralisation & Titration calcul» apparaît automatiquement si la case "Calculer Neutralisation / Titration" est cochée.
    3. Charger ou entrée la définition de la carte bien-plaque. Indiquer le seuil (par exemple, 30%) dans "Titration: Population Virus optimale (%)". Sélectionnez l'onglet "Processus de Titration" pour calculer les résultats de titrage. Vérifiez les résultats de titrage. Cliquez sur le bouton "Enregistrer et fermer" pour enregistrer les résultats de titrage.
      REMARQUE: Se reporter à la complémentaire S1 pour des instructions plus détaillées sur le logiciel. Une copie du logiciel sur mesure est disponible sur demande.
      NOTE: En règle générale, la meilleure dilution de virus pour le dosage de plaque de réduction des rendements autour de 50% (20-85%) ICP de cellules totales dans chaque puits 11.

3. Virus Neutralisation

REMARQUE: Calculer le nombre de plateaux nécessaires à l'essai de neutralisation. Chaque plaque peut accueillir un virus et un certain nombre d'antisérums.

NOTE: En fonction du nombre d'antisérums et le nombre de doublons, une plaque bien peut être mis en place avec ee suivante flexibilités: (1) La dilution du sérum peuvent être disposés le long de chaque ligne ou une colonne (Figure 4). Chaque sérum doit occuper une ligne ou une colonne séparée. (2) L'augmentation de la dilution du sérum est flexible, mais il devrait commencer par la plus forte concentration de sérum dans le coin supérieur gauche d'une plaque. (3) Le nombre de doublons équilibre le nombre d'antisérums. Plus de doublons peuvent aider à lisser les variations expérimentales. (4) Le numéro de la VC et le numéro de la commande de cellule (CC) les doublons sont flexibles, mais ils doivent également être en rangées ou des colonnes distinctes. Il est prévu que le nombre de doubles Vc est significativement supérieure à celle des antisérums.

  1. Préparer la monocouche cellulaire, comme dans les étapes 1,1-1,3, 2 ou 3 jours à l'avance.
  2. Ajouter 50 ul de VGM à chaque puits de la plaque.
  3. Utilisez les colonnes 11 et 12 pour VC et CC, respectivement. Ajouter 50 ul aliquotes de 01h20 enzyme récepteur destruction (RDE) de sérum -Traité à la première rangée (A) de Columns 1-10.
    NOTE: Pour chaque combinaison de virus et le sérum, le dosage est effectué en double exemplaire, donc une plaque peut, par exemple, contenir un virus testé contre cinq antisérums.
  4. Réaliser deux dilutions successives par transfert de 50 ul de la rangée A à la rangée H (colonnes 1 à 10 sur la figure 4) et à rejeter 50 pi de rang H.
  5. Ajouter 50 ul de diluant dans chaque puits de la colonne CC (colonne 12 sur la figure 4).
  6. Ajouter 50 ul de virus dans chaque puits de la plaque, à l' exception de la colonne CC (colonnes 1-11, les lignes AH de la figure 4).
  7. Incuber à 37 ° C pendant 2-3 heures. Retirer l'inoculum. Ajouter le recouvrement (200 ul) à chaque puits. Incuber pendant la nuit à 37 ° C, PAISIBLE. Fixer et tacher les plaques comme pour le titrage du virus (étapes 1.11 à 1.22).

4. Neutralisation Quantification

  1. Placer une plaque de puits dans la zone de balayage d'un scanner à plat, comme représenté sur la Figure 2a. Utilisez la limite de position en forme de L pour assurer un emplacement optimal et reproductible imagerie.
    NOTE: Il est possible de l'image deux plaques et en un seul scan.
  2. Balayez la plaque, comme décrit dans l'étape 2.2.
  3. Lancez le logiciel "Wellplate Reader" pour calculer les titres viraux nécessaires (figure 3, étape 2.3).
    1. Cliquez sur le bouton "Charger l'image" pour charger une image. Faites glisser la barre rouge "Seuil global" pour régler le seuil d'échantillonnage. Cliquez sur le bouton "Mettre à jour" pour examiner l'effet.
    2. Cochez la case "Calculer Neutralisation / Titration". Cliquez sur le bouton "Sampling" pour quantifier l'ICP. Cliquez sur le bouton "Enregistrer" pour enregistrer les résultats de l'échantillonnage lorsque vous êtes invité.
      NOTE: Après le processus d'échantillonnage, une nouvelle fenêtre appelée "Neutralisation & Titration calcul» apparaît automatiquement si la case "Calculer Neutralisation / Titration" est cochée.
    3. Charger ou entrée le bien-pfin carte. Indiquer le seuil (par exemple, 50%) dans "Neutralisation: Infection Déduction (%)."
    4. Sélectionnez "Process Neutralisation" pour calculer les titres. Vérifiez les titres et cliquez sur le bouton "Enregistrer et fermer" pour enregistrer les résultats de neutralisation.
      REMARQUE: Neutralisation est rapportée comme étant l'inverse de la dilution maximale du sérum avec la réduction prédéfinie ICP ( par exemple 50% ou 80%) par rapport à la VC (la moyenne de la colonne 11 sur la figure 4). Une réduction du PCI de 50% a été utilisé dans les résultats représentatifs.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En suivant les procédures ci-dessus, nous présentons quelques résultats de récentes expériences de caractérisation antigénique. La configuration de titrage a été conçu pour examiner huit virus entrée, avec des doubles doubles pour chaque dilution. Les dilutions virales ont été testées entre 1,0 x 10 -1 et 1,0 x 1,0 -6 pour couvrir les variations entre les virus. Les virus d'essai étaient du sous-type H3N2, y compris A / Cameroun / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Moscow / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 /, A / Moscow / 101 / 2015, A / Moscow / 100/2015, A / Moscow / 133/2015 et A / Bratislava / 437/2015. Les résultats de titrage sont illustrés sur la figure 5. La figure 5d illustre la diminution de ICPs avec l'augmentation de la dilution du virus. Les courbes ont été normalisées contre les ICPs des mêmes virus qui ont produit des infections dans toutes les cellules dans un puits 12 (définis comme ICP saturation). Si l'ICP n'a pas atteint la saturation avec le salutghest concentration de virus, la moyenne ICP de doublons correspondant a été utilisé à la place (A / Moscow / 103/2015 Figure 5d). Les dilutions de virus qui ont produit 30% de la saturation ICP ont été choisis comme étant la dilution du virus d'entrée pour la neutralisation (tableau 3).

Neutralisation destiné à avoir un virus d'entrée contre cinq antisérums, avec des doubles doubles sur chaque plaque. Le virus de la référence indiquée est H3N2 A / Stockholm / 63/2015. Les cinq antisérums sont A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Afrique du Sud r2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, et A / néerlandais 525/14 SIAT f23 / 15. Les résultats de neutralisation sont illustrés sur la figure 6. La figure 6d montre l'évolution de l' infection par l'augmentation de la dilution du sérum. La population positif normalisée sur l'axe vertical représente le rapport des PIC de la réponse antisérums correspondante contre l'ICP moyennedu virus de référence 12. Le PCI de base des contrôles de cellules non infectées a été soustraite au cours de la normalisation. Les titres de neutralisation ont été déterminées comme les inverses des dilutions d'antisérum correspondant à 50% de réduction du PCI (tableau 4). L'interpolation linéaire a été utilisé pour estimer les titres tombant entre deux dilutions de sérum adjacentes.

figure-results-1
Figure 1: Exemple d'une configuration bien-plaque dans une expérience de titrage du virus. virus de test sont affectées à des lignes séparées (A à H). Les colonnes sont conçues pour différentes dilutions virales (1 à 12). Deux colonnes ont été utilisés comme des doublons pour chaque dilution virale. Barre d'échelle = 10 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 2: Schéma de principe d' un système de balayage d'échantillon. (A) une plaque à 96 puits sur la position de formation d'image d'un scanner à plat ( à partir republié référence 11 avec la permission de Elsevier BV), et (b) les dimensions de la limite de position en forme de L indiquées dans (a). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-2
Figure 3: Schéma de bureau du logiciel de quantification "Wellplate Reader". S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-3
Figure 4: Exemple d'une configuration bien-plaque dans une expérience de neutralisation. Chaque antisérum est affecté à deux colonnes avec des doubles (1 à 10). Les lignes sont conçues pour différentes dilutions de sérum (A à H). Le contrôle du virus prend la colonne 11, avec huit doubles (A11 à H11). Le contrôle de la cellule est dans la colonne 12, avec huit doubles (A12 à H12). Barre d'échelle = 10 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-4
Figure 5: Résultats d'une expérience de titrage. (A) La mise en place de plaques à puits, (b) scannée bien-plaque image (c) illustrationdu, quantifie, de la population de cellules infectée par un virus couleur codé, et (d) des populations de cellules infectées par le virus normalisés contre les dilutions de virus. 30% ICP a été utilisé comme seuil. Les barres d'erreur dans (d) sont des écarts - types (SD) à partir des duplications de l' échantillon (± 1 SD). Les barres d'échelle en (b) et (c) = 10 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-5
Figure 6: Résultats d'un essai de neutralisation. (A) La mise en place de plaques à puits, (b) image numérisée bien-plaque, (c) illustration de la quantifiée, la population de cellules infectées par le virus, et (d) normalisé population de cellules infectées par le virus contre la dilution de sérum. La vi d'entréerus (VC) est A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP a été utilisée pour calculer les titres. Les barres d'erreur dans (d) sont des écarts - types (SD) à partir des duplications de l' échantillon (± 1 SD). Les barres d'échelle en (b) et (c) = 10 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

S1 supplémentaire: S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

dilution typique
cellules MDCK Cellules MDCK-SIAT1
2 jours 1: 5 (1 + 4) 1:10 (1 + 9)
3 jours 1:20 (1 + 19)
Nombre type de cellules par ml
cellules MDCK Cellules MDCK-SIAT1
2 jours 2 x 10 5 1 x 10 5
3 jours 1 x 10 5 5 x 10 4
1:10 (1 + 9)

Tableau 1: dilutions typiques sur une sous - culture de flacons confluentes de cellules MDCK ou MDCK-SIAT1.

Mode mode professionnel
Type de document Film (avec guide Area Film)
Type d'exposition automatique photo
Je suisType d'âge 24 bits couleur
Résolution 1200 dpi
Saved Image Format TIFF

Tableau 2: configuration typique d'un scanner à plat.

Rangée Virus dilution recommandée
UNE A / Cameron / 15V-3538/2016 1,0 x 10 -2
B A / Vladivostok / 36/2015 1,0 x 10 -3
C A / Moscow / 103/2015 1,1 x 10 -1
ré A / Tomsk / 5/2015 5,9 x 10 -1
E A / Moscow / 101/2015 8,3 x 10 -1
F A / Moscow / 100/2015 1,4 x 10 -2
g A / Moscow / 133/2015 1,3 x 10 -2
H A / Bratislava / 437/2015 1,3 x 10 -4

Tableau 3: dilutions virales calculées à partir d' une population de 30% ICP.

Colonne Antisérums titre recommandée
1 - 2 A / HK4801 / 2014 110
3 - 4 A / HK7295 / 2014 213,3
A / Afrique du Sud / r2665 / 2015 2155,8
7 - 8 A / Suisse / 9715293/2013 89,4
9 - 10 A / Pays-Bas / 525/2014 78,6

Tableau 4: Les titres à 50% ICP de A / Stockholm / 63/2015 contre antisérums.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, nous avons décrit un essai à base de MN de formation d'images pour quantifier les relations réelles entre les antigènes des virus. Par rapport à d'autres essais plaque de réduction, la méthode met l'accent sur la mesure de l'ICP de l'ensemble d'un puits, d'assurer la couverture complète de la population infectieuse. Son indépendance de la formation de plaques élargit également l'application de l'analyse des virus qui peuvent former de petites plaques essentiellement invisibles ou qui ne peuvent gérer l'infection à cellule unique. Par conséquent, le dosage est capable d'examiner plus de virus et les effets d'une plus large gamme d'anticorps que HI, et il aide à réfléchir de façon plus complète les similitudes ou les différences entre les virus 12 antigéniques. Par exemple, lorsque le carboxylate d'oseltamivir est inclus, le dosage de la MN est moins affecté par la liaison NA-dépendante, ce qui reflète les différences antigéniques avec plus de précision. Au cours du développement du dosage, de grands efforts ont été faits pour améliorer l'uniformité de l'expérience, la vitesse et la détectionsensibilité, y compris en contrôlant les virus d'entrée par titration quantifiée, imagerie à haut débit avec un scanner à plat, et mettre en œuvre une plate-forme de traitement de données conviviale. Les résultats ont été généralement conformes et confirmé ceux de HI. Notamment, les résultats ont également révélé des différences antigéniques entre les variantes de dérive antigénique des virus récents de type A et vaccin B, ainsi que des changements antigéniques causés par la culture sélectionnée ou sporadiques changements, tels que la substitution de G155E en HA1 de certains (H1N1) virus A de pdm09 12.

Le protocole correspond au type ou sous-type du virus de la sélection des lignées cellulaires qui ont donné l'infection la plus forte, ce qui a grandement amélioré le signal d'imagerie. variation expérimentale a été lissée à la conception des doublons qui balance avec le nombre d'antiserums testés. Les incertitudes peuvent également provenir de la qualité d'image, qui est principalement influencée par le dispositif d'imagerie. Une couleur scanner à plat décent peut signitivement améliorer le contraste de l'image et de réduire le bruit. La quantité de virus d'entrée dans la neutralisation doit être déterminée quantitativement à l'avance de la titration correspondante tandis que les virus conservent encore un statut similaire. Lors de la neutralisation, la réaction de l'antisérum à une infection est normalisée sur la différence entre le virus de référence (VC) et le niveau d'arrière-plan (CC). Des mesures précises de VC et CC sont essentiels à une expérience de neutralisation. Plus de doublons sont recommandés (huit doublons ont été utilisés dans les résultats représentatifs). Enfin, la compréhension du logiciel est essentielle à la réussite d'une expérience. Le logiciel a été testé pour la caractérisation des virus de routine dans le Centre de la grippe de l'OMS, au Royaume-Uni depuis plus de deux ans. Les instructions détaillées pour faire face à diverses situations est fourni dans le S1 supplémentaire.

Cet essai de MN est adapté pour des applications où les échantillons couvrent un posteremely grand champ de vision, mais ne nécessitent que la résolution d'imagerie modérée. Le faible coût et de configuration simple rendent le système facilement accessible à la plupart des laboratoires de virologie. La variation des mesures du même échantillon était inférieure à 3%, ce qui définit à peu près l'incertitude introduite au cours du balayage 11. Cette reproductibilité est suffisante dans de nombreuses études virologiques et peut encore être réduit en faisant la moyenne des images à partir de plusieurs scans.

En conclusion, cette étude démontre un essai de MN robuste qui peut être utilisée en routine dans l'étude antigénique et de soutenir des données HI dans des analyses détaillées de ce moment-virus grippaux en circulation, notamment pour la sélection bisannuelle des virus pour l'inclusion dans les vaccins de la grippe humaine.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs remercient le Dr M. Matrosovich d’avoir fourni les lignées cellulaires MDCK et MDCK-SIAT1 parentes et Roche Pharmaceuticals d’avoir fourni le carboxylate d’oseltamivir. Nous remercions également la Dre Anne Weston pour ses précieuses suggestions sur le manuscrit. Cette étude a été tributaire de la précieuse collaboration des centres nationaux de lutte contre la grippe de l’OMS et des centres nationaux de lutte contre la grippe de l’OMS au sein du GISRS de l’OMS, qui ont fourni les virus grippaux utilisés. Ces travaux ont été financés par le Conseil de la recherche médicale dans le cadre du Programme U117512723.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
VGMSigmaD6429, P0781500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb
PBS ANature pH Phosphate salin : NaCl 10  ; g, KCl 0,25  ; g, Na2HPO4 1,437 g, KH2PO4 0,25 g et Dist. Eau 1 L.
AvicellFMCRC-581F2,4 g dans 100 ml d’eau distillée dissoute par agitation sur un agitateur magnétique pendant 1 h. Stériliser par autoclavage.
2x DMEMGibco  ;21935-028
TrypsineSigmaT1426
Overlay (10 ml/plaque) :5 ml 2x DMEM, Trypsine 2  ; &mu ; g/ml de concentration finale, Avicell 5  ; ml
Triton X- 100eSigma  ;T8787Tampon de perméabilisation : 0,2 % dans PBS A (v/v)
Tween 80SigmaP5188Tampon de lavage : 0,05 % Tween 80 dans PBS A (v/v)
Sérum de chevalPAA Labs LtdB15-021Tampon ELISA : 10 % dans PBS A (v/v) + 0,1 % Tween 80
Anticorps antigrippaux de souris de type ABioradMCA 4001st 1:1 000 in ELISA Buffer
Goat anti-souris IgG (H+L) HRP conjuguéBiorad172-10112nd Anticorps : 1:1 000 in ELISA
Buffer True Blu peroxidasesubstrate KPL  ;50-78-02Substrat : Bleu véritable +0,03 % H2O2g (1:1 000 de solution à 30 %)
Plaques de microtitrage à fond plat à 96 puitsCostar  ;3596
Laveuse et collecteur de plaques multiparois 8 canauxSigmaM2656
PerfectionEpsonV750 ProLe logiciel d’imagerie peut être téléchargé gratuitement à partir de http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134& ; infoType=Téléchargements.
Environnement d’exploitation logiciel : LabVIEWNational Instruments CorporationBasé sur Windows avec NI Vision BuilderVersion : LabVIEW2012 ou supérieur
Scanner de plaques

Références

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Mots-clés

Micro neutralization AssayInfluenza VirusVirus TitrationAntibody NeutralizationAntiviral ActivityFlatbed Scanner ImagingHigh throughput ImagingViral Antigenic StudiesVirus DilutionInfected Cell Population

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