Une étude comparative des médicaments Méthodes de livraison ciblés à l'oreille de la souris intérieure: Bullostomy Versus Transtympaniques Injection

Résumé

Deux approches de microchirurgie pour l’administration locale de médicament dans l’oreille interne sont décrites ici et comparées en termes d’impact sur les paramètres auditifs, la cytoarchitecture cochléaire et l’expression des marqueurs inflammatoires.

Résumé

Nous présentons deux techniques de microchirurgie minimalement invasives chez les rongeurs pour la délivrance de médicaments spécifiques dans l'oreille moyenne afin qu'elle puisse atteindre l'oreille interne. La première procédure consiste à la perforation de la bulle tympanique, appelée bullostomy; le second est une injection transtympanique. Les deux procédures cliniques émuler intratympanic humaines.

Chitosan-glycérophosphate (CGP) et le tampon de Lactate Ringer (RL) ont été utilisés en tant que véhicules biocompatibles pour administration locale de médicaments. CGP est un polymère biodégradable non toxique largement utilisé dans des applications pharmaceutiques. Il est un liquide visqueux à la température ambiante, mais il se solidifie en une phase semi-solide à la température corporelle. RL est une solution isotonique utilisé pour l'administration par voie intraveineuse chez l'homme. Un petit volume de ce véhicule est précisément placé sur la niche de fenêtre ronde (RW) au moyen d'un bullostomy. Une injection transtympaniques remplit l'oreille moyenne et permet moins de contrôle mais un accès plus large à l'oreille interne.

Les deux procédures sont appropriés comme des méthodes d'administration de médicaments dans l'oreille moyenne de la souris, bien que l'injection transtympaniques avéré être moins invasive par rapport à bullostomy.

Introduction

La déficience auditive est le déficit sensoriel humain le plus fréquent et touche 5,3% de la population mondiale, et 30% des personnes âgées de plus de 65 ( http://www.who.int/topics/deafness/en , mise à jour 2016). La perte auditive affecte l'acquisition du langage chez les enfants et accélère le déclin cognitif chez les personnes âgées. Par conséquent, il est un problème de santé important avec un impact socio-économique considérable. Elle peut être provoquée par des défauts génétiques, des facteurs environnementaux , ou une combinaison des deux à ^1, ce qui en fin de compte provoquer des dommages et la mort des cellules ciliées et des neurones dans la cochlée. Ces cellules ne se régénèrent pas chez les mammifères, donc la perte cellulaire et concomitante perte auditive ne peuvent pas être inversés. Les options cliniques sont basées sur des dispositifs prothétiques, y compris les aides auditives et cochléaire, l' oreille moyenne et les implants de conduction osseuse ^2. Malheureusement, il n'y a pas trea réparatrice médical spécifiquetments pour la déficience auditive et donc plusieurs lignes de recherche se concentrent sur le développement de thérapies préventives et réparatrices. Options thérapeutiques nouveaux incluent la thérapie génique et cellulaire ainsi que le développement de petites molécules pour le traitement pharmacologique ^2.

L'un des défis les plus importants dans la thérapie pharmacologique cochléaire est la délivrance de médicaments. Les traitements systémiques ont une efficacité dans la cochlée limitée en raison du sang labyrinthe barrière ^3, endothélium continu en contact avec les vaisseaux sanguins cochléaire, qui agit comme une barrière physique et biochimique pour maintenir intérieure homéostasie liquide de l' oreille, ce qui limite donc le passage de la drogue à l'oreille interne. Il est seulement perméable aux petites molécules liposolubles, bien que la perméabilité peut être accrue lors de l'inflammation cochléaire, et aussi avec l'utilisation des diurétiques ou des agents osmotiques. Le volume de médicament qui atteint finalement la cochlée après l'administration systémique est réduite;par conséquent, des doses élevées qui pourraient entraîner une toxicité organique sont nécessaires. En outre, le métabolisme hépatique du médicament peut produire des métabolites toxiques ou inactifs ^{4, 5, 6, 7.} En revanche, les interventions locales permettent la mise en place d'une quantité limitée connue du médicament dans l'oreille moyenne ou interne , sans effets secondaires indésirables , ^{4, 7, 8, 9.} Dans la pratique clinique actuelle, les administrations intratympanic sont limitées à certaines pathologies cochléaires, tels que la gentamicine dans la maladie de Ménière ^10, les corticostéroïdes dans la surdité soudaine, la maladie de Ménière, à médiation immunitaire et le bruit perte d'audition induite, ^{11, 12, 13, 14, 15} et de l' insuline-like growth factor 1 (IGF1) dans la surdité soudaine ^{4, 16, 17.}

Les formulations pour l'administration locale devraient préserver l'homéostasie délicate (pH et osmolarité) des fluides cochléaires. En outre, il est très important de maintenir la stérilité au cours du processus afin d'éviter la contamination bactérienne du liquide céphalorachidien. L'excipient utilisé pour la délivrance de médicaments doit être biocompatible, nonototoxic et de la consistance appropriée. Les solutions liquides sont recommandés pour les injections intracochléaire, mais ne conviennent pas pour la route intratympanique en raison du jeu à travers la trompe d'Eustache. Dans ce cas, les médicaments sont généralement effectuées par des gels semi-solides pour augmenter leur permanence dans l'oreille moyenne ^{4, 18, 19.} livraison alternatif systems utilisées comme supports pour augmenter le passage du médicament à l'oreille interne sont des nanoparticules ²⁰ et adénovirus ²¹ Ici nous avons comparé deux véhicules: CGP et une solution de RL. CGP est un hydrogel formé par le chitosane, un polysaccharide linéaire constitué de D-glucosamine et la N-acétyl-D-glucosamine obtenu à partir de carapaces de crustacés et de β-glycérophosphate, d'un polyol qui forme un bouclier d'eau autour des chaînes de chitosane et le maintient en sous forme liquide. CGP est thermosensible et peut être dégradé par lysozymes, permettant une libération prolongée du médicament dans l'oreille moyenne ^{22, 23, 24, 25.} Hydrogels chitosane-base sont des véhicules appropriés pour des applications cliniques telles que la délivrance de médicaments en raison de leur manque d'immunogénicité et l' absence d'activation des réactions locales inflammatoires ^{23, 24.} Sur la OTHer la main, le tampon RL est une solution isotonique, apyrogène (273 mOsm / L et un pH de 6,5), destinée à être administrée par voie intraveineuse chez l'homme comme source d'eau et d'électrolytes, en particulier dans la perte de sang, d'un traumatisme ou de blessures par brûlures Du fait que les sous-produits du métabolisme du lactate dans le foie contrer l'acidose.

Nous décrivons ici et comparer les deux méthodes chirurgicales qui ont été raffinés pour la livraison locale de médicaments à l'oreille interne de la souris. Le profil des deux techniques de sécurité a été évaluée en utilisant des tests fonctionnels, morphologiques et moléculaires. Audition a été évaluée à l' aide de réponse du tronc cérébral (ABR) ^{26, 27} réalisée avant et après microchirurgie à des moments différents. Procédures de fin points ont été utilisés pour disséquer la cochlée et comparer l'impact anatomique, cellulaire et moléculaire de ces deux procédures de microchirurgie.

Protocole

Veiller à ce que les procédures de manipulation des animaux sont conformes aux réglementations nationales et internationales. Le protocole fait suite à la RD Communauté européenne 2010/63 / UE et espagnol 53/2013 lignes directrices, respectivement.

Manipulation 1. Généralités animaux

1. Souris Feed ad libitum avec un régime standard et de l' eau potable. la santé de contrôle et de bien-être en suivant Fédération des animaux de laboratoire Associations Science (FELASA) __gVirt_NP_NNS_NNPS<__ recommandations.

Évaluation 2. Audition

NOTE: Track impact fonctionnel des procédures de microchirurgie en testant audience avant et plusieurs fois après la chirurgie (dans ce travail 2, 7, 14 et 28 d postmicrosurgery) avec les procédures non-invasives telles que ABR ^9.

1. Pour les tests ABR, anesthésier les souris avec des protocoles d'effet de courte durée à savoir l' injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg / kg de poids corporel (BW) et de xylazine (10mg / kg, BW). Vous pouvez également effectuer des tests d'audition sous anesthésie inhalant.
   NOTE: Puisque les paramètres ABR peuvent être influencés par le protocole anesthésique ^28, utiliser le même pendant toute l'expérience.
2. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie en testant le réflexe toe-pincement.
   REMARQUE: Lorsque le réflexe de retrait disparaît, l'animal a atteint une profondeur appropriée de l'anesthésie pour effectuer des tests auditifs.
3. Protéger les yeux de la dessiccation et la kératoconjonctivite sèche secondaire par l' administration topique de suppléments lacrymaux, tels que des gels à base de méthylcellulose-hydroxypropyle.
4. Gardez la souris à la température physiologique (37,5-38 ° C) pendant toute la procédure. Pour éviter des interférences électriques, utilisez un tapis de pompe à eau et de chauffage chauds. Surveiller la température du corps avec des sondes rectales. Il faut toujours prendre soin de ne pas surchauffer l'animal.
   NOTE: Nous vous recommandons de nettoyer le coussin chauffant avec un désinfectant de surface entre les souris.0; Pour l'induction d'anesthésie et de récupération, coussins chauffants électriques, lampes à incandescence ou infrarouges peuvent être utilisées.
5. procédure ABR
   NOTE: Pour l'enregistrement ABR, utilisez un poste de travail d'ordinateur avec une carte son intérieur pour créer des formes d'onde (numérique à analogique, sortie DA, conversion) et de numériser des formes d'onde de réponse électrique (analogique à, entrée AD numérique), un atténuateur, un oscilloscope et un un amplificateur à faible impédance. Postes de travail auditives modernes (c. -à- Tucker Davis Techonologies) comprennent tous ces composants dans un système compact unique.
   1. Placer la souris anesthésiées en position couchée sur les plots de chauffage à l' intérieur d' une chambre d'atténuation acoustique pour éviter les interférences de bruit ambiant et de la réverbération (figure 1).
   2. Fournir des stimuli acoustiques dans le conduit auditif externe. Utilisez stimuli préréglés ou de nouveaux signaux conçus avec le logiciel approprié. Connectez la sortie du poste de travail DA à l'enceinte sélectionnée.
      NOTE: Frehaut-parleurs e-champ ou champ fermé insérées dans le canal auditif externe pourraient être utilisés. Les premiers sont préférés lorsque l'on travaille avec des souris en raison de la difficulté d'insertion de la sonde et de l'étalonnage sonore dans des systèmes fermés. haut-parleurs de champ libre stimulent les deux oreilles et provoquent une réponse binaural. Pour obtenir des réponses principalement monophoniques avec haut - parleurs de champ libre, l' activité controlatéral doit être éliminé par l' occlusion (ie avec des bouchons d'oreille) ou en masquant le bruit.
      1. Placez champ libre haut-parleur à une distance fixe (généralement 5-20 cm) face à la tête ou l'oreille sélectionnée avec le centre de l'enceinte aligné avec le conduit auditif externe. Veiller à ce qu'aucun obstacle se situent entre le haut-parleur et l'oreille et que le pavillon est complètement ouvert.
   3. Placer des électrodes en acier inoxydable d'aiguilles hypodermiques comme suit: i) l'électrode active (positif) dans le cuir chevelu entre les oreilles (sur le sommet du crâne), ii) la référence (négative) de l'électrode, dans la parotiderégion sous le pavillon, et iii) l'électrode de masse dans la région du membre arrière, la queue ou arrière (Figure 1).
      1. Vérifier l'impédance électrique dans les électrodes positives et négatives. Assurez-vous que l'impédance est inférieure à 3 kOhm (idéalement 1 kOhm). Si elle est supérieure, repositionner, propre avec de l'alcool ou de remplacer les électrodes.
   4. Pour l' enregistrement ABR, générer des clics à large bande et les fréquences de sons purs et présents à la diminution des intensités 90-10 dB par rapport au niveau de pression acoustique (SPL) en 5-10 dB SPL étapes ^{27, 29, 30.}
      1. Bref clic ou ton Présent éclatèrent stimuli (1-5 ms) en commençant par de haut niveau (soit 80 ou 90 dB SPL) et de réduire l'intensité de 5-10 dB , SPL. Inscrivez la réponse électrique dans les 10 premières ms après la stimulation (évoqués réponses ABR apparaissent à 6-8 ms).
         NOTE: Pour cette raison, les taux de stimulationne devrait pas être supérieure à 50 stimuli / s (taux normal 20-50).
   5. Amplifier, record et la moyenne de la réponse électrique évoquée à chaque stimulus et de l'intensité. Utilisez un amplificateur à faible bruit et un bon rapport signal-bruit, et le connecter à l'entrée AD.
      NOTE: ABRs ont de très faibles amplitudes, typiquement inférieure à 1 mV (crête à crête) et doivent être enregistrés en utilisant un amplificateur à très faible bruit. Chez les souris auditives normales, les vagues ABR claires émergent après une moyenne de 100 - 200 réponses, mais pour obtenir des enregistrements de haute qualité, ou dans le cas de la déficience auditive, plus de répétitions sont recommandées (750-1,000) ^27.
   6. Visuellement déterminer le seuil ABR pendant le test.
      REMARQUE: Le seuil ABR est la plus faible intensité des stimuli sonores qui déclenche une ABR fiable d' enregistrement avec des vagues I à IV tension 2 SD clairement visible et moyenne crête à crête au- dessus de l'activité de fond moyenne ^31. Ces données doivent être confirmées dusonner une analyse hors-ligne, ainsi que d'autres paramètres, y compris la latence de pointe et interpeak, et des vagues amplitudes.
   7. Effectuer l'analyse des données manuellement ou automatiquement.
      1. Pour une analyse manuelle, identifier les 4-5 ondes ABR (I, II, III ... etc.) Et marquer les sommets (P1, P2, P3 ...) et les vallées (N1, N2, N3 ...) pour chaque vague. Une fois l'analyse terminée, les données d'exportation vers un tableur ou un fichier texte.
         REMARQUE: Un logiciel spécifique pour l'enregistrement de réponse électrique effectue habituellement l'analyse automatiquement. Des mesures supplémentaires peuvent être déterminées dans l'enregistrement ABR en réponse à une intensité fixe (soit 70 ou 80 dB SPL) ou à des intensités relatives au clic individuels seuils (soit 15 dB SPL - dessus du seuil).
6. Effectuer une analyse statistique des données ABR en utilisant le logiciel approprié. Selon la conception expérimentale, utilisation standard jumelé T-test ou d'analyse de la variance (ANOVA) pour comparer principale Paramé ABRtres dans les différents groupes ^{26, 30.}
   NOTE: Dans les études longitudinales, de nombreuses données fonctionnelles sont collectées à partir du même animal à différents points temporels (avant et après microchirurgie). Dans ce cas, un modèle répété linéaire mesure test général fournit une analyse détaillée des écarts.

3. Préparation du véhicule

1. Préparer et utiliser des solutions de véhicules dans des conditions stériles.
   NOTE: Les solutions liquides sont généralement effacés rapidement par la trompe d'Eustache. Différents systèmes d'administration injectables peuvent être utilisés pour augmenter le temps de séjour du médicament dans l'oreille moyenne, y compris des hydrogels et des nanoparticules ^32.
   1. Pour préparer CGP-hydrogel, dissoudre 75% chitosane désacétylé dans 0,2 M d'acide acétique donne un 1,5-2% (poids / poids) solution de chitosane. Ajouter 9% glycérophosphate (poids / poids) à cette solution ^7. Préparer la solutionjuste avant l'administration et à stocker l'hydrogel à 4 ° C jusqu'à utilisation.
      NOTE: Le CGP-hydrogel est modérément visqueuse mais toujours injectable à cette température. En dessous de 4 ° C, il se transforme en une phase solide, en bloquant son application. Après l'application, le CGP subit une transition de phase en un gel semi-solide à environ 15 min à 37 ° C.
   2. Aliquote (0,5 ml) tampon RL commerciale et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.

4. Procédures de microchirurgie

1. Provoquer anesthésie générale avec la kétamine à base de combinaisons de sédatifs et analgésiques (ie kétamine 100 mg / kg, medetomidine 0,05 mg / kg et phentanile 0,025 mg / kg) par injection intrapéritonéale, suivie par des agents inhalés (c. -à -isoflurane).
   1. Après l' administration d' agents injectables, ajuster le masque anesthésique au museau de la souris et branchez l'O ₂ alimentation à la vapeur d' isoflurane. Maintenir l'anesthésie par inhalation au cours de lamicrochirurgie et surveiller le plan anesthésique avec le réflexe toe-pincement et de la respiration. Commencer la préparation chirurgicale lorsque le réflexe est totalement aboli et la souris présente une respiration régulière.
   2. Maintenir la température du corps avec les coussins chauffants pendant toute la procédure et à protéger les yeux contre kératite avec un gel à base de méthylcellulose hydroxypropyle.
2. Préparer une zone chirurgicale propre en utilisant des champs stériles. Stériliser les instruments de microchirurgie à un stérilisant de billes de verre avant la chirurgie. Maintenir des conditions stériles pendant la procédure chirurgicale entière (gants stériles, des rideaux, des instruments chirurgicaux, etc.).
3. microchirurgie
   1. Bullostomy
      NOTE: Bullostomy est une procédure unilatérale. Faire fonctionner une oreille de la souris et utiliser l'oreille controlatérale comme témoin.
      1. Placez la souris dans une position couchée décubitus. Préparer la zone chirurgicale à la surface ventrale du cou à l'aide d'une tondeuseretirer la fourrure. Nettoyer la peau avec une solution antiseptique à base d'iode povidone, et le couvrir avec des champs stériles.
      2. L'utilisation d'un scalpel, faire une incision longitudinale de 2 cm de la mandibule à la clavicule.
      3. Sous un grossissement avec un microscope chirurgical, identifier les glandes sous-maxillaires et séparer les deux avec une pince. Rentrez les glandes sous-maxillaires et de localiser l'origine du muscle digastrique et le nerf facial.
      4. Faire une incision dans l'origine du muscle digastrique avec une paire de ciseaux, et rétracter ventral, exposant la face inférieure médiale sous - jacente de la bulle tympanique.
      5. Faire une ouverture dans la bulle en perçant avec une aiguille 27 G (figure 2A). Localisez l'artère stapédienne et la RW membrane caudale à elle (figure 2B). Nettoyer le sang à partir de la zone percée avec une éponge de gélatine absorbable.
      6. L'utilisation d'un cathéter G 34 et un micro en verre seringue, injecter lentement 3-5 μL de solution de véhicule (CGP-hydrogel ou RL) par l'intermédiaire bullostomy directement sur le créneau RW, de le remplir (figure 2C). Sceller le bullostomy avec 1-2 gouttes de colle tissulaire.
      7. Remettre les glandes sous-maxillaires dans leur position initiale et fermer les incisions de la peau avec 5-0 soie suture chirurgicale. Appliquer un antiseptique autour de l'incision pour éviter l'infection de la plaie à base de chlorhexidine. REMARQUE: Les sutures absorbables et non absorbables peuvent être utilisés. des sutures non absorbables doivent être éliminés en 2 semaines. La soie est pas recommandé pour la fermeture de la peau puisque son utilisation est associée à une infection de l'incision et les réactions tissulaires locales.
   2. injection transtympaniques bilatérale
      1. Placer la souris dans la position de décubitus latéral et préparer un champ opératoire aseptique en dessous du conduit auditif externe , comme décrit dans 4.3.1.1.
      2. Faire incision a 0,5 cm longitudinale dans la partie verticale du conduit auditif externe à proximité du tragus et section du pli cutané interne du pavillon (en option).
      3. Localisez la membrane tympanique à l'extrémité du canal de l' oreille externe à l' aide d' un microscope chirurgical (Figure 2F) et identifier les pars supérieurs flaccida et la pars inférieurs TENSA, qui est divisé en sections antérieures et postérieures par le manche du marteau (figure 2F) .
      4. Faire un petit myringostomy dans la partie caudale de la pars flaccida. Faire une incision supplémentaire dans la tensa pars de la membrane tympanique, pour permettre l' évacuation de l' air lors de l' injection ^33. Injecter doucement 10-15 pi de véhicule (CGP-hydrogel ou RL) solution avec un micro en verre seringue reliée à un G cathéter 34 à travers la pars flaccida, à proximité de la niche RW jusqu'à ce que l'oreille moyenne est clairement plein.
      5. Fermer les incisions de la peau avec une suture chirurgicale 5-0 en soie et propre comme décrit dans 4.3.1.7.
      6. Placer la souris sur son autre côté, et opermangé l'oreille controlatérale (étapes 4.3.2.1 à 4.3.2.5).
4. Gardez la souris sur un coussin chauffant jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
5. Surveiller l'état du corps, l'activité et la présence de signes de douleur ou de stress. Fournir des analgésiques , si nécessaire ( par exemple la buprénorphine à 0,05 mg / kg, carprofène 5-10 mg / kg). Examiner la plaie chirurgicale quotidienne et enlever la fermeture de la peau 7-14 jours après l'opération après avoir vérifié que la blessure est guérie.

5. Morphologique Évaluation de Cochlear cytoarchitecture

1. Euthanasier la souris à la fin de l'expérience (dans ce travail 28 jours postmicrosurgery), avec une overdose de pentobarbital intrapéritonéale (100 mg / kg) pour étudier les effets à long terme de la chirurgie.
2. Effectuer une perfusion transcardial de froid 0,1 M tamponnée au phosphateSalin (PBS), pH 7,5, suivi de 4% (poids / volume) de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS 0,1 M, pH 7,5 , comme décrit ^26.
   ATTENTION: Le paraformaldéhyde est très toxique; éviter tout contact avec la peau, les yeux ou les muqueuses. Éviter de respirer la poudre lors de la mesure et de la préparation.
3. Utiliser un microscope stéréoscopique pour disséquer l'oreille interne de l'os temporal , comme décrit ^{34, 35} sans séparer le vestibulaires et les composants de la cochlée de l'oreille interne.
4. Fixer l'oreille interne isolée avec 4% (en poids / v) PFA dans 0,1 M PBS, pH 7,5 à 4 ° C pendant 12 h avec agitation douce. Lavage 3x pendant 5 min avec du PBS 0,1 M, pH 7,5.
5. Détartrer les échantillons avec de l'acide éthylènediaminetétraacétique 10% (EDTA), préparé dans du PBS 0,1 M, pH 6,5 à 4 ° C pendant 10 jours avec une agitation constante, en changeant la solution d'EDTA tous les 3 jours.
6. Lorsque cochleae acquérir une consistance molle, enlever EDTA et laver 3x pendant 5 min avec 0,1 M de PBS, pH 7,5, wie agitation à RT.
7. Incluez les échantillons dans la cire de paraffine comme décrit ³⁴ et font 7 um sections cochléaires épaisses parallèles au modiolus.
8. Pour évaluer cytoarchitecture cochléaire, sections de tache avec l' hématoxyline et l' éosine (H & E) ³⁰ et utiliser un microscope optique relié à un appareil photo numérique pour capturer des images avec 4X et 20X lentilles.

6. Cochlear Gene Expression

1. Nettoyer la surface de travail et des instruments chirurgicaux avec une solution de décontamination RNAse.
2. Euthanasier la souris comme décrit dans 5.1 et disséquer l'oreille interne de l'os temporal en utilisant un microscope rapidement. Immerger l'oreille interne dans un plat en verre contenant de l'acide ribonucléique (ARN) protecteur et réactif stabilisant.
3. Retirer l'os pétreux restante avec une pince de bijoutier et séparer délicatement la cochlée du vestibule en utilisant les yeux ciseaux de Vanna ^35.
4. Immédiatement transfer la cochlée dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml avec 80 ul d'ARN protecteur et stabilisant solution et congeler le tissu en plaçant le tube dans la glace sèche. Conserver les échantillons cochléaires à -70 ° C jusqu'à utilisation.
5. Isoler ARN cochléaire comme décrit ³⁵ et de déterminer sa qualité et la quantité spectrophotométrie.
6. Générer ADNc cochléaire à partir de quantités égales d'ARN total de la souris en utilisant une transcription inverse kit commercial.
7. Effectuer qRT-PCR pour amplifier l' acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) en triple pour mesurer la transcription de gènes ^{35, 36.}
   NOTE: Dans ce pro- travail et les transcriptions des Il1b, IL6, TGFb1, TNFa, IL10 et DUSP1 gènes anti-inflammatoires ont été mesurés.
8. Calculer les taux d'expression relatifs en normalisant seuil de cycle de transcription cible (CT) au niveau de la moyenne arithmétique du niveau du gène de référence et la quantification relative en normalisantgroupe problème des niveaux de transcription à la moyenne arithmétique du groupe calibrateur ^37.

Résultats

Audition a été testé par ABR avant et à plusieurs reprises après microchirurgie pour évaluer l'impact sur la fonction auditive (figure 1A). Registres ABR ont été réalisées sous anesthésie pour éviter tout mouvement et de tension artefacts animaux et donc d' améliorer sa reproductibilité ^27. Administré par voie intrapéritonéale combinaisons de kétamine à base ou isoflurane inhalation ont été habituellement utilisé pour anesthésier les animaux lors des tests de ABR. La combinaison kétamine / xylazine fournit un (2-3 min) induction courte durée d'action et une phase d'entretien stable, sûr tout en effectuant des registres de ABR. Il convient de noter que l' isoflurane peut affecter la mesure ABR sensibilité ^38. Pour les registres ABR, les électrodes sous - dermiques sont placés dans des endroits spécifiques (figure 1B) et l'impédance électrique est mesurée. Si l'impédance est 3 kohms ou plus, le positionnement de l'électrode doit être contrôlée pour éviter altrations dans ABR amplitude de l'onde.

Intratympanique livraison est effectuée chez la souris par deux procédures microchirurgicales (figure 2). L' exposition de la bulle au cours bullostomy implique la rétraction des glandes sous - maxillaires et digastrique. Cette procédure est effectuée avec un soin extrême , car l'artère carotide et le nerf vagal sont très proches (figure 2A). Ensuite, la bulle est percé pour localiser l'artère stapédienne et la membrane RW (figure 2B). Pour éviter la fissuration des os, une petite ouverture de 0,5 mm est faite avec une aiguille 27 G avant de percer. Le 34 G cathéter est dirigé à travers le bullostomy vers la membrane RW et un petit volume de véhicule est livré sur la niche de fenêtre (figure 2C). L'injection transtympaniques est effectuée par une incision dans la pars flaccida de la membrane tympanique avec une aiguille 27 G; un plus grand peut provoquer àl'oreille dans la membrane. Avant l'injection, nous recommandons de faire une incision supplémentaire dans la tensa pars pour permettre l'évacuation de l' air lors de l' injection du véhicule (Figure 2F). Il est essentiel d'éviter les dommages de l'artère stapédienne, une branche de l'artère carotide interne, ce qui conduirait à une hémorragie mortelle.

Les souris ayant bullostomy ou transtympaniques chirurgies auditive tout au long de l'expérience, semblable aux contrôles non opérés (figure 3) conservées. seuils ABR en réponse à des clics et des rafales de tonalité n'a pas changé de manière significative après la microchirurgie par rapport aux valeurs de base. Aucune différence significative n'a été observée entre bullostomy et les approches transtympaniques. Des études morphologiques ont été effectuées pour confirmer la livraison du véhicule correct dans l'oreille moyenne et d'évaluer les changements potentiels causés par les procédures en cytoarchitecture cochléaire. Aucun des principaux cochléaires régions saltérations morphologiques howed et les animaux des deux procédures ont présenté une morphologie similaire de toutes les structures cochléaires (Figure 4A). En outre, les profils cochléaires pour l'expression des gènes des cytokines pro- et anti-inflammatoires ont aussi été étudiés. Malgré l' absence de différences fonctionnelles dans les données ABR entre les deux procédures, bullostomy a provoqué une réponse inflammatoire plus forte que l'approche transtympaniques (figure 4B).

Figure 1. Conception expérimentale et de l' évaluation de l' ouïe. (A) Schéma de la procédure expérimentale. Audition a été évaluée avec ABR avant et après microchirurgie. échantillons cochléaires ont été obtenus 28 jours après microchirurgie. (B) souris anesthésiée en position couchée sur le coussin chauffant dans une chambre insonorisant, avec electrod subdermales placé dans le cuir chevelu entre les oreilles sur le sommet du crâne (actif, positif); dans la région parotide en dessous du pavillon (référence, négatif) et dans le dos (au sol). Le haut-parleur en champ libre est placé à une distance fixe (5 cm) face à l'oreille droite. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. microchirurgie pour l' application du véhicule. (A) Vue ventrale de la bulle tympanique. La bullostomy est effectuée caudale du nerf facial avec une aiguille 27 G. (B) RWN et de l' artère stapédienne peuvent être observées à travers la perforation. (C) 34 G cathéter est dirigé à travers le bullostomy vers le créneau RW. (D) Un mois après la bullostomy, une petite osseusecicatrice est présent dans le site d'ouverture (flèche). (E) Vue latérale de l'oreille, montrant l'incision dans le conduit auditif externe et la membrane tympanique (carré). (F) Détail de la membrane tympanique. Une ponction a été faite au quadrant supérieur caudale de la membrane tympanique en utilisant une aiguille 27 G (astérisque noir, dans la pars flaccida); l'injection a été faite à travers cette perforation au moyen d'un cathéter 34 G. Un trou supplémentaire a été faite dans le quadrant inférieur crânienne de la membrane (astérisque blanc, dans le Tensa SRAP) avant l'injection d'équilibrer la pression tympanique. (G) Vue du 34 G cathéter à travers la ponction de la membrane tympanique. (H) Vue de la cochlée région 24 h après la microchirurgie. RWN rempli de solution de véhicule (astérisque). Lat, latéral; Ro, rostrale; Do, dorsale; Ma, malleus; Co, cochlée; OW, fenêtre ovale; RWN, niche de fenêtre ronde. Les barres d'échelle = 200 pm A, D, F; Barres d'échelle = 100 um B, C, H; Les barres d'échelle = 1000 pm dans E, G. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Évaluation de l' ouïe. Evolution des seuils ABR (moyenne ± SEM, en dB SPL) en réponse à cliquer (A) et le ton salve (B) stimuli, avant et 7, 14 et 28 jours après la micro-chirurgie chez le mâle de huit semaines d'âge C57BL / 6J les souris. Bullostomy (orange, n = 11); injection transtympaniques (bleu; n = 6); non exploité (gris; n = 11), S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

jpg "/>
Figure 4. Cochlear Morphologie et l' analyse de l' expression génétique. (A) Morphologie des principales structures cochléaires à la base de la cochlée. Haematoxilin-éosine des sections à mi-modiolar paraffine (7 pm), des oreilles de souris non-exploités, et les souris un mois après l'intervention de microchirurgie par bullostomy ou injection transtympaniques. Le compartiment des médias scala (a, b, c) présente tous les composants principaux. Les détails de chacune de ces structures (boîtes numérotées) sont présentés dans les images suivantes: ganglion spiral (1), organe de Corti (2), ligament spirale (3) et strie vasculaire (4). cellules ciliées internes (astérisque); cellules ciliées externes (tête de flèche). Les barres d'échelle = 100 um a, b, c; Barres d'échelle = 50 pm dans un 1,2,3,4. (B) d'expression Cochlear de marqueurs inflammatoires 28 d après la microchirurgie. Comparaison entre bullostomy (orange) et injection transtympaniques (bleu) et à des souris non opérés (blanc). *: Vs non-exploitégroupes exploités; ^: Comparaison entre les groupes exploités. Les niveaux d'expression génique sont représentés comme 2 ^{- ΔΔCt,} ou n fois la différence par rapport à group.Values non opérés sont présentées comme moyenne ± SEM de triplicats provenant d' échantillons de pool de 3 souris par condition. Signification statistique: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^{^^} P ≤0.01; ^^^ P ≤0.001. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Administration locale de médicaments à l'oreille interne peut se faire directement par injection intracochléaire ou indirectement par l' administration intratympanique, plaçant le médicament dans l'oreille moyenne ^{4, 19, 39.} administration intracochléaire fournit le contrôle et l'administration de médicaments précise à la cochlée, en évitant la diffusion à travers les membranes de fenêtre, basal-à-apicale gradients de concentration et la clairance par la trompe d'Eustache. Cependant, il est généralement une procédure très invasive qui nécessite une microchirurgie complexe et délicat ^{7, 39.} Dans ce contexte, l'industrie se développe de nouveaux enrobés, des dispositifs implantables pour la libération prolongée du médicament ^{40, 41.} D'autre part, l'administration intratympanique est une procédure minimalement invasive et facile à réaliser qui permet l'injection de grands volumes de la drug dans l'oreille moyenne, alors que les paramètres pharmacocinétiques ne sont pas faciles à contrôler. La majorité du médicament est autorisé par la trompe d' Eustache et la fraction restante doit diffuser à travers la membrane RW pour atteindre la cochlée ^18. RW est le site d'absorption maximale des substances de l'oreille moyenne dans le tympanique conduit de périlymphe rempli de la cochlée ^7. Il est une structure à trois couches semi - perméable, bien que sa perméabilité dépend des caractéristiques du médicament ( la taille, la concentration, la solubilité et la charge électrique) et sur les systèmes de transport transmembranaire (diffusion, le transport actif ou phagocytose) ^42. La fenêtre ovale et capsules otiques sont entrées alternatives mais moins efficaces à cochlée ^{43, 44.}

Ici, nous démontrons et comparer les deux méthodes de microchirurgie pour la délivrance ciblée de médicaments dans l'oreille moyenne de la souris: bullostomy et transtympales procédures d'injection nic. étapes critiques communes à ces procédures comprennent: i) une évaluation de l'audition avant et après la microchirurgie, ii) la préparation d'une solution homogène du véhicule dans des conditions stériles, iii) une surveillance attentive de la procédure et le suivi des animaux température du corps et constantes anesthésie, iv ) lente mise en place du volume approprié de véhicule ciblant le RW, et iv) la prise d'échantillons cochléaires pour compléter l'analyse moléculaire et morphologique.

Approches rétroauriculaires et ventrales pour bullostomy ont été décrits ^{7, 45.} Nous avons utilisé l'approximation ventrale parce que dans notre expérience , il a donné lieu à moins de morbidité et a fourni un meilleur accès à la RW ^46. Injections transtympaniques sont généralement effectuées par les pairs TENSA de la membrane tympanique, antérieures ou postérieures à la manubrium du marteau ^12. Dansce travail nous a effectué une modification de la technique, une injection à travers la pars flaccida au - delà du marteau avec une ponction supplémentaire précédente du tensa pars pour permettre l' évacuation de l' air lors de l' injection.

L'injection transtympaniques était moins invasive que la bullostomy, bien que les deux microchirurgies étaient rapides (20 et 5 min par oreille pour bullostomy et approche transtympaniques respectivement), avec des temps de récupération post-opératoires et aucune morbidité. Plus important encore, les deux procédures maintenus audience et les paramètres ABR étaient identiques à celles déterminées avant la microchirurgie. L'approche transtympaniques prend moins de temps que le bullostomy et peut être réalisée dans les deux oreilles du même animal au cours de la même intervention. Les avantages de l'injection transtympanique sont donc qu'il peut être réalisé de manière bilatérale et répétée, si nécessaire. D'autre part, permet un accès visuel bullostomy direct à la membrane RW et permet filling de la niche RW. En revanche, l'injection transtympaniques ne permet pas le contrôle du placement de véhicule dans le créneau RW.

Les procédures présentées dans ce travail décrivent comment effectuer une livraison du véhicule local de la drogue à l'oreille moyenne pour les applications pré-cliniques telles que l'évaluation de l'ototoxicité et de l'évaluation de l'efficacité dans la perte d'audition. Deux procédures de microchirurgie sont décrits qui fournissent des méthodes alternatives avec des avantages et des inconvénients spécifiques. Les deux préserver l'audition et ne provoquent pas de modifications morphologiques. L'inflammation locale est décrite comme une complication potentielle de bullostomy. Un ensemble de techniques complémentaires sont également décrites pour les procédures postopératoires, y compris l'audience, les évaluations d'expression de marqueurs morphologiques et inflammatoires. Les applications futures de ces techniques comprennent l'évaluation préclinique de nouvelles thérapies pour la perte, y compris des approches génétiques, cellulaires et pharmacologiques entendu, dans des modèles animaux. intratympanique administrations assurer la fourniture du traitement dans l'oreille moyenne, en contact avec la membrane de fenêtre ronde, facilitant le passage dans le périlymphe sans dommage cochléaire évidente.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kétamine (Imalgene)	Merial	# 2529	ATTENTION : éviter le contact du médicament avec la peau ou les yeux ou les injections auto-infligées accidentelles
Xylacine (Xilagesic)  ;	Calier	# 6200025225
Gel lubrifiant pour les yeux (Artific)	Angelini	# 784710
Pompe à eau  ;	Gaymar	# TP472
Désinfectant de surface	José ; Collado SA	# CR-36
Électrodes à aiguille sous-cutanées  ;	Spes Medica	# MN4013D10SM
Scène de tête à faible impédance  ; (RA4LI)	Tucker-Davis Technologies
(haut-parleur magnétique multi-champs MF1)	Tucker-Davis Technologies
System 3	Tucker-Davis Technologies		Le système est composé de : processeur RP2, station de base RA16, atténuateur PA5, amplificateur SA1, amplificateur de microphone MA3, tête d’impédance RA4LI et préamplificateur médusa RA4A.
Logiciel SigGenRP	Tucker-Davis Technologies
Coussins chauffants (coussinets TP)	Gaymar	# TP3E
Logiciel de statistiques (SPSS)	IBM
Chitosan (désacétylé)	Sigma-Aldrich	# C3646
Acide acétique (glacial)	VWR	# 20103.295	ATTENTION : liquide inflammable, corrosion cutanée, respiratoire et cutanée sensibilisant
Glycérophosphate	Sigma	# SLBG3671V
Ringer´ ; s lactate	buffer Braun	# 1520-ESP
Medetomidine (Domtor)	Esteve	# 02400190
Phentanile (Fentanest)	Kern Pharma	# 756650.2	ATTENTION :   ;   ; éviter le contact du médicament avec des plaies ouvertes ou des injections auto-infligées accidentelles
Isoflurane (IsoVet)	Braun	# 469860	ATTENTION : Éviter les expositions à des concentrations maximales supérieures à 2 ppm de tout agent anesthésique halogéné pendant une période d’échantillonnage ne dépassant pas 1 h.
Microscope chirurgical (OPMI pico)	Champ stérile Zeiss
(Foliodrape)	Hartmann	# 277546
Stérilisateur  ;	Fine Science Tools	# 18000-45
Lame de scalpel	Swann Morton	# 0205	ATTENTION
Manche de scalpel	Fine Science Tools	# 91003-12
Antiseptique à base de povidone iodée (Betadine)	Meda Pharma SAU	# M-12207
Ciseaux Adventitia (SAS18-R8)	S& T	# 12075-12
Ciseaux courbés	CM Instrumente	# AJ023-18
Pince	CM Instrumente	# BB019-18
Éponge à gélatine (Spongostan)	ProNaMAc	# MS0001
Microlance 27 G	Becton Dickinson	# 302200
Seringue d’un microlitre (701 RN SYR)	Hamilton	# 80330
Cathéter (Microfil 34 G)	World Precision Instruments  ;	# MF34G-5
Adhésif tissulaire (Vetbond)	3M	# 1469SB
Porte-aiguille (Porte-aiguille à manche rond)  ;	Outils de science fine	# 12075-12
Suture chirurgicale en soie (Soie tressée 5/0)	Arago	# 990011
Chlorhexidine (Cristalmina)	Salvat	# 787341
Pentobarbital  ; (Dolethal)	Ventoquinol	# VET00040	ATTENTION :   ;   ; éviter le contact du médicament avec des plaies ouvertes ou des injections auto-infligées accidentelles
Stéréomicroscope (Leica)	Meyer Instruments	# MZ75
Vannas Micro-dissection (œil) Ciseaux Action à ressort	Harvard Apparatus	# 28483
Bijoutier' s forceps (Dumont)	Fine Science Tools	# 11252-00
Solution de décontamination de la RNase  ; (RNaseZap)	Sigma-Aldrich	# R2020
Solution de stabilisation de l’ARN  ; (ARN)	Thermo Fisher Scientific	# R0901
Kit de purification de l’ARN (RNeasy)	Qiagen	# 74104
Kit de transcription inverse de l’ADNc	Thermo Fisher Scientific	# 4368814
Test d’expression génique (sondes TaqMan)	Thermo Fisher Scientific	Il1b : Mm00446190_m1 Il6 : Mm00446190_m1 Tgfb1 : Mm01178820_m1 Tnfa : Mm99999068_m1 Il10 : Mm00439614_m1 Dusp1 : Mm00457274_g1 Hprt1 : Mm00446968_m1
Système de PCR en temps réel (7900HT)	Applied Biosystems	# 4329001
Paraformaldéhyde (PFA)	Merck	# 1040051000	TOXIQUE : Le PFA est un potentiel cancérogène
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Merck	# 405491	ATTENTION :  ; nocif en cas d’inhalation, peut causer des lésions aux voies respiratoires en cas d inhalé.
Solution d’hématoxyline	Sigma-Aldrich	# HHS16
Eosin Y	Sigma-Aldrich	# E4382	Dangers : provoque une irritation oculaire grave