L'étude des processus dynamiques de Nano-objets de taille dans le liquide en utilisant la transmission de microscopie électronique à balayage

Summary

Ce protocole décrit le fonctionnement d'un porte-échantillon d'écoulement de liquide pour la microscopie électronique à balayage de transmission de AuNPs dans l'eau, telle qu'elle est utilisée pour l'observation des processus dynamiques à l'échelle nano.

Abstract

Les échantillons entièrement intégrés dans le liquide peuvent être étudiés à une résolution spatiale nanométrique avec Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) en utilisant une chambre microfluidique assemblé dans le porte-échantillon pour microscopie électronique à transmission (TEM) et STEM. Le système microfluidique est constitué de deux puces de silicium minces de support Nitrure de Silicium (SiN) fenêtres à membrane. Cet article décrit les étapes de base de chargement de l'échantillon et l'acquisition de données. Le plus important est de faire en sorte que le compartiment de liquide est correctement assemblé, fournissant ainsi une fine couche de liquide et un joint étanche au vide. Ce protocole comprend également un certain nombre de tests nécessaires pour effectuer pendant le chargement des échantillons afin d'assurer un assemblage correct. Une fois l'échantillon chargé dans le microscope électronique, l'épaisseur du liquide doit être mesurée. Un montage incorrect peut entraîner un liquide trop épais, tandis qu'un liquide trop mince peut indiquer l'absence de liquide, par exemple quand une bulle est formée. Enfin, le protocoleexplique comment les images sont prises et comment les processus dynamiques peuvent être étudiés. Un échantillon contenant AuNPs est imagé à la fois dans de l'eau pure et dans une solution saline.

Introduction

Conventionnel Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) est limitée par la gamme d'échantillons appropriés pour l'analyse, en particulier les échantillons secs et solides appropriés pour le placement dans un vide poussé. Cependant, de nombreuses questions scientifiques et technologiques concernent les matériaux et procédés en milieu liquide à l'échelle nanométrique. Les échantillons entièrement intégrés dans le liquide peuvent maintenant être étudiés avec STEM en utilisant un concept qui implique une chambre microfluidique assemblé dans le porte-échantillon pour microscopie électronique à transmission (TEM) et STEM ^1. Cette nouvelle technique est devenue de plus en plus populaire, car il donne un nouvel aperçu des processus importants de divers sujets de recherche, y compris la croissance, la dissolution, et les processus d'agrégation des nanoparticules ^{2, 3, 4, 5, 6.} Non seulement les métaux, mais aussi BioMInerals ⁷ et les systèmes biologiques peuvent être étudiés ^{8, 9, 10, 11.} Le chargement de l'échantillon et l'acquisition d'image pour phase liquide STEM est différente de celle des STEM d'échantillons secs et impliquent un protocole qui nécessite une formation spécifique.

Le système micro - fluidique est constitué de deux puces de silicium supportant Nitrure de Silicium Les fenêtres (SiN) de la membrane transparente pour le faisceau d'électrons à 200 keV d'énergie ¹² (voir figure 1A). Les détails des dimensions et de la manipulation de ces puces peuvent être trouvées ailleurs ^{12, 13.} L'échantillon contient habituellement des objets à l'échelle nanométrique. Dans cet article, nous avons observé des nanoparticules d'or (AuNPs). Les AuNPs sont immobilisés à la fenêtre du haut (par rapport à un faisceau d'électrons vers le bas déplacement) ou flottent dans le liquid. Résolution spatiale nanométrique en STEM est obtenue par balayage du faisceau d'électrons sur les AuNPs et collecter des électrons dispersés transmis en utilisant le Annulaire Dark Field (ADF) détecteur ^9. Les deux puces sont placées dans une petite fente dans la pointe du liquide porte-TEM d'écoulement ¹ (le support fonctionne à la fois STEM et TEM , mais est désigné comme le porte-TEM). Une des puces électroniques contient une pièce d'écartement de sorte qu'un compartiment de liquide est formé entre les puces électroniques. Les joints toriques sur les deux côtés des deux puces électroniques fournissent vide étanchéité du compartiment de liquide ¹³ (voir figure 1B).

Le but de cet article est de démontrer les étapes de base de chargement de l'échantillon et l'acquisition de données afin que les utilisateurs intéressés peuvent trouver un accès facile à cette nouvelle technique émergente. Un système disponible à partir d'une entreprise spécifique est utilisé, mais le protocole est également valable pour les systèmes d'autres entreprises. La technique estplus complexe que TEM et STEM classique, et un certain nombre d'aspects pratiques doivent être considérés lors de l' utilisation d' un système de support liquide ^13. Le plus important est de faire en sorte que le compartiment de liquide est correctement assemblé, fournissant ainsi une fine couche de liquide et un joint étanche au vide. Par conséquent, il est très important de travailler proprement et pour empêcher la formation de poussières lors de la préparation et de l'assemblage du liquide porteur TEM d'écoulement. En particulier, les joints toriques et les deux puces de silicium doivent être libres de toute contamination. Même de petites particules de poussière sur l'une des puces électroniques peuvent sérieusement augmenter l'épaisseur de la cellule assemblée, ce qui peut empêcher la réalisation d'une résolution spatiale utile. Un joint d'étanchéité à vide est importante de sorte qu'aucune contamination ou de détérioration seront laissés au microscope électronique après l'expérience. Ce protocole décrit la procédure de chargement et plusieurs tests nécessaires. Le fonctionnement du microscope électronique est simple, but il nécessite quelques étapes supplémentaires par rapport à la microscopie d'échantillons solides. Avec l'augmentation des épaisseurs liquides, plus d'électrons sont absorbés et dispersés par le liquide; une mesure de l'épaisseur de liquide est essentielle. Enfin, le protocole explique comment les images sont prises et comment les processus dynamiques peuvent être étudiés.

Figure 1: Cellule d'écoulement de liquide pour la numérisation microscopie électronique à transmission (STEM). (A) Représentation schématique de la cellule liquide assemblé. Deux puces de silicium avec le nitrure de silicium (SiN), les fenêtres à membrane sont disposés entre les deux joints toriques. Le liquide est enfermé entre la membrane et SiN est ainsi séparée de la dépression dans le microscope électronique. A des balayages focalisées de faisceau d'électrons sur l'échantillon. Le contraste est obtenu à partir d'électrons dispersés. Les nanoparticules d'or (AuNPs) sont immobilisées dans le liquide au niveau de la membrane SiN, mais peut aussi se déplacer dans laliquide. (B) Schéma vue latérale section transversale de la pile de deux puces avec joints toriques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Protocol

Figure 2: Procédure de nettoyage des micropuces Si. (A) deux béchers sont remplis de 40 à 60 ml d'acétone et d' éthanol chacun. Micropuces (B) Le silicium sont placés dans le bécher rempli avec de l' acétone. Le côté de la membrane SiN doit faire face vers le haut. La réflexion des deux puces Si montre clairement la rainure à l'arrière de deux puces. (C) Après 2 minutes, les puces électroniques en Si sont transférés dans le deuxième bécher rempli avec de l' éthanol. Après encore 2 minutes, les puces électroniques en Si sont transférés dans un tissu de salle blanche pour le séchage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Flux Liquide Transmission Electron Microscopie (TEM) Holder Équipement. (A) Le liquide de support de TEM avec un tuyau d'écoulement en matière plastique et d' une seringue pour l' écoulement du liquide. (B) La pointe du liquide porteur TEM d'écoulement retiré de l'arbre de support, le couvercle du compartiment de liquide de la cellule, les joints toriques et les deux puces de silicium. Le tube fait saillie à partir du côté gauche de la pointe. (C) Le compartiment cellulaire liquide montrant un joint torique, la fente pour la mise en place de la puce. (D) Différentes pinces sur une surface sans poussière (feuille d'aluminium). (E) Le couvercle du compartiment de la cellule liquide avec ses deux joints toriques. (F) Deux puces de silicium avec des fenêtres de la membrane SiN. Gauche: l'échantillon puce sans une entretoise; droite: la puce de couverture avec un 200 um entretoise. (G) Un système de pompe microfluidique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figuré.

1. Préparation des micropuces

1. Nettoyage des micropuces

1. Préparer un espace de travail avec une faible teneur en poussière dans une hotte à flux laminaire avec un filtre à particules de poussière.
2. Nettoyer une lame de verre de microscopie optique avec un tissu fibreux et de l'éthanol pur pour le placement et le transport des puces électroniques. Placez la lame de verre sur un tissu cleanroom dans une boîte de Pétri.
   REMARQUE: Évitez d'utiliser l'éthanol technique en tout temps.
3. Sélectionnez 5 puces de base (sans entretoise) pour le placement de l'échantillon et 5 puces avec une entretoise 200 nm d'épaisseur.
   REMARQUE: Les dimensions de la fenêtre sont de 20 x 400 um ² et l'épaisseur SiN est de 50 nm. Comme il y a une certaine tolérance sur les dimensions, il est recommandé de vérifier les dimensions à l'aide d'un microscope optique.
4. Utilisez des pinces revêtues de carbone pour éliminer les micro-puces dans la zone de stockage et les placer sur la lame de verre. Prenez les micropuces fermement mais soigneusement sur leur locôtés ng. Manipuler la puce de telle sorte que le côté de la membrane SiN est toujours orientée vers le haut.
   REMARQUE: Évitez de toucher la membrane SiN fragile sur le côté supérieur. Aussi soyez prudent avec la manipulation des puces électroniques pour éviter la fissuration de leurs arêtes vives, qui peuvent causer des problèmes dus à des particules de silicium se trouvant sur la puce ou à des fuites ultérieures.
   NOTE: La formation de la procédure pour éliminer les puces de la surface collante peut être effectuée sur (bon marché) micropuces factices.
5. Placez les puces sur un tissu cleanroom dans une boîte de Pétri. Fermez le plat et le transférer à la hotte.
   NOTE: Les étapes impliquant l'acétone sont effectuées dans une hotte pour la sécurité chimique.
6. Prenez deux 120 béchers en verre mL. Rincer avec de l'acétone bêcher une et l'autre avec de l'éthanol pour les nettoyer. Remplir le premier avec 40 à 60 ml d'acétone et l'autre avec 40 à 60 ml d'éthanol.
   NOTE: Il est important d'utiliser des liquides de qualité CLHP aussi pour cette étape dans le protocole.
7. Transfertles micropuces dans le bécher avec de l'acétone afin d'éliminer la protection résistent couche. Déplacez doucement le bêcher à la main pour rincer efficacement les puces, mais attention à ne pas tourner les micropuces envers - voir la figure 2.
8. Après 2 min, retirez les puces et rapidement les transférer dans le bécher avec l'éthanol. Déplacez doucement le bêcher à la main avec de l'éthanol pendant 2 min pour éliminer les résidus de la couche de réserve. Couvrir le bécher avec une feuille d'aluminium et le transférer sur le plan de travail à flux laminaire.
   REMARQUE: Ne pas laisser les micropuces sécher pendant le transfert afin d'éviter le dépôt de débris.
9. Retirez les puces du bêcher et les placer sur un nouveau tissu cleanroom. Laissez-les sécher pendant quelques minutes et transférer les puces sur la lame de verre de microscope optique dans la boîte de Pétri.
   NOTE: Les micropuces humides peuvent facilement basculer autour, tourner à l'envers, ou coller à la pince à épiler lorsqu'il est libéré. Ceci peut être évité par pressionchanter les micropuces doucement sur le papier filtre et en tirant les pinces loin dans le sens horizontal.
10. Fermez la boîte de Pétri et de transférer les puces du filtre à plasma.
11. Placer la lame de verre avec des micro-puces dans le nettoyeur à plasma. Exécuter un programme de nettoyage de 5 minutes pour rendre la surface du nitrure de silicium et la membrane hydrophile pour éliminer les hydrocarbures.
    REMARQUE: les paramètres appropriés appliqués pour notre nettoyeur à plasma sont: 70 mTorr, débit de gaz de 11,5 sccm pour O ₂ et de 35,0 sccm pour Ar, 50 W avant cible Fréquence Radio (RF), 5 W Plage de RF et max réfléchi RF. Tout plasma capable d'induire une charge de surface est appropriée.
12. Mettez la lame de verre avec la puce de nouveau dans la boîte de Pétri, fermer le couvercle et le transférer au microscope optique.
13. Examiner les puces sous un microscope optique pour des ruptures de membranes possibles ou des particules de poussière restantes. Faites attention avec les zones de la fenêtre et de vérifier les petits points indiquant arupture de la membrane. Rejeter des puces avec des membranes endommagées.
14. Fermez la boîte de Pétri et le stocker dans le plan de travail à flux laminaire.

2. Préparation de l'échantillon sur les micro - puces

1. Préparer une solution aqueuse AUNP (citrate stabilisé) en mélangeant de petites quantités des solutions mères contenant de 30 nm de diamètre, AuNPs citrate stabilisé à une concentration de ~ 3 M.
2. Placez les puces sur une surface propre, collant dans une boîte de transport pour le dépôt de gouttelettes application / échantillon.
3. Placez une goutte (1-2 pi) de la solution d'échantillon sur le côté de la membrane SiN de la puce de plasma nettoyé fraîchement (utiliser une puce sans une entretoise) et laisser la solution sécher dans l'atelier à flux laminaire.
   REMARQUE: Cette procédure peut être répétée afin d'augmenter la concentration de AuNPs sur la membrane SiN.
4. Appliquer 1 pi d'eau déminéralisée à la puce électronique pour l'élimination du sel et / ou des agents tensioactifs. Au bout de 30 s, bienretirer la goutte d'eau avec du papier filtre. Laissez les micropuces sécher à l'air dans l'atelier à flux laminaire.
   NOTE: Un assez grand nombre de AuNPs aura adhéré à la puce et ne sera pas lavé dans de l'eau plus.
5. Utilisez les puces d'échantillons préparés dans les 4 h, le SiN perd ses propriétés de surface hydrophiles rendus au fil du temps, ce qui peut amener le liquide à se comporter différemment au cours d'une expérience. Remarque: Se référer à la section de discussion pour plus de détails.
6. Utilisez une boîte de transport fermé pour le stockage et le transfert des puces électroniques.

2. Préparation du titulaire de débit des liquides TEM

1. Nettoyage du porte-TEM d'écoulement de liquide
   1. Nettoyez tous les outils (pinces et un tournevis) qui seront en contact avec des parties de vide utilisant l'acétone et d'éthanol dans un bain à ultrasons et les placer sur la surface libre de poussière fournie par un nouveau morceau de papier d'aluminium placé sur le banc de travail. Travailler avec des gantspour éviter la contamination du liquide porteur TEM d'écoulement.
      REMARQUE: Les outils ne doivent pas être largement nettoyé si on est sûr qu'ils sont propres pour le travail avec des pièces sous vide. Les gants peuvent être évités si l'on est capable de gérer l'équipement sans toucher les parties de vide.
   2. Placer le liquide porteur TEM d'écoulement sous le microscope optique binoculaire d'une manière telle que l'extrémité du support contenant la chambre de liquide peut être observée. Voir Figure 3.
   3. Retirez le couvercle de la pointe de support et placez-le sur la surface sans poussière.
      NOTE: Le couvercle de titane est sensible aux rayures causées par des matériaux plus durs comme la pince à épiler. Il est recommandé d'utiliser des pinces enrobées de polymère pour les matériaux sensibles.
   4. Préparer au moins 1 à 2 ml d'eau pure (qualité HPLC).
      NOTE: Si l'on ne veut pas utiliser de liquide de qualité HPLC, il est recommandé de vérifier que les liquides utilisés ne contiennent pas de micro-particules qui pourraient éventuellement conduire à des sabots du système d'écoulement; filter le liquide au besoin avec un filtre micro-pores.
   5. Utiliser une seringue de verre (1 ml) pour rincer le système d'écoulement entier avec 0,5 mL d'eau pure. Il est recommandé d'utiliser un système de pompe à seringue microfluidique. Utiliser une pipette et / ou du papier filtre pour éliminer le liquide soit éjecté dans le compartiment de la cellule liquide. Testez tous les tuyaux pour l'écoulement du liquide. Sécher la pointe de support après en utilisant du papier filtre et / ou d'une pipette.
   6. Utilisez le microscope optique pour vérifier que la pointe du support est propre et sec. Si nécessaire, laver la pointe du support avec de l'eau ou de l'éthanol pour éliminer les résidus solides qui pourraient avoir été laissées par la solution séchée. Retirer les morceaux de poussière ou des restes de fibres ainsi. Retirez soigneusement ces pièces avec des pincettes, ce qui évite de rayer la surface de titane. Jetez également à l'intérieur des rainures des joints toriques et enlever les restes de liquide avec un petit morceau de tissu cleanroom.
      NOTE: Si le titulaire ne devient pas propre avec cette procédure, il est recommandépour retirer la pointe du support et nettoyez-le dans de l'acétone pendant 2 min et dans l'éthanol pendant 2 minutes en utilisant un bain à ultrasons.
   7. Inspecter toutes les autres parties de la pointe (joints toriques, le couvercle et les vis) sous le microscope optique et enlever la poussière, fibres, etc ...
      REMARQUE: De temps en temps, de petits morceaux provenant des vis ou des micropuces Si doivent être supprimés. Si nécessaire, nettoyez brièvement les parties à vide avec de l'éthanol de qualité HPLC. Le couvercle et les vis peuvent être nettoyés à l'aide d'ultrasons, comme expliqué pour la pointe. Évitez de placer les joints toriques fréquemment dans de l'éthanol, car il peut faire les joints toriques fragiles au fil du temps, diminuant leur étanchéité au vide. Le système fonctionne sans graisse à vide, mais si des problèmes d'étanchéité se produisent, la graisse à vide peut être utilisé.
   8. Réinsérer les joints toriques dans les rainures respectives du support et vérifier qu'ils correspondent et ne dépassent pas sur un côté de la gorge.
   9. Gardez le support de TEM d'écoulement de liquide exempt de poussière jusqu'à ce que le chargement des échantillons (par exemple., En le recouvrant d' une feuille d'aluminium).
2. Assemblage du support de TEM d'écoulement de liquide
   REMARQUE: La procédure suivante décrit la procédure de chargement de puces dans un porte-échantillon avec une orientation optimale pour STEM. Dans cette configuration, la puce de base avec l'échantillon sera supérieure de la puce une fois transférée dans le microscope. Voir la figure 4. TEM, la résolution spatiale la plus élevée est obtenue au fond de la cellule liquide par rapport à un faisceau d'électrons vers le bas de déplacement. Ainsi, les puces seraient montés dans l'autre sens.
   1. Utilisez des pinces incurvées pour saisir l'échantillon puce sur le côté long et le placer dans la fente (poche) dans la pointe du liquide porte-TEM d'écoulement. Gardez le côté de SiN vers le haut. Vérifier le placement correct de la puce dans la fente à l'aide d'un microscope optique binoculaire.
      NOTE: Si le joint torique en dessous de la puce est pas correctement placé, la puce peut dépasser felon la fente.
   2. Placer une goutte de 0,3 ul du liquide filtré pour l'expérience sur la puce électronique de l'échantillon à l'aide d'une micropipette. Si nécessaire, fixer la puce en place avec des pincettes, car les forces capillaires de la gouttelette peut tirer la puce de sa poche.
   3. Utilisez des pinces à l'envers incurvées vers le bas pour prendre la deuxième puce (avec la couche d'espacement). Tourner avec précaution la puce à l'envers. Placez l'entretoise micropuce sur la puce de base dans la fente.
      NOTE: Cette procédure doit être fait suffisamment rapidement pour éviter le séchage de la gouttelette sur l'échantillon micropuce.
   4. Inspectez le placement correct en utilisant un microscope optique binoculaire tout en se déplaçant d'une pièce de matériau réfléchissant la lumière en dessous de la pointe du porte-échantillon. Les deux puces électroniques doivent être alignées exactement parallèle à obtenir le meilleur chevauchement des fenêtres SiN.
      NOTE: Dans le cas où les fenêtres ne se chevauchent pas, les puces peut être repositionné en poussant sur un côté avec une pointe dela pince à épiler, mais éviter de déplacer les puces trop, car la membrane SiN peut être facilement endommagés. Certaines puces électroniques sont équipées d'une configuration croisée (la fenêtre d'une puce électronique est perpendiculaire à la fenêtre dans l'autre puce électronique); Cette configuration facilite l'alignement des deux puces électroniques encore réduit également le champ de vision du microscope électronique.
   5. Prenez la face avant du couvercle de la chambre de l'échantillon avec la pince à épiler et tourner à l'envers. Sans toucher les puces, placez le côté arrière du couvercle sur la pointe. Ouvrez lentement la pince à épiler de façon à ce que le couvercle repose uniquement sur la branche inférieure de la pince à épiler. Abaisser avec précaution le couvercle jusqu'à ce qu'il repose sur les deux puces. Retirer la pince à épiler.
   6. Vérifier l'alignement des fenêtres des deux puces. Si nécessaire, retirez le couvercle, ajuster le positionnement des puces, et positionner le couvercle à nouveau.
   7. Placez les vis et les fixer dans leurs lieux habituels. Vérifiez l'alignement des deux fenêtres. jef nécessaire, retirez les vis et ajustez les micropuces.
      REMARQUE: Ne pas fixer les vis trop fort, car cela pourrait causer des dommages. Un joint étanche au vide est obtenue lorsque les vis vient serrer.
   8. Vérifier l'étanchéité en entamant un écoulement de liquide à travers le système en utilisant un débit de 4 ul / min. Si aucune fuite est observée de chaque côté de la pointe, cela est une bonne indication de l'étanchéité sous vide.
   9. Transférer le support à la station de pompe à vide et vérifier l'étanchéité sous vide. Le niveau de vide devrait atteindre au moins 10 ^-5 mbar à 5 min de pompage.
      NOTE: Il est recommandé de tester la station de pompage avec un support factice avant utilisation.
   10. Transférer le support au microscope électronique dans son enceinte pour l'empêcher de collecte de la poussière.
       NOTE: Chaque porteur commercial est livré avec une enceinte.

3. STEM d'un spécimen en liquide

1. Réglage du microscope électronique pour STEM NOTE: Le fonctionnement du microscope électronique décrit dans ce protocole est basé sur des procédures standard qui peuvent être trouvés dans le manuel utilisateur. Le protocole décrit les détails requis au-delà des procédures standard pour l'acquisition de données sur des échantillons liquides.
   1. Démarrez le microscope avec mode STEM aligné. Dans le porte-échantillon, insérer un échantillon d'essai constitué d'un film mince de carbone avec AuNPs. Réglez les paramètres du microscope STEM comme suit: régler le courant de la sonde à 0,18 nA et la convergence semi-angle du faisceau d'électrons à 20 mrad en sélectionnant une taille de point de 4C et l'ouverture de l'objectif de 30 um. Sélectionnez une longueur de l'appareil photo de 8 cm.
   2. Prenez note de la densité de courant indiquée mesurée à l'écran de fluorescence tandis que le détecteur ADF est inséré. Retirer le porte-échantillon.
      REMARQUE: Cette valeur actuelle est nécessaire par la suite pour estimer l'épaisseur du liquide.
   3. Démarrez le flux de liquide avec de l'eau pure. Ne pas dépasser un débit de 2ul / min.
   4. Introduire le liquide porteur TEM d'écoulement dans le microscope électronique, et commencer l'évacuation. Vérifier à la fois l'indication du vide de la chambre à vide préliminaire et la durée de l'évacuation. Si le niveau de vide est standard et la durée de la procédure de pompage ne dépasse pas la durée normale d'évacuation (environ 1 min) par un facteur de deux, à insérer le support.
   5. Ouvrez la vanne de faisceau lorsque le vide de la chambre d'échantillon principal est dans la plage qui permet son ouverture. Insérez le détecteur ADF en appuyant sur le bouton de l'AAD.
      NOTE: Ce protocole se réfère à un détecteur de AAD positionné au-dessus de l'écran de substance fluorescente du microscope électronique.
   6. Régler le microscope dans le mode d'acquisition d'image continue en utilisant une taille d'image de 512 x 512 pixels, un temps de séjour de pixels de 2 ms et un grossissement de 20.000. Rechercher la fenêtre SiN en traduisant la scène dans les directions x et y.
      REMARQUE: Les puces électroniques bloquent tous les électrons passant à travers l'échantillon vers le détecterou; signal est seulement visible à l'emplacement du SiN. Voir Figure 5. Parfois, il est plus facile de trouver la fenêtre SiN en regardant l'écran de fluorescence.
   7. Une fois que la fenêtre a été trouvée, régler les paramètres de luminosité et de contraste (en utilisant les boutons respectifs), de sorte que le bord de la fenêtre devient visible. Déplacez le bord vers le milieu du champ de vue en appuyant sur les axes x et y traduction boutons de la platine. Appuyez sur le bouton de remise à zéro de l'objectif.
      REMARQUE: La luminosité doit être largement réduite par rapport à un échantillon sous vide en raison de la forte dispersion dans le liquide.
   8. Passez en se concentrant grossière l'angle aigu sur le bord de la fenêtre SiN en ajustant la position verticale (z-translation) de l'étage de l'échantillon. Vérifiez que la position de l'échantillon est à la hauteur eucentrique en faisant tourner la scène de 5 ° et tournant le dos. Caractéristiques de l'échantillon et le coin de la fenêtre SiN ne doivent pas passer à de faibles grossissements.
      
   9. Réajuster la position verticale selon le besoin de placer le bord de la fenêtre au milieu de la zone de visualisation à nouveau. Conserver la position de la scène à l'aide du bouton d'enregistrement du logiciel.
   10. Se déplacer vers une position dans laquelle les petits morceaux de débris ou autres objets de contraste élevé (par exemple AuNPs) sont présents en traduisant la scène dans les directions x et y. Réglez la mise au point de l'objectif afin que tous les objets apparaissent forte au point.
   11. Prenez note de la densité de courant mesurée à l'écran luminescent visible via le logiciel d'exploitation, ce qui indique le courant transmis par le support liquide et à travers l'ouverture du détecteur ADF. Calculer l'épaisseur de la cellule liquide en utilisant l'équation 1. Procéder que si l'épaisseur du liquide a été déterminée et ne dépasse pas 3 um.
       14 suivante
       L'équation 1
       avec t _SiN l'épaisseur de la membrane de nitrure de silicium amorphe et de l' _eau t l'épaisseur de la couche d'eau. Le libre parcours moyen des longueurs de montant à l _SiN = 0,79 um de SiN, = et l _eau = 3,0 um d'eau pour l'ouverture semi-angle de 35 mrad ¹⁴ détecteur.
   12. Observez soigneusement le liquide à des grossissements inférieurs pour veiller à ce que des bulles de gaz ne sont pas présents. Les bulles de gaz peuvent être évités en utilisant le flux de liquide continu et la sonde de courant inférieure à 0. 5 nA.
   13. Traduire la scène dans les directions x et y jusqu'à une zone contenant au moins 20 AuNPs has été trouvé. Définissez la taille de l'image à 1.024 x 1.024 pixels, le temps de séjour de pixels à 19 ms, et le grossissement à 400.000. Acquérir les images de AuNPs adhéré à la membrane SiN en appuyant sur le bouton d'acquisition.
       NOTE: Une fois que les images ont été obtenues dans lequel les AuNPs sont visibles avec un fort contraste et des arêtes vives (voir figure 6), on peut être sûr que l'expérience est correctement mis en place. En cas de problèmes inattendus se produisent, ne pas procéder à l'expérience, mais assurez-vous de résoudre la cause.
2. STEM de la dissolution de AuNPs
   1. Retirer le liquide porte-TEM d'écoulement du microscope et d'arrêter l'écoulement du liquide.
   2. Préparer au moins 1 ml d'une solution 0,1 M de chlorure de sodium dans de l'eau de qualité HPLC dans une seringue en verre.
   3. Ajuster le système d'écoulement à une vitesse de 20 ul / min et rincer le système d'écoulement tout avec 0,3 ml de la solution saline. Utiliser un papier filtre pour recueillir le liquide soit éjecté sur lal'autre extrémité du tube. Ensuite, re-régler le système d'écoulement à 2 pi / min.
   4. Vérifier l'intégrité de la fenêtre SiN en utilisant un microscope optique binoculaire. Si aucune fuite est observée, réintroduisez le liquide porte-TEM d'écoulement dans le microscope.
   5. Vérifiez l'indication de vide de la chambre de pré-vide et la durée de l'évacuation. Si le niveau de vide est standard et la durée de la procédure de pompage ne dépasse pas la durée normale d'évacuation (environ 1 min) par un facteur de deux, à insérer le support
   6. Déplacer l'arrière de la scène du microscope à sa position précédente en utilisant la position de la scène stockée. Régler le microscope dans le mode d'acquisition d'image continue en utilisant une taille d'image de 512 x 512 pixels, un temps de séjour de pixels de 2 ms et un grossissement de 20,000X. Réglez le contraste, la luminosité, mise au point, et la hauteur eucentrique, comme décrit dans les étapes 3.1.7-3.1.9.
   7. Trouver un emplacement d'intérêt en traduisant la scène dans les directions x et y. Définissez la taille de l'image1.024 x 1.024 pixels, le temps de séjour de pixels à 2 ms, et le grossissement à 500.000. Enregistrement d'une série d'images SOUCHES manuellement en appuyant sur le bouton d'acquisition, une fois l'image précédente a été enregistrée.
      NOTE: Les AuNPs commencent à se dissoudre dès que le faisceau d'électrons est balayé sur l'échantillon. Les particules en dehors de la zone irradiée ne sont pas affectées et peuvent être observées immédiatement après. L'horodatage est stocké dans l'en-tête d'image. Il est également possible d'utiliser un logiciel pour la collecte automatique d'une série d'images en un film.
3. Démontage et nettoyage du porte-TEM après l'expérience
   1. Lorsque les expériences de TEM en phase liquide sont terminés et le support est rétracté du microscope électronique, nettoyer le tube, la chambre de liquide, et ses composants afin d'éliminer les particules solides ou le reste du sel qui pourraient influer sur les futures expériences.
   2. Desserrez la vis arrière légèrement de sorte qu'il est toujours fixédans son logement, mais le couvercle peut être enlevé facilement. Desserrez la vis avant, retirez-le, et le placer dans un environnement exempt de poussière.
   3. Retirez le couvercle et le placer dans un environnement exempt de poussière pour le stockage.
   4. Retirez les deux puces de la poche. Les séparer en les plongeant soigneusement dans l'eau ou dans la solution restante de l'expérience. Placez les puces sur du papier de soie avec le côté de la membrane SiN vers le haut et les laisser sécher à l'air pour une analyse ultérieure.
   5. Retirez les joints toriques et nettoyer les rainures respectives avec de l'eau de qualité HPLC. Conserver les joints toriques dans un environnement exempt de poussière.
   6. Utiliser une seringue de verre (5 ml) pour rincer tous les tuyaux (entrée et sortie), chacun avec 5 ml d'eau de qualité HPLC. Recueillir le liquide avec un petit bêcher placé au-dessous de la pointe de support de TEM. Après le rinçage, utiliser une pipette et / ou papier filtre pour éliminer le liquide restant dans le compartiment de liquide.
   7. Inspecter l'extrémité du porte-TEM et enlever les résidus comme les bords brisés de la micro de siliciumcopeaux, de fibres ou de poussières. Si le sel est encore visible, répétez la procédure de nettoyage. Remettre les joints toriques à leurs rainures.
   8. Rangez le porte-TEM et ses composantes dans un environnement exempt de poussière.
4. Procédure alternative à 3.2: STEM de déplacer des nanoparticules d'or
   NOTE: Une procédure de montage différente est nécessaire pour étudier le mouvement des AuNPs dans un liquide.
   1. Omettre étape 1.2. Chargez les AuNPs sur la puce de silicium immédiatement avant de les insérer dans le support de TEM à l'étape 2.2. Conserver l'échantillon couvert par une couche de liquide en tout temps afin d'éviter un fort attachement des AuNPs à la membrane SiN. Les autres étapes du protocole sont les mêmes. Une série d'images SOUCHES est obtenue à l'étape 3.2.6.

Figure 4: Montage du Titulaire de débit des liquides TEM. (A) Le compartiment cellulaire liquide avec ee plus petit joint torique placé dans sa gorge. L'encart montre la vue de dessus. (B) La puce de base est placé dans la douille correspondante. L'encart montre la vue de côté à angle tel que la puce est visible de réflexion de la lumière. (DR) Une goutte de la solution est ajoutée à la puce électronique. (EG) Mise en place de la couverture micropuce. (HI) Placement du couvercle du compartiment de la cellule liquide. (J) La fixation du couvercle au moyen des deux vis. (K) assemblé liquide porte-TEM d'écoulement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Positionnement initial et de mise au point en utilisant micrographies SOUCHES. (A) Pour localiser la fenêtre SiN, la scène se déplace vers les plus brillants signal. La puce de silicium est assez mince pour certains électrons de passer à travers près de la fenêtre. (B) Le bord de la fenêtre de SiN focalisée montrant quelques AuNPs apparaissant brillant sur le noir (moins de diffusion) fenêtre de membrane de SiN. Le bord de la puce est lumineuse due à la diffusion excessive. (C) La mise au point se fait à l'angle de la fenêtre SiN. Les images montrent la sous-concentrée, mise au point, et des situations trop concentré. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Results

Le liquide porteur TEM d'écoulement a été utilisé pour étudier le comportement de AuNPs dans un liquide. AuNPs de manière stable ont été immobilisés sur la membrane SiN dans l' eau pure et ont été imagées avec une résolution nanométrique en utilisant SOUCHE phase liquide (figure 6). Excellent contraste a été obtenu sur l'or fortement diffusion. La densité de courant sur l'écran de phosphore mesurée pour un échantillon d'essai à sec était de 20 pA / cm², alors qu'il est élevé à 8 pA / cm² avec le liquide support de TEM d'écoulement inséré. En utilisant l' équation 1, t = _eau 2,4 ± 0,5 pm, beaucoup plus grande que ce qui était attendu sur la base de l'épaisseur d'entretoise de 200 nm. Néanmoins, l'épaisseur est trop grande pour l'imagerie des AuNPs avec une résolution spatiale du nanomètre. L'épaisseur de liquide est plus épais que le 200 nm fixé par l'entretoise due au gonflement des membranes SiN, non-planéité des puces électroniques, et les débris se trouvant sur les puces électroniques.

16, bien que les produits de radiolyse réactifs (e ^- _aq, H ^• H ^+, OH ^•) provenant de l'interaction du faisceau d'électrons avec l' eau peut oxyder atomes d'or unique, conduisant à un changement de forme de la AuNPs ^15. Toutefois, lorsque le système d'écoulement de liquide a été utilisé pour introduire des ions chlorure dans une seconde expérience, la stabilité des AuNPs modifiée. Les ions chlorure sont capables de stabiliser des atomes d'or oxydé sous forme de tetrachloroaureat, AuCl ₄ ^-. La figure 7 montre que les AuNPs dissous lentement au cours d' une série de temps lapse imagerie STEM, similaires aux résultats rapportés précédemment ^16. Pour le débit de dose d'électrons utilisé, il a fallu environ 300 s pour dissoudre les 30 AuNPs nm de taille.

Les mouvements de AuNPs dans wate r ont été étudiées dans une troisième expérience (figure 8). Avant l'expérience, le liquide porte-TEM d'écoulement a été nettoyé afin d'éliminer toute trace de sel. A la différence de la première expérience, une approche de préparation des échantillons de remplacement a été utilisée pour obtenir une participation plus faible des AuNPs à la membrane SiN ^14. Dans cette expérience, la solution a été placée AUNP sur la puce de silicium et assemblé dans le liquide porteur TEM d'écoulement sans laisser la solution sécher. De cette façon, les AuNPs facilement détachés de la membrane SiN sur l'imagerie à la dose utilisée. Certains des AuNPs écarté du champ de vision dans les solutions en vrac, tandis que les AuNPs restants sont restés dans le champ de vision à proximité de la fenêtre SiN. Les mouvements de ces AuNPs ont été observées, et finalement ils agglomérées. Après un certain temps, ces agglomérats également détachés de la membrane SiN et déplacé hors du champ de vision et dans la solution.

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Figure 6: Numérisation Transmission Electron Microscopy (STEM) Microscopie de AuNPs 30 nm de diamètre au sommet d'une couche d'eau pure. L'image présentée est une zone sélectionnée de l'image originale. La taille de l'image était 1.024 x 1.024 pixels, le temps de séjour de pixels est de 19 ms, la taille du pixel est de 0,73 nm, et l'agrandissement était 400,000X. La dose d'électrons est donc de 7,1 x 10 ⁴ e ^- / nm². La densité de courant mesurée sur l'écran de phosphore est de 8 pA / ^cm2, de sorte que l'épaisseur du liquide a été calculée à équivaloir à 2,4 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7: Time-lapse Seriesdes micrographies SOUCHES de AuNPs à Saline. (AD) Images extraites de la série time-lapse d'images SOUCHES à 30 s d' intervalle. Les AuNPs se dissolvent progressivement dans le liquide en raison de la présence d'ions chlorure. Le temps de séjour de pixels était de 2 ms, le temps de la série de laps de temps de trame était de 1,75 s, la taille du pixel est de 0,44 nm, et l'agrandissement était 500,000X. La dose d'électrons par image était de 1,2 x 10 ⁴ e ^- / nm². L'épaisseur du liquide était de 2,4 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8: STEM Microscopie de AuNPs Déménagement dans l' eau pure. (A) membrane SiN avec AuNPs, dont plusieurs sont choisis avec des flèches. (B) pistes de mouvementdes AuNPs sélectionnés (voir A). Certains AuNPs se éloignent du champ de vision pendant le temps de l'imagerie. Les AuNPs restants se déplacent latéralement le long de la membrane SiN et commencent à agglomérer. Après avoir atteint une taille critique de cluster, ils distribuent de la membrane et se déplacent hors du champ de view.The temps de séjour de pixels a été 1 ms, le temps de trame était de 0,52 s, la taille des pixels est de 1,8 nm, et l'agrandissement était 120,000X. La dose d'électrons par image a été de 3,5 x 10 ² e ^- / nm² et l'épaisseur du liquide était de 2,4 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit permet de STEM AuNPs dans un liquide, y compris l'observation des processus dynamiques. L'ensemble du support est une technique facile à apprendre. Cependant, plusieurs aspects doivent être pris en considération lorsque l'on travaille avec le liquide support de TEM d'écoulement. Par exemple, les bords brisés de la puce électronique en Si de grosses particules ou les joints toriques peut entraîner une fuite de la cellule liquide. D'autre part, les grosses particules (> 200 nm, par exemple, de la poussière ou Si les débris) sur la membrane de SiN peut se traduire par une augmentation de l' épaisseur de la cellule liquide, ce qui conduit à un faible contraste d'imagerie ou à une faible résolution spatiale et peut même causer fenêtres SiN à briser. Fait important, les résidus de sel ou d'autres produits chimiques peuvent influer sur les résultats des expériences d'une manière indésirable. Par conséquent, il est essentiel que les différentes étapes de préparation de l'échantillon et l'ensemble de support sont réalisées avec soin et dans un environnement propre et sans poussière.

L'épaisseur de la CE liquidell détermine la résolution possible, ainsi que le contraste des images obtenues ^17. Cette épaisseur peut être ajustée par l'intermédiaire d'écarteurs situés sur l'une des deux puces de silicium. En fonction des dimensions de l'échantillon, des épaisseurs différentes de la cellule de liquide peuvent être réalisés. Pour l'étude des AuNPs, il est possible d'utiliser de petites entretoises (200-500 nm), tandis que les cellules eucaryotes entières ont besoin de grandes pièces d'écartement allant jusqu'à 5 pm. L'épaisseur de la cellule liquide est en outre influencée par le bombement des fenêtres SiN de la membrane résultant de la différence de pression entre le liquide et la cellule vide environnant. Cet effet devient plus prononcé avec de plus grandes fenêtres SiN membranaires. Ainsi, afin de minimiser l'épaisseur de la cellule liquide, il est recommandé d'utiliser de petites fenêtres à membrane de SiN. Dans le cas où il est difficile de trouver un chevauchement entre deux petites fenêtres, ils peuvent être assemblés dans une configuration croisée en utilisant une puce de base différente. D'autres configurations largely empêcher bombé et se composent d'une puce ¹⁸ ou membrane monolithiques fenêtres soutenues par des piliers ^19, mais ces inconvénients d'exposition concernant le chargement des échantillons. L'un des aspects les plus difficiles de la technologie actuelle est le manque de contrôle précis sur l'épaisseur du liquide. Souvent, le liquide est beaucoup plus épaisse que ce qui est attendu à partir des dimensions d'espacement utilisées, comme l'a montré ici. Plusieurs groupes ont utilisé des chambres fermées liquides ^{4, 20, 21, 22;} ces systèmes présentent des avantages en ce qui concerne la résolution spatiale, l'épaisseur du liquide peut être diminuée en induisant une bulle dans le liquide. Alternativement, les fenêtres SiN peuvent être contraints à l'effondrement, conduisant à une couche liquide mince. Troisièmement, l'enceinte des autres fenêtres plus minces existe (par exemple, le graphène) ^23, entraînant également des liquides beaucoup plus mincesque ce qui est possible avec le système décrit dans ce protocole. Cependant, il est impossible d'écoulement de liquide dans ces systèmes.

Comme pour toute technique de microscopie à haute résolution, un certain nombre d'aspects expérimentaux doivent être considérés. L'aspect le plus important est l'interaction du faisceau d'électrons avec le liquide ou l'échantillon. En plus de dégâts d'irradiation, ce qui limite la résolution spatiale atteignable pour de nombreux échantillons solides ^24, les échantillons liquides sont également influencées par un faisceau d' électrons généré par les produits de radiolyse ^{15, 25.} Étant donné que ces produits peuvent influer sur l'expérience, l' interprétation des données et de conception expérimentale sont essentiels ^26. Les réglages du microscope doivent être choisis en fonction des objectifs d'une étude particulière. STEM ADF est plus puissant pour les nanoparticules d'imagerie d'un numéro atomique élevé (Z) dans des épaisseurs plus importantes de la cellule liquide, while TEM donne un meilleur contraste sur les matériaux à faible Z et est généralement plus rapide , mais nécessite des couches plus minces liquides ^3. Au lieu d'utiliser le détecteur ADF, le (BF) détecteur lumineux champ est parfois utilisé pour l' image de la cellule liquide, depuis BF STEM est avantageux pour l' imagerie des matériaux à faible Z en couches épaisses ^27. Avec l'augmentation de l'épaisseur de la cellule liquide, plus de courant est nécessaire. Cependant, ceci augmente également la concentration des produits de radiolyse et augmente les dégâts d'irradiation. Il convient également de noter que l'inversion du contraste est observé dans le détecteur ADF pour des liquides très épais (> 10 pm) pour l'eau.

Les conditions ont été modifiées de liquide entre nos expériences en retirant le support du microscope et en échangeant l'échantillon et le liquide. En plus de modifier la concentration en sel, il est facilement possible de changer d' autres propriétés du liquide en faisant circuler dans des liquides différents (par exemple, on peututiliser des solutions tampons pour établir un pH spécifique ¹⁶ ou peut introduire des solutions organiques ou d' autres additifs). Il est également possible de changer le liquide tandis que le support est encore inséré dans le microscope, en faisant circuler les liquides à travers le système microfluidique. Cependant, dans ce cas, il est inconnu au moment où pointer le liquide à l'échantillon change. Il est également intéressant de noter que les micropuces de support des électrodes sont disponibles, des expériences de électrochimie à l' échelle nanométrique peuvent être effectuées ^28.

Les objets de l'étude ne sont pas limités à AuNPs dans l'eau, mais une grande variété de spécimens peuvent être étudiés en utilisant le protocole décrit ci-dessus, y compris la silice, l'oxyde de titane, et des polymères. Si les mouvements des objets sont trop rapides pour capturer dans une image dans l'acquisition, la viscosité peut être réduite par un ordre de grandeur en utilisant un mélange de 50% de glycérol et 50% d'eau.

A partir des points ci-dessus,un certain nombre d'avantages, les possibilités, et aussi des inconvénients deviennent apparents. Lorsque vous travaillez avec phase liquide STEM, les inconvénients les plus importants à considérer sont les suivants: 1) toute expérience est influencée par l'interaction dynamique du faisceau d'électrons avec le spécimen (l'objet observé, le liquide et les membranes SiN); 2) la manipulation des échantillons est fastidieux, et il est souvent difficile d'obtenir une mince couche de liquide parce que l'échantillon ou les puces électroniques contiennent des particules de taille micrométrique; 3) l'épaisseur du liquide diffère généralement en grande partie de l'épaisseur prévue fixée par l'entretoise; et 4) la résolution spatiale et le contraste dépendent fortement de l'épaisseur de liquide et la différence entre la densité de changement de l'objet observé et le liquide.

À l'heure actuelle, les méthodes suffisantes existent pour le microscope d'objets dans un liquide avec une résolution spatiale du nanomètre. La microscopie électronique dans la glace amorphe est une technique puissante ^29,mais les procédures expérimentales impliquées sont délicates, et non pas toutes les expériences permettent la préparation de l'échantillon dans la glace, et les expériences résolues en temps sont impossibles. Microscopie ^{30 X-ray, 31} pourrait en principe être utilisé, mais il a une résolution spatiale limitée et ne sont pas largement disponibles dans les laboratoires. La microscopie à force atomique , dans un liquide a été établie , mais est une technique de surface seulement ^{32, 33, 34, 35.} La microscopie optique ne présente pas une résolution spatiale suffisante. À l'heure actuelle, la microscopie électronique dans le liquide semble la technique la plus puissante pour la microscopie directe des objets et des processus à l'échelle nanométrique dans un liquide.

TEM en phase liquide et STEM ne sont pas encore des techniques d'analyse de routine, mais sont encore en développement. Le nombre de paramètres à prendre en compte est important, et il est often difficile de reproduire les résultats expérimentaux. En outre, des données quantitatives est difficile à obtenir parce que les effets visés par l'enquête sont étroitement liés aux processus qui se produisent à la suite du faisceau d'électrons. Le protocole décrit ici a pour but de standardiser le protocole expérimental, ce qui représente de ce fait de tous les aspects pertinents de la base de l'expérience. Nous espérons que ce protocole conduira à une meilleure reproductibilité des travaux expérimentaux dans ce domaine émergent.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope optique binoculaire	Leica	M60 CMO
Mircoscope électronique à transmission à balayage avec correcteur d’aberration sphérique	JEOL	ARM200F
Porte-échantillon TEM à flux liquide	DENS Solutions Ocean	Harvard
	Scientific	PicoPlus
Nettoyeur de plasma	Gatan	Solarus950
Chemicals
acétone, Rotisolv  ; Plus pour HPLC	Sigma-Aldrich	7328.2
Eau, chromasolv Plus pour HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
Éthanol, Rotisolv HPLC grade	Carl Roth	P076.2
Or citrate colloïdal stabilisé, diamètre 30 nm	British-Biocell	EM. GC20
Materials
Base micropuces en silicium avec membranes en nitrure de silicium de 50 nm d’épaisseur et dimensions de 20 µ ; m x 0,40 mm	DENS Solutions	pour système océanique
Micropuces en silicium avec membranes en nitrure de silicium de 50 nm d’épaisseur, dimensions de 20 µ ; m x 0,40 mm et une épaisseur d’entretoise de 200 nm	Solutions DENS	pour le système
Tube d’œil microfluidique	Upchurch Scientific	1570
Plastic Embouts
(corps en acier inoxydable antimagnétique et anti-acide avec embouts en PVDF (SV) ESD	IDEAL-TEK	2ASVR.SA
Pince à épiler en acier plié revêtu de téflon (EMS SA avec « PTFE » Revêtement)	Microscopie électronique Sciences	78322-7Te
Pince à épiler en acier à bec large revêtue de téflon (revêtement EMS 2A « PTFE »)	Microscopie électronique Sciences	78322-2ATe
Seringue Hamilton, 1 mL, étanche aux gaz (Modèle 1001 TLLX SYR)	Hamilton	81323
Tissu pour salle blanche Sontara Micropure AP (224 x 224mm)	DuPont	Sontara MicroPure