Article de méthode

Etude de réticulum endoplasmique et mitochondries Interactions par In Situ Proximité Ligation Assay dans des cellules fixes

DOI :

10.3791/54899

⸱

10 décembre 2016

 , 
1Lund University Diabetes Centre, Lund University, 2INSERM UMR-1060, CarMeN Laboratory, Lyon 1 University, INRA U1235, INSA of Lyon, Rockefeller and Charles Merieux Lyon-Sud Medical Universities

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous décrivons une procédure pour visualiser et de quantifier avec une grande sensibilité les interactions endogènes entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries dans les cellules fixes. Le protocole optimisé comprend un essai de ligature de proximité in situ dans le ciblage de l'inositol 1,4,5-triphosphate récepteur / protéine régulée par le glucose 75 / D complexe canal anionique / cyclophiline dépendant de la tension à l'interface de la membrane associée à la mitochondrie.

Résumé

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Les interactions structurelles entre les membranes réticulaires endoplasmiques (RE) et mitochondriales, dans des domaines connus sous le nom de membranes associées aux mitochondries (MAM), sont des plaques tournantes cruciales pour la signalisation cellulaire et le destin cellulaire. En particulier, ces sites de contact inter-organites permettent le transfert du calcium du RE vers les mitochondries par le biais du complexe de canalisation calcique du canal anionique voltage-dépendant (VDAC)/protéine 75 régulée par le glucose (GRP75)/récepteur de l’inositol 1,4,5-triphosphate (IP3R). Bien que ce compartiment subcellulaire fasse l’objet d’études intensives dans des conditions physiologiques et pathologiques, il n’existe aucune méthode simple et sensible pour quantifier la quantité endogène de contact entre les mitochondries du RE dans les cellules. De même, les MAM sont des structures hautement dynamiques, et il n’existe pas d’approche appropriée pour suivre les modifications des interactions ER-mitochondries sans surexpression des protéines. Ici, nous rapportons un protocole optimisé basé sur l’utilisation d’un test de ligature de proximité in situ pour visualiser et quantifier les interactions endogènes ER-mitochondries dans des cellules fixes en utilisant la proximité étroite entre les protéines de la membrane mitochondriale externe (VDAC1) et de la membrane ER (IP3R1) à l’interface MAM. Des expériences similaires de ligature de proximité in situ peuvent également être réalisées avec les paires d’anticorps GRP75/IP3R1 et cyclophiline D/IP3R1. Ce test offre plusieurs avantages par rapport aux autres procédures d’imagerie, car il est très spécifique, sensible et adapté aux tests multi-conditions. Par conséquent, l’utilisation de ce test de ligature de proximité in situ devrait être utile pour mieux comprendre les régulations physiologiques des interactions RE-mitochondries, ainsi que leur rôle dans des contextes pathologiques.

Introduction

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Mitochondrie et le réticulum endoplasmique (ER) ne sont pas indépendants dans les organites de la cellule, mais ils interagissent structurellement et fonctionnellement au niveau des sites de contact définis comme membranes du réticulum endoplasmique mitochondries-associés (MAM). En effet, MMA propres correspondent à des régions où les membranes du RE et les mitochondries sont étroitement apposés, ce qui permet des interactions entre les protéines des deux côtés. Néanmoins, les membranes de ces organites ne fusionnent pas dans ces régions, de sorte qu'ils maintiennent leurs entités distinctes. Les jouent un rôle MMA propres crucial dans le calcium (Ca 2+) e....

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Protocole

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1. Préparation des solutions

  1. Préparer 10% de formaldehyde dans du PBS (faible teneur en sel) en diluant 5,5 ml de formaldéhyde à 37% dans 14,5 ml de PBS. Préparer glycine 1 M, pH 8,0, en dissolvant 3,8 g de glycine dans 50 ml de PBS; diluer cette solution pour obtenir la glycine 100 mM dans PBS 1x.
  2. Préparer 0,1% de Triton-X100 dans PBS 1x. Préparer 20x Saline citrate de sodium (SSC) en utilisant 3,0 M de chlorure de sodium et 0,30 M de citrate trisodique préparé dans un tampon d'eau déminéralisée avec un pH de 7,0 à 25 ° C. Diluer ce tampon à 1x et 0,01x en utilisant de l'eau déminéralisée.

2. Fixation de ....

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Résultats

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Sur la base de notre expérience en utilisant ce protocole, nous pouvons recommander en toute sécurité de cette méthode pour la visualisation et la quantification des interactions ER-mitochondries dans les cellules fixes. Des images représentatives de à proximité ligature interactions in situ de dosage-visualisées ER-mitochondries dans la lignée cellulaire HuH7 d'hépatocarcinome, en utilisant plusieurs paires d'anticorps, sont présentés. Comme on le voit sur la f.......

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Discussion

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Collectivement, nos études indiquent que le test de ligature de proximité in situ est vraiment une stratégie pertinente pour suivre et quantifier les interactions endogènes ER-mitochondries dans les cellules fixes, sans avoir besoin d’utiliser des fluorophores spécifiques aux organites ou des protéines fluorescentes. L’utilisation spécifique des anticorps VDAC1/IP3R1 a été adaptée pour étudier les interactions ER-mitochondries dans les cellules HuH7. Cependant, d’autres isoformes de VDAC et d’IP3R peuvent être u.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Nous remercions toutes les personnes dans notre laboratoire qui ont contribué à optimiser et de valider le protocole. Ce travail a été soutenu par l'INSERM et l'agence nationale de la recherche (ANR-09-JCJC-0116 ET ANR-11-BSV1-033-02). ET a été soutenu au cours de sa thèse par une bourse de recherche du ministère français de l'enseignement supérieur et de la recherche.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
FormaldéhydeSigmaF-8775
GlycineSigmaG-8898
TritonSigmaT8532
35 mm Plats de culture à fond de verreMatTeK corporationP35G-0-14-C
Solution de blocageSigmaDUO-92004 ou DUO-92002fournie dans les sondes PLA Duolink, anticorps Sigma
VDAC1Abcamab14734
IP3R1-H80 anticorpsSanta Cruzsc28614
Anticorps CypDAbcamab110324
Grp75 anticorpsSanta Cruzsc13967
TBS 10xeuromedexET220Diluer pour obtenir 1x
Tween 100xeuromedex2001-Bdiluer dans TBS pour obtenir 0,01 %
Sondes PLA Souris MINUSSigmaDUO-92004Duolink, Sigma
Sondes PLA Rabbit PLUSSigmaDUO-92002Duolink, Sigma
Duolink réactifs de détection rougeSigmaDUO-92008Duolink, Sigma
Solution de ligatureSigmaDUO-92008Fait partie des réactifs de détection Duolink rouge, Sigma
LigaseSigmaDUO-92008Fait partie des réactifs de détection Duolink rouge, Sigma
Amplification solutionSigmaDUO-92008Fait partie des réactifs de détection Duolink rouge, Sigma
PolymeraseSigmaDUO-92008Fait partie de la gamme Réactifs de détection Duolink rouge, Sigma
Duolink MediumSigmaDUO80102Duolink, Sigma
Softwares
BlobFinderest un logiciel distribué gratuitement qui permet d’effectuer des calculs sur des cellules à partir d’images de microscopie à fluorescence. Ce logiciel peut être téléchargé gratuitement auprès du Centre d’analyse d’images de l’Université d’Uppsala, qui a développé le logiciel et dont le travail a été soutenu par le projet ENLIGHT du 6e PC de l’UE et Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
logicielpeut être téléchargé gratuitement à partir de : http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
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Références

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  1. Bravo-Sagua, R., et al. Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).
  2. Giorgi, C., et al.

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Mots-clés

Interactions r ticulum endoplasmique mitochondriesmembranes associ es aux mitochondriescomplexe VDAC1 IP3R1imagerie sur cellules fix esprotocole de dosage de ligation de proximitquantification des contacts r ticulum endoplasmique mitochondriescomplexe de canalisation du calciumpaire GRP75 IP3R1cyclophiline D IP3R1

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