Article de méthode

Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge

DOI :

10.3791/54934

⸱

24 février 2017

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le stress mécanique peut induire la différenciation chondrogénique des cellules souches, fournissant une approche thérapeutique potentielle pour la réparation du cartilage altéré. Nous présentons un protocole pour induire la différenciation chondrogénique des cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) en utilisant la gravité centrifuge (CG). La régulation positive de SOX9 induite par CG entraîne le développement de phénotypes chondrogéniques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cartilage altéré ne peut pas guérir naturellement. Actuellement, la thérapie la plus avancée pour les défauts du cartilage est la transplantation de chondrocytes différenciés des cellules souches à l’aide de cytokines. Malheureusement, la différenciation chondrogénique induite par les cytokines est coûteuse, prend du temps et est associée à un risque élevé de contamination lors de la différenciation in vitro. Cependant, les stimuli biomécaniques servent également de facteurs régulateurs cruciaux pour la chondrogenèse. Par exemple, le stress mécanique peut induire une différenciation chondrogénique des cellules souches, suggérant une approche thérapeutique potentielle pour la réparation du cartilage altéré. Dans cette étude, nous avons démontré que la gravité centrifuge (CG, 2 400 × g), une contrainte mécanique facilement appliquée par centrifugation, induisait la régulation positive de la région déterminante du sexe Y (SRY)-box 9 (SOX9) dans les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC), les amenant à exprimer des phénotypes chondrogéniques. Les ASC centrifugés ont exprimé des niveaux plus élevés de marqueurs de différenciation chondrogéniques, tels que l’aggrécan (ACAN), le collagène de type 2 alpha 1 (COL2A1) et le collagène de type 1 (COL1), mais des niveaux plus faibles de collagène de type 10 (COL10), un marqueur des chondrocytes hypertrophiques. De plus, la formation d’agrégats chondrogéniques, condition préalable à la chondrogenèse, a été observée dans les ASC centrifugés.

Introduction

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Des défauts dans le cartilage articulaire ne guérissent pas naturellement. Par conséquent, transplantation de cellules souches a été proposée comme une approche prometteuse pour la réparation d'altération du cartilage. Cependant, cette méthode nécessite à la fois l'acquisition d'un nombre suffisant de cellules souches et l'induction de ces cellules à subir une différenciation chondrogénique. La moelle osseuse (BM) a été largement utilisé en tant que source de cellules souches, mais l'isolement des cellules de BM présente deux inconvénients majeurs: le rendement de propagation et insuffisante. En raison de sa facilité d'acquisition, le tissu adipeux est une source de cellules souches préférables. Des études antérieures ont démontré la faisabilité d'isoler des cellules souches du tissu adipeux et d' induire la différenciation chondrocytaire dans ces cellules en utilisant des cytokines, telles que le TGF-β1 1, 2. Ces méthodes sont efficaces mais coûteux.

Comme une alternative moins coûteuse aux cytokines, une contrainte mécanique peut être utilisé pourinduire la différenciation chondrogénique. Chargement mécanique joue un rôle essentiel dans le maintien de la santé du cartilage articulaire 3, et elle peut induire des phénotypes chondrogéniques dans différentes cellules. Par exemple, la pression hydrostatique induit des phénotypes chondrogéniques dans les cellules progénitrices dérivées de la synoviale par la voie de la MAP kinase / JNK 4, et une compression mécanique induit une chondrogenèse dans des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) , par la régulation positive des gènes 5 chondrocytes. En outre, la contrainte de cisaillement contribue à l'expression liée chondrogenèse matrice extracellulaire (ECM) dans les cellules souches mésenchymateuses humaines 6. Gravité centrifuge (CG), une contrainte mécanique facilement appliquée et contrôlée générée par centrifugation, peut induire l' expression différentielle des gènes dans les cellules 7. Par exemple, dans des cellules de carcinome de l' épithélium du poumon, l'expression de l' interleukine (IL) -1 ter est régulée positivement par centrifugation 8. Tinsi, en tant que contrainte mécanique expérimentalement inductible, CG peut être utilisé pour induire l'expression du gène chondrocytaire dans les cellules souches. Cependant, il reste difficile de savoir si CG peut induire la différenciation chondrogénique des cellules souches.

Dans cette étude, nous avons constaté que CG a induit la surexpression de SOX9, un régulateur de maître de chondrogenèse en ASCs humains, ce qui entraîne la surexpression des gènes chondrocytes. De plus, nous avons comparé les effets de la CG sur la chondrogenèse avec celles du TGF-β1, le facteur de croissance les plus couramment utilisés pour induire une chondrogenèse in vitro dans des cellules souches.

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Protocole

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Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC16EAME0162) et réalisée selon les directives du NIH. Tous les tissus ont été obtenus avec le consentement éclairé par écrit.

Chargement 1. centrifuge Gravité et Pellet Culture

  1. La culture cellulaire et la récolte
    1. ASCs de culture (P2-P3; voir la liste des matériaux) dans Modifié Moyennement bas de glucose de Eagle Dulbecco (DMEM-LG) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2.
    2. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, éliminer le milieu et laver les cellules avec 5 ml de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    3. Ajouter 1 ml de PBS contenant de l' EDTA 1 mM et on incube pendant 2 min à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2.
    4. Appuyez sur la plaque de culture doucement, ajouter 4 ml de milieu frais, transférer les cellules àun tube conique de 15 ml et centrifuger les cellules à 250 xg pendant 2 minutes à la température ambiante (TA).
  2. Centrifuge chargement gravitaire
    1. Après centrifugation (étape 1.1.4), retirer le surnageant sans perturber le culot et resuspendre le culot dans 10 ml de DMEM-LG avec 10% de FBS. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
    2. CG pour le chargement, transférer 2,5 x 10 5 cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml et on centrifuge à 2400 x g pendant 15 min.
  3. culture Pellet
    1. Immédiatement après la centrifugation, Aspirer le surnageant et ajouter 500 ul de milieu de différenciation chondrogénique définie (MDP-DMEM riche en glucose supplémenté avec 1% de FBS, 1% de ITS + Prémix, 100 nM de dexaméthasone, d'une solution d'acides aminés 1 x MEM non essentiels, 50 pg / ml de L-proline, et 1% de pénicilline / streptomycine). Ajouter 50 pg / ml fraîchement préparée de l'acide L-ascorbique 2-phosphate, à chaque changement de milieu. En tant que contrôle positif, induisent differentiati chondrogéniquesdans les cellules non centrifugé en ajoutant MCD contenant 10 ng / ml de TGF-β1.
    2. Placer les tubes coiffés de manière lâche contenant les pastilles dans une position debout et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2.
    3. Changer le milieu tous les jours pendant 3 semaines.
  4. culture Micromass
    1. Immédiatement après centrifugation (étape 1.2.2; 2400 × g pendant 15 min), aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 pi de MDP.
    2. Pour former un Micromass, placer les cellules remises en suspension au centre d'un puits d'une plaque à 24 puits.
    3. Après 2 h, ajouter avec précaution 1 ml de MDP au bien, pipetage contre le mur de la plaque pour éviter de perturber l'micromasse. En tant que contrôle positif, effectuer une culture de micromasse avec des cellules non centrifugés en ajoutant CDM contenant 10 ng / ml de TGF-β1.
    4. Incuber la micromasse à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO 2.
    5. Changez le ev moyenEry autre jour pendant 3 semaines.

2. transcriptase inverse-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pour détecter transcriptionnelle de régulation positive Chondrogène Différenciation Marqueurs

  1. Au jour 14, utiliser une pipette pour transférer les pastilles de sphéroïdes dans un nouveau tube de 1,5 ml et les laver dans PBS 1x.
  2. Extraire l'ARN total à partir des pastilles en utilisant le thiocyanate-phénol-chloroforme méthode 9 d'extraction de guanidinium.
  3. Synthétiser un ADNc à partir de 2 pg d'ARN total en utilisant une transcriptase inverse selon le protocole du fabricant (incuber à 42 ° C pendant 1 h et ensuite inactiver l'enzyme à 70 ° C pendant 5 min).
  4. Effectuer une PCR avec des amorces spécifiques pour les marqueurs de 10 différenciation chondrocytaire.

3. Coloration pour détecter la surexpression de chondrogéniques Différenciation Marqueur Protéines

  1. culots cellulaires Paraffin-enrobage
    1. Au jour 21,utiliser une pipette pour récolter les granulés sphéroïdes et les laver avec PBS 1x.
    2. Fixer les granules sphéroïdaux par immersion dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 h.
      Attention: paraformaldéhyde est hautement toxique. Éviter tout contact avec les yeux, la peau ou les muqueuses. Minimiser l'exposition et éviter l'inhalation lors de la préparation. Porter un équipement de protection individuelle approprié.
    3. Jeter le fixateur et rincer les pastilles de cellules avec de l'eau déminéralisée (DW).
    4. Placer une couche de gaze sur la cassette et transférer les pastilles fixes à l'aide d'une pipette. Couvrir le culot par pliage de la gaze et fermer le couvercle de la cassette.
    5. Déshydrater les pellets.
      1. Immerger les pastilles dans 70% d'éthanol (EtOH) pendant 5 min à température ambiante.
      2. Immerger les pastilles dans 80% de EtOH pendant 5 min à température ambiante.
      3. Immerger les pastilles dans EtOH à 95% pendant 5 min à température ambiante.
      4. Immerger les pastilles dans EtOH à 100% pendant 5 min à température ambiante. Répéter deux fois.
      5. Immerger les pastilles dans 100% de xylène pendant 15 minutes à température ambiante. Répétez twice.
    6. Incorporer les culots de cellules fixes dans la paraffine à 56 ° C dans un moule; les pastilles peuvent être incorporées dans de la paraffine en utilisant des systèmes de traitement de tissu automatisé spécialisés.
    7. Couper les sections 5 um d'épaisseur à partir du culot cellulaire inclus dans la paraffine en utilisant un microtome rotatif.
    8. Float les sections dans 50% EtOH puis les transférer à un bain à 50 ° de l'eau en utilisant une diapositive.
    9. Placez les sections flottantes sur des lames.
  2. Safranine O et coloration au bleu Alcian
    1. Réhydrater les sections de paraffine.
      1. Immerger les lames dans du xylène pendant 15 min. Répéter deux fois.
      2. Immerger les lames dans EtOH à 100% pendant 5 min. Répéter deux fois.
      3. Immerger les lames dans 90% de EtOH pendant 5 min.
      4. Immerger les lames dans 80% EtOH pendant 5 min.
      5. Immerger les lames dans 70% EtOH pendant 5 min, puis lavez-les dans PBS 1x.
    2. Colorer les sections réhydratés avec 1% solution safranine O et 3% de bleu Alcian pour30 minutes.
    3. Jeter la solution de coloration et rincer les sections avec DW.
    4. Colorer les sections avec une solution hématoxyline / éosine (colorante de) pendant 1 min.
    5. Jeter la solution de coloration et rincer les sections avec DW.
    6. Placer une goutte de milieu de montage sur une lamelle couvre-objet après avoir retiré l'eau résiduelle. Placez délicatement la lame (cellule vers le bas) sur la lamelle contenant le milieu de montage.
    7. Laisser les lames sécher pendant 2-3 h à température ambiante.
    8. Capture d'images en utilisant un microscope à champ lumineux (microscope droit automatisé, 50X et 200X).
  3. immunofluorescence
    1. Réhydrater les sections comme décrit dans la section 3.2.1.
    2. Immerger les lames dans du tampon citrate de sodium (citrate de sodium 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), puis de les maintenir à une température sub-bouillante pendant 10 minutes en utilisant un four micro-ondes.
    3. Refroidir les lames pendant 20 min à température ambiante, puis les laver avec de l'eau du robinet.
    4. Incuber les lames dans 3%H 2 O 2 (1x PBS) pendant 15 min, puis les laver avec de l' eau du robinet pendant 15 min 11.
    5. Bloquer les lames avec un tampon de blocage (10% de sérum de chèvre normal dans du PBS) pendant 1 h.
    6. Aspirer la solution de blocage, et ensuite appliquer un anticorps primaire dilué avec 5% de sérum de chèvre normal sur les lames.
    7. Incuber les lames pendant une nuit à 4 ° C.
    8. Laver les lames trois fois en 1x PBS pendant 5 min chacun.
    9. Incuber les lames dans un anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome dilué avec 5% de sérum de chèvre normal pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
    10. Laver les lames trois fois dans du 1 x PBS pendant 5 min à chaque fois dans l'obscurité.
    11. Incuber les lames avec DAPI (1 pg / ml) pendant 10 min, puis lavez-les deux fois en 1x PBS pendant 5 minutes chacun.
    12. Placer une goutte de milieu de montage sur une lamelle couvre-objet après avoir retiré l'eau résiduelle. Placez délicatement la lame (cellule vers le bas) sur le support de montage.
    13. Laisser les lames sécher pendant 2-3h dans l'obscurité à la température ambiante.
    14. Visualisez les diapositives en utilisant la microscopie à fluorescence (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X et 200X) 12.

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Résultats

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gravité centrifuge induit une surexpression de marqueurs de différenciation chondrocytaire dans les cellules souches dérivées de tissu adipeux.

Pour déterminer le degré de la force de gravité centrifuge qui est apte à induire la différenciation chondrogénique, ASCs ont été stimulées avec divers degrés de CG (0, 300, 600, 1200 et 2400 x g) pendant 15 min. Après stimulation, les ASCs ont été re-ensemencées sur des plaques de cul...

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Discussion

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L'état des cellules de stemness est très important pour la surexpression CG-induite de SOX9. Dans notre étude, l'expression de SOX9 pourrait être induite par CG en ASCs début de passage (2-3), mais pas dans ASCs plus tard, passage. Il a été rapporté que, pendant la culture, ASCs contiennent des cellules CD34 + jusqu'à 3 passages 16. ASCs ont tendance à perdre l'expression de CD34 que les cellules sont repiquées, ce qui entraîne une faible réponse au CG.

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous déclarons que nous n’avons aucun conflit d’intérêts associé à ce travail.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été financée par une subvention du Projet coréen de R&D sur la technologie de la santé par l’intermédiaire de l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI), financée par le ministère de la Santé et du Bien-être social de la République de Corée (numéro de subvention : HI14C2116) et par le Fonds de recherche de l’hôpital St. Mary de Séoul, Université catholique de Corée.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plasticware
100 mm PlatTPP93100
60 mm PlatTPP93060
50 mL Cornical TubeSPL50050
15 mL Cornical TubeSPL50015
10 mL Pipette jetableFalcon7551
5 mLFalcon7543
ASC Milieux de culture Matériaux
DPBSLife Technologies14190-144
DMEM Low glucoseLife Technologies11885-084milieu de base
de croissance Pénicilline StreptomycineSigma AldrichP43331 %
Fetal Bovin SerumLife Technologies16000-04410 %
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
Matériaux de différenciation chondrogénique
DMEM High glucoseLife Technologies11995Milieu de base de différenciation chondrogénique
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)Life Technologies11140-050
DexaméthasoneSigma AldrichD2915100 nM
Pénicilline Streptomycine LifeTechnologiesP43331 %
Fetal Bovin SerumLife Technologies16000-0441 %
Ascorbate-2-phosphateSigma AldrichA896050 μ ; g/mL
L-prolineSigma AldrichP560750 μ ; g/mL
ITSBD1 %
TGF&bêta humain ; 1Peprotech100-2110 ng/mL
Materials
18 mm Cover GlassSuperiorHSU-0111580
4 % ParaformaldyhydeTech & InnovationBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Sérum bovin AlbumineVecteur LabSP-5050
Anti-Collagène IIanticorps abcam  ;ab347121:100
Anticorps secondaire anti-Rabbit IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 594Sonde moléculaireA-110371:200
DAPISonde moléculaireD1306
Prolong gold anti-faderéactif InvitrogenP36934
Slide Glass, CoatedHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
ChloroformeSigma Aldrich366919
IsoprypylalcoholMillipore109634
EthanolDuksan64-17-5
RevertAid First Strand kit de synthèse d’ADNcThermo ScientficK1622
i-Taq DNA PolymeraseiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
Chargement étoileDyne BioA750
AgaroseSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) Marqueur d’échelle d’ADNEnzynomicsDM003
Cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux (ASCs)Cellules MASTER catholiques
354352

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Expression de SOX9Collag ne de type 2Expression de l aggr caneCulture en micromasseEnrobage en paraffineColoration la Safranine OColoration au bleu d alcian

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