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Article de méthode

Quantification histologique chronique Infarctus du myocarde chez le rat

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DOI :

10.3791/54914

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11 décembre 2016

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1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg

Dans cet article

Résumé

L’évaluation post-mortem de l’infarctus du myocarde (IM) chez les rongeurs est basée sur la quantification de l’infarctus sur des coupes cardiaques colorées. Nous décrivons une méthode précise pour quantifier la taille de l’infarctus en utilisant un échantillonnage systématique de cœurs de rats récoltés de la base à l’apex et des analyses d’images de coupes histologiques colorées en trichrome.

Résumé

L’infarctus du myocarde est défini comme la mort des cardiomyocytes due à une ischémie prolongée ; une réponse inflammatoire et la formation de cicatrices (fibrose) suivent la lésion ischémique. Après la phase aiguë initiale, le remodelage chronique du ventricule gauche (VG) modifie la structure et la fonction du cœur. La ligature coronarienne permanente chez les petits animaux a été largement utilisée comme modèle de référence pour un modèle chronique d’infarctus du myocarde. L’évaluation histologique de la taille de l’infarctus est couramment effectuée ; Néanmoins, il n’y a pas de standardisation des méthodes de quantification. En effet, des aspects méthodologiques importants, tels que le nombre de sections analysées et les méthodes d’échantillonnage et de quantification, ne sont généralement pas décrits et empêchent donc toute comparaison entre les enquêtes. Trop souvent, la quantification est réalisée sur une seule section obtenue au niveau des muscles papillaires. Étant donné que de nouvelles stratégies visant à réduire l’expansion et le remodelage de l’infarctus sont à l’étude, il est important de normaliser des protocoles précis de prélèvement cardiaque. Nous décrivons une méthode précise pour quantifier la taille de l’infarctus à l’aide d’un échantillonnage systématique du cœur de rat récolté et d’analyses d’images de coupes histologiques colorées trichromatiques obtenues de la base à l’apex. Nous fournissons également des preuves que le calcul de l’indice d’expansion (EI) a permis d’évaluer la taille de l’infarctus, en tenant compte des changements du ventricule gauche tout au long du remodelage.

Introduction

L'infarctus du myocarde (MI) est une cause majeure de décès et d'invalidité dans le monde entier. La maladie coronarienne est la principale cause; MI résulte d'une ischémie coronarienne consécutive à des événements tels que l'occlusion. Lorsque reperfusion est pas effectuée dans les 6 premières heures, l'ischémie induit une nécrose myocardique irréversible. Chez les patients, la caractérisation des MI repose sur différents outils de diagnostic, y compris les signes cliniques, l' électrocardiographie, l' évaluation des niveaux plasmatiques de biomarqueurs, l' échocardiographie, l' imagerie IRM, et des analyses histologiques 1. MI aiguë et chronique sont classés comme deux phases différentes de blessures selon le calendrier de la nécrose myocardique par rapport au temps de l'occlusion coronaire. La phase aiguë, survenant pendant les 7 premiers jours, est associée à la perte de cardiomyocytes, une inflammation généralisée, et le recrutement de fibroblastes. La phase subaiguë, caractérisé par cicatrisation du tissu cardiaque et la formation d'une cicatrice, surviententre 1 et 4 - 6 semaines. Expansion de l'infarctus, paroi du ventricule amincissement, et le ventricule dilatation caractérisent la phase chronique. Remodelage extensif du ventricule gauche entraîne progressivement une insuffisance cardiaque sévère 2.

MI induite par artère descendante antérieure gauche permanente (LAD) ligature représente le modèle standard pour rongeurs d'infarctus du myocarde chronique. Les ligatures imite coronaires l'occlusion coronaire. La taille de l'infarctus dépend du site de la ligature. Caractérisation de la lésion ischémique du myocarde chez un modèle de rongeur est réalisée de façon classique en utilisant les taux plasmatiques des marqueurs biologiques tels que la troponine I et T 3 échocardiographie, l' IRM et l' histologie 4,5. les niveaux de biomarqueurs sont corrélés avec le degré de cardiomyocytes mort. Échocardiographie évalue la gauche altération de la fonction ventriculaire résultant d'anomalies de mouvement de la paroi régionales. En outre, les techniques d'imagerie non invasives, telles que l'IRM à haute résolution ouéchocardiographie, permet l'évaluation de la réduction du mouvement de la paroi, le volume de la zone de cicatrice réduite et la perfusion myocardique viable et l'amincissement de la paroi. dimensions LV permettent l'évaluation précise de la taille de l'infarctus. Enfin, la quantification du myocarde viable et morte peut être effectuée en utilisant des taches spécifiques post-mortem de coupes histologiques de coeurs récoltés et permet de vérifier la taille de l'infarctus (IS). Une autre caractéristique importante est l'évaluation de l'indice d'expansion de l' infarctus (IE) 6. L'assurance-emploi est associé à l'infarctus transmural et commence dans les 3 premiers jours. L'assurance-emploi est caractérisé par une réduction progressive de l'épaisseur de paroi, une augmentation de la taille de la cavité LV, et les changements qui en découlent dans la forme de LV.

Afin d'évaluer l'efficacité thérapeutique des nouveaux traitements - en particulier, les stratégies de régénération basée sur des cellules, des matrices, et le gène évaluation de la prestation-précise de MI chez les rongeurs est d'une importance primordiale.Lorsqu'elle est mesurée sur une section transversale unique obtenue au niveau du muscle papillaire, la taille IS peut être biaisée en raison de la grande variabilité qui existe dans le développement des infarctus après ligature LAD; l'infarctus apex pourrait alors être occultée. Fait important, des méthodes plus précises à la taille MI déterminée ont été décrits pour les souris ou les rats 7-9 10. Néanmoins, IS est insuffisante pour quantifier avec précision le remodelage du VG ou des réductions thérapeutiquement induites (ou empêchements) du remodelage. En effet, IS est généralement exprimée en pourcentage du volume de LV totale évaluée sur des coupes transversales du coeur. Bien que cette méthode est valable pour l' IM aigu, l'amincissement de la paroi de LV se produisant pendant le remodelage reste sous-évalué 11,12. Une quantification morphométrique complète de la taille de l'infarctus et des changements structurels devrait quantifier plusieurs paramètres, tels que la longueur endocardique et épicardique et de diamètres, ainsi que des infarctus et des zones saines. Nous décrivons une appr méthodologiqueoche d'évaluer avec précision MI et le remodelage dans un modèle de rat chronique.

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Protocole

Tous les animaux ont reçu des soins humains en conformité avec la Convention européenne de protection des animaux. Les interventions chirurgicales ont été réalisées conformément à la loi suisse sur la protection des animaux après avoir obtenu l'autorisation de l'Office vétérinaire de l'Etat, Fribourg, approuvé par l'Office vétérinaire fédéral, Suisse.

1. Coeur de récolte

REMARQUE: Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie isoflurane. Des efforts ont été faits pour diminuer la souffrance animale. En particulier, tous les animaux ont reçu une injection sous-cutanée de 0,1 mg / kg de buprénorphine pré-anesthésie. Le protocole chirurgical pour introniser un infarctus du myocarde a été précédemment décrit ailleurs 13.

  1. Effectuer une sternotomie sur un animal myocardially infarci sous anesthésie (animal intubé, 2,5% d'isoflurane, l'anesthésie appropriée confirmée par la patte de pincement réflexe).
    1. Ouvrez l'animal en coupant la peau et les musclesavec des ciseaux chirurgicaux. Couper les nervures sur la gauche et à droite, puis retirez la poitrine.
    2. Retirez les adhérences qui restent après la chirurgie antérieure (LAD de ligature). Couper l'aorte et retirer le cœur. Mettez le tissu dans 1 M KCl (dans du PBS), puis le laver avec du PBS.

2. Préparation des tissus

  1. Mettez le cœur infarci longitudinalement dans une matrice de coeur de rat acrylique. Gardez-le à -20 ° C pendant 1 heure.
  2. Couper le coeur directement dans la matrice à l'aide d'une lame de rasoir avec une sécante. Veiller à chaque tranche est de 2 mm d'épaisseur. Couper environ 5-7 diapositives pour chaque coeur (en fonction du niveau de remodelage); ce qu'on appelle l'échantillonnage systématique.
  3. A ce stade, effectuer la coloration chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium de (TTC) est facultatif (conserver l'orientation des tranches cardiaques base-apex).
    1. Incuber à 1% dans du PBS CTT pendant 50 min à 37 ° C. Incuber dans 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 20 min à 1 h. Mettez les sections between deux plaques de verre avec 2 mm d'écartement et de prendre des photos avec un microscope stéréologique couplé avec un appareil photo à un grossissement 15X.
      PRUDENCE! Paraformaldéhyde est toxique.
  4. Glisser congélation (1 er choix)
    1. Mettre chaque lame dans un moule en plastique (10 x 10 x 5 mm) avec un milieu pour Cryotomie (température de coupe optimale, EAO) de montage, de maintenir l'orientation (placer le côté de sommet orienté de la section vers le bas sur le fond du moule). Congeler les blocs avec les vapeurs 2-méthylbutane sous azote liquide de refroidissement pendant 10 - 15 min. Enfin, stocker le tissu à -80 ° C.
  5. Paraffinization (2 e en option)
    1. Placer chaque lame dans l'intégration des cassettes (maintenir l'orientation en plaçant le côté orienté vers le sommet, de la section vers le bas sur le fond de la cassette), puis dans 4% de PFA pendant 24 heures. Mettez-le dans une machine pendant la nuit du processeur de tissus.
      1. Incuber dans de l'éthanol à 70% pendant 2 heures. Incuber dans ethanol 95% pendant 2 heures. Incuber dans de l'éthanol à 100% pendant 3 h. Incuber dans du xylol pendant 4 heures. Incuber dans de la paraffine (fondu à 60 ° C dans un four) pendant 5 heures. Enfin, faire des blocs en intégrant chaque diapositive de coeur dans de la paraffine.

3. Masson-Goldner trichrome Coloration

  1. Faire des coupes de tissus provenant des blocs de paraffine avec un microtome manuel (épaisseur: 5 pm) ou à partir de blocs d'OCT avec un cryostat fixé à -18 ° C (épaisseur: 7 pm).
  2. Colorer une diapositive de chaque partie de coeur pour chaque rat (3 - 4 sections transversales par diapositive) avec Masson-Goldner trichrome coloration (voir annexe).
    REMARQUE: à partir de cette étape pour les sections de paraffine.
    1. Faire fondre les lames à 60 ° C dans un four. Sous une hotte, Déparaffiner eux xylol deux fois pendant 10 minutes chacun. Réhydrater dans 100% d'éthanol, 95% d'éthanol, 70% d'éthanol et de l'eau distillée pendant 3 min à chaque fois.
      REMARQUE: à partir de cette étape pour le cryosections.
    2. Fixez-Bouin solution du jour au lendemain. Ensuite, rincez-les dans de l'eau du robinet pendant 10 - 15 min. Rincez-les dans de l'eau distillée. Incuber eux dans l'hématoxyline de Mayer pendant 3 min.
    3. Retirez les diapositives et les laisser dans l'eau distillée pendant 5 min. Ensuite, les incuber dans de l'acide Fuchsine-Ponceau pendant 5 min. Rincer dans de l'acide acétique à 1% pendant 1 min.
    4. Ensuite, les incuber dans de l'acide phosphomolybdique Orange G pendant 1 min. Rincez-les dans de l'acide acétique à 1% pendant 1 min, les incuber dans la teinture vert clair pendant 10 minutes, et rincez-les dans de l'acide acétique à 1% pendant 1 min.
    5. Déshydrater dans 70% d'éthanol (30 s), 95% d'éthanol (30 s) et 100% d'éthanol (5 min). Mettre une goutte d'un milieu de montage résineux sur les coupes de tissus, les couvrir avec des lamelles, et les laisser sécher.

4. Infarctus Analyse de la taille

  1. Acquérir une image de chaque diapositive sur un stéréomicroscope (grossissement 15X) couplé avec un appareil photo. Photographie d'une règle avec le même réglages.
  2. Utiliser un logiciel d'analyse d'image pour mesurer l'épaisseur de la cicatrice au milieu de l'infarctus, l'épaisseur de la cloison, le ventricule gauche (VG), la zone de cavité, la zone de l'infarctus et de la zone de tissu à l'aide de LV.
    1. Réglez l'échelle avec l'image de la règle (figure 1A).
      1. Cliquez sur Mesures puis sélectionnez Conversion Factor Set. Tracez une ligne sur la barre d'étalonnage. Faites un clic droit sur l'image et cliquez sur Terminer le calibrage. Notez la valeur de la barre, puis cliquez sur OK.
    2. Sélectionnez le LV de l'image du cœur teinté (figure 1B). Utilisez l'outil multiple de segment. Sélectionnez le point par point LV, et cliquez ensuite à droite Copier / Coller partout.
    3. Mesurer l'épaisseur de la cicatrice et le septum en utilisant l'outil de mesure du seul segment (figure 1C ).
    4. Détecter automatiquement la LV cavité, Infarctus, et les zones BT en utilisant l'outil de mesure de la zone automatique en mode RGB (figure 1D).
      1. Cliquez sur l'outil. Activer seulement les frontières et Contigu en mode RVB. Enfin, cliquez dans la zone d'intérêt pour le détecter. Si nécessaire, utiliser des outils de précision.
  3. Calculer la taille de l'infarctus comme étant le rapport de la zone de l'infarctus dans la zone basse tension.
  4. Calculer l'indice d'expansion comme suit: [LV zone de cavité / surface entière LV] / [épaisseur de l'infarctus / épaisseur de la cloison], avec toute la surface LV comprenant à la fois de la cavité VG et des zones de tissu BT.
  5. Enfin, calculer une "moyenne" pour chaque coeur comme suit: [moyenne de l'indice d'expansion des diapositives infarcis] * [Nombre de diapositives infarcis / Nombre total de diapositives].

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Résultats

Six semaines après la ligature LAD, les cœurs ont été récoltées à partir de rats Lewis. coupes de tissus de 2 mm ont été obtenus à partir de l'apex à la base. Une procédure de coloration TTC a été réalisée pour visualiser la zone de l' infarctus, qui apparaît en blanc, et le myocarde sain, qui apparaît en rouge (Figure 2). Selon le site de la ligature de la LAD, la taille de l'infarctus varie. Pour les grands MI, Infarctus transmural ont été observées du somm...

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Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

tissu fibrotique peut être évalué avec précision dans un modèle de rat MI chronique en utilisant l'échantillonnage systématique du cœur et de l'image récoltées analyses de coupes histologiques trichromatiques tachés obtenus de la base à l'apex. Deux étapes sont particulièrement importantes pour la mise en oeuvre du protocole de succès. Tout d'abord, l'utilisation de KCl pour le coeur la récolte permet au muscle cardiaque...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

L’étude a été soutenue par le Fonds national suisse [FNS 310030-149986 à MNG], l’Université de Fribourg et l’Hôpital de Fribourg.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matrice cardiaque de rat acrylique 2 mm72-5015Harvard Appartus
Inspira ventilateur avancé à volume contrôléHarvard Apparatus557058
Catheter Insyte 14 GBD381267
O.C.TBDHA361603EVWR
TTCT8877-10GSigma Aldrich
Mayer hématoxylineMHS32-1LSigma Aldrich
Acide Fuchsin
CI 42685		F8129-50GSigma Aldrich
Ponceau Xylidin
CI 16150		P2395-25GSigma Aldrich
Orange G
CI 16230		O3756-100GSigma Aldrich
Vert clair
CI 42095		L5382-25GSigma Aldrich
KClP9333-500GSigma Aldrich
Xylol10315083HoneyWell
Éthanol absolu10303990HoneyWell
2-méthylbutaneM32631-1LSigma Aldrich
Microscope stéréographiqueSM2800Nikon
Formaldehyde99340Reactolab
Cassette d’enrobageK113.1Carl Roth
Bersoft Logicield’image Bersoft.comLogiciel sous licence
de mesure

Références

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