Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

20.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/54968

⸱

24 décembre 2016

 ,  , 
1Division of Hygiene and Medical Microbiology, Medical University of Innsbruck

Dans cet article

Résumé

Ici, nous démontrons comment les monocytes sont isolés par séparation par billes magnétiques des cellules mononucléées du sang périphérique après centrifugation par gradient de densité du sang anticoagulé humain. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains sont différenciés en cellules dendritiques immatures et sont prêts pour des procédures expérimentales dans un cadre non clinique.

Résumé

Les cellules dendritiques (DC) reconnaissent les structures étrangères de différents agents pathogènes, tels que les virus, les bactéries et les champignons, via une variété de récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) exprimés à leur surface cellulaire et activent et régulent ainsi l’immunité.

La fonction principale des DC est l’induction de l’immunité adaptative dans les ganglions lymphatiques en présentant des antigènes via les molécules du CMH I et du CMH II aux lymphocytes T naïfs. Par conséquent, les DC doivent migrer de la périphérie vers les ganglions lymphatiques après la reconnaissance des agents pathogènes sur les sites d’infection. Pour les expériences in vitro ou les stratégies de vaccination des DC, les CD dérivés des monocytes sont couramment utilisés. Ces cellules présentent des similitudes dans la physiologie, la morphologie et la fonction avec les cellules dendritiques myéloïdes conventionnelles. Ils sont générés par la stimulation de l’interleukine 4 (IL-4) et du facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) de monocytes isolés de donneurs sains. Ici, nous démontrons comment les monocytes sont isolés et stimulés à partir de sang humain anticoagulant après enrichissement de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par centrifugation à gradient de densité. Les monocytes humains sont différenciés en DC immatures et sont prêts pour des procédures expérimentales dans un cadre non clinique après 5 jours d’incubation.

Introduction

Les cellules dendritiques (CD) sont les plus importantes cellules présentant des antigènes les spécialisés de notre système immunitaire. Immature PED (iDC) réside dans la peau ou dans les tissus des muqueuses et sont donc parmi les premières cellules immunitaires d'interagir avec les agents pathogènes envahisseurs. PED représentent le pont entre l'inné et le système immunitaire adaptatif 1, car ils peuvent activer des réponses T et des cellules B suite à la détection d'agents pathogènes. En outre, elles contribuent à la réponse immunitaire pro-inflammatoires en raison de la sécrétion de grandes quantités de cytokines, comme l'IL-1β, IL-6 et IL-12. DC activer également les cellules NK et d'attirer d'autres cellules immunitaires vers le site de l'infection par le chimiotactisme.

Les CD peuvent être divisés en cellules dendritiques immatures (iDC) et des cellules dendritiques matures (MDC) 2 en fonction de leur morphologie et de la fonction. Après la reconnaissance d'antigènes étrangers par l' un des nombreux récepteurs de reconnaissance des formes (par exemple, des récepteurs de type Toll, du type Cdes lectines, des récepteurs ou complément) abondamment exprimé sur la surface cellulaire, iDC subissent des changements importants et commencent à arriver à maturité. Au cours de ce processus de maturation, des récepteurs pour l' antigène de capture sont régulés à la baisse, tandis que les molécules essentielles à la présentation de l' antigène sont régulés à la hausse 3. Les DC matures réguler à la hausse les complexes majeurs d'histocompatibilité I et II (CMH I et II), les molécules co-stimulatrices telles que CD80 et CD86, qui sont essentiels pour la présentation des antigènes et l'activation des lymphocytes T. En outre, l'expression de CCR7 des récepteurs de chimiokines sur la surface cellulaire est induite, ce qui permet la migration des CD à partir des tissus périphériques vers les ganglions lymphatiques. La migration est favorisée par le "rolling" des DC le long d' un ligand de chimiokine 19 (CCL19 / MIP-3b) et un ligand de chimiokine 21 (CCL21 / SLC) Gradient aux ganglions lymphatiques 4-6.

Après la migration, mDCs présentent l'antigène traité pour naïfs cellules CD4 + et CD8 + T, ainsi ininégo- une réponse immunitaire adaptative contre l'envahisseur pathogène 7. Cette interaction avec des cellules dans les ganglions lymphatiques T est également associé à la propagation du virus 8. D' autres études in vitro ont révélé que les PED efficacement la capture et le transfert du VIH aux lymphocytes T et que cette transmission se traduit par une infection vigoureuse 9-12. Ces expériences mettent en évidence que in vivo du VIH exploite les PED comme des navettes de la périphérie vers les ganglions lymphatiques. Lors de la présentation de l'antigène, les CD sécrètent des interleukines clés qui façonnent la différenciation des cellules T auxiliaires effectrices, et par conséquent, les résultats de l'ensemble de la réponse immunitaire contre le microbe est déterminé à cette interaction très. En plus de type 1 (Th1) et de type 2 (Th2) effectrices des cellules T, d' autres sous - ensembles de cellules CD4 + T auxiliaires (par exemple, le type 17 (Th17) et le type 22 (cellules TH22) T) ont été décrits, et leur induction et fonction ont été étudiés à fond. DC sont en outre impliqués dansla génération de lymphocytes T régulateurs (Treg) 13,14. Ces cellules sont immunosuppresseur et peuvent arrêter ou réguler négativement l'induction ou la prolifération des cellules T effectrices et sont donc essentiels pour le développement de l'immunité et la tolérance.

DC classiques humaines (CDCS) comprennent plusieurs sous - ensembles de cellules ayant une origine myéloïde (ie, les cellules de Langerhans (LCS) et cutanée et DC interstitiels) ou une origine lymphoïde (ie, les DC plasmacytoïdes (pDC)). Pour les expériences in vitro ou des stratégies de vaccination DC, les DC dérivées de monocytes sont couramment utilisés comme modèle pour les PED dermiques. Ces cellules présentent des similitudes dans la physiologie, la morphologie et la fonction de cellules dendritiques myéloïdes classiques. Elles sont produites par l'addition d'interleukine 4 (IL-4) et granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) , les monocytes isolés à partir de donneurs sains 12,15-18. Les cellules dendritiques peuvent également être directement isolés à partir de biopsies cutanées ou des muqueuses, ou peut même be développé à partir de cellules CD34 + progénitrices hématopoïétiques isolées à partir d' échantillons de sang de cordon ombilical obtenues ex utero. Ici, nous montrons comment les monocytes sont isolés et stimulés du sang humain anticoagulé après que les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) enrichissement par centrifugation en gradient de densité. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains dans des conditions spécifiques sont différenciées en iDC et sont prêts pour les procédures expérimentales dans un cadre non clinique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

déclaration éthique: le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants donneurs de sang par l'Institut central de transfusion sanguine et Département Immunological, Innsbruck, Autriche. L'utilisation d'échantillons de restes anonymes à des fins scientifiques a été approuvé par le Comité d'éthique de l'Université médicale d'Innsbruck.

1. Enrichissement des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP)

  1. La concentration des PBMC par centrifugation.
    1. Ouvrez la poche de sang et le sang fendu dans des tubes de 50 ml à centrifuger stériles selon la quantité de sang reçu.
    2. Si nécessaire, ajuster le volume à 50 ml pour chaque tube avec tampon phosphate salin stérile de Dulbecco (D-PBS).
    3. Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner les à 400 xg pendant 15 min à température ambiante (RT) sans frein.
    4. Soutirer la couche supérieure contenant du plasma et des plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant le boundarcouche y undisturbed.
      NOTE: Si le plasma autologue au lieu de FCS est utilisé pour compléter le milieu de culture, le plasma doit être recueilli et inactivé par la chaleur dans cette étape.
    5. Recueillir les cellules mononucléaires (couches limites) de deux tubes de 50 ml de centrifugeuse et les transférer dans un tube stérile de 50 ml en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile.
    6. Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube en utilisant stérile D-PBS.
    7. Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner les 400 g pendant 15 min à température ambiante sans frein.
    8. Soutirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant la couche limite non perturbée.
    9. Recueillir les cellules mononucléaires (couches limites) des tubes de 50 ml de centrifugeuse et les transférer dans deux tubes de 50 ml de collecte stériles en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile.
    10. Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube stérile D-PBS.
  2. Séparationdes PBMC par centrifugation à gradient de densité (figure 1).
    1. Préparer quatre tubes de 50 ml et la pipette 15 ml de milieu de gradient de densité dans chaque tube.
    2. Prélever 25 ml de cellules / sang commun du tube de collecte (étape 1.1.10) et recouvrir soigneusement le milieu de gradient de densité.
    3. Placer les tubes dans une centrifugeuse et de spin eux à 700 xg pendant 30 min à température ambiante sans frein.
  3. Collecte et purification de CMSP.
    1. Soutirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant la couche PBMC intacte.
    2. Collecter l'interphase PBMC de tous les tubes et mettre en commun les cellules dans deux stériles tubes de 50 ml en utilisant une pipette de 25 ml sérologique stérile.
    3. Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube stérile D-PBS. Placer les tubes dans une centrifugeuse et centrifuger à 400 g eux pendant 15 min à 4 ° C avec le frein.
    4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension leles cellules dans du PBS stérile D. Réunir les cellules des deux tubes et ajuster le volume à 50 ml avec stérile D-PBS.
    5. Placer les tubes dans la centrifugeuse et centrifuger les à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
    6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du D-PBS stérile. Ajuster le volume à 50 ml avec du PBS stérile et D-pipette 50 ul d'un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de D-PBS.
    7. Vortex du tube de 1,5 ml vigoureusement et compter les cellules dans une chambre Neubauer ou tout autre instrument de comptage cellulaire.
    8. Placer les tubes de 50 ml dans la centrifugeuse et centrifuger les à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C avec frein.

2. Isolement des monocytes par particules magnétiques CD14 anti-humain

  1. Étiquetage des CMSP avec des particules magnétiques.
    1. Ajuster la concentration des PBMC à 8 x 10 7 cellules / ml en utilisant un tampon d'isolement.
    2. Vortex les particules magnétiques CD14 anti-humain thoroughly et ajouter 50 ul de particules pour chaque 1 x 10 7 PBMC.
    3. Mélanger la suspension cellulaire de particules à fond et incuber à température ambiante pendant 30 min.
  2. Séparation des fractions positives et négatives.
    1. Réglez le volume jusqu'à 12 ml en utilisant un tampon d'isolement.
    2. Préparer six tubes à fond rond stériles et pipette 2 ml de la suspension cellulaire particules dans chaque tube.
    3. Placer immédiatement les tubes sur l'aimant. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
    4. Gardez les tubes sur l'aimant et soigneusement tirer le surnageant. Le surnageant contient la fraction négative.
    5. Retirer le tube de l'aimant et ajouter 2 ml de tampon d'isolement.
    6. Doucement remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas.
    7. Placer les tubes de retour sur l'aimant. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
    8. Gardez les tubes sur l'aimant et soigneusement tirer le surnageant. Le surnageant contient la fraction négative.
    9. Retirer les tubes de l'aimant et ajouter 2 ml de tampon d'isolement à chaque tube. Doucement remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas.
    10. Transférer la fraction positive à un tube stérile de 50 ml et ajuster le volume à 50 ml en utilisant stérile D-PBS.

3. La stimulation des monocytes isolés avec l'IL-4 et GM-CSF

  1. Placer le tube dans la centrifugeuse et le tourner à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
  2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 50 ml de D-PBS.
  3. Introduire à la pipette 50 ul dans un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de D-PBS. Vortexer le tube de 1,5 ml vigoureusement et compter les cellules dans une chambre de Neubauer ou d'un autre instrument de comptage de cellules.
  4. Placer le tube de 50 ml dans la centrifugeuse et le tourner à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
    NOTE: Si la fraction négative, contenant des lymphocytes du sang périphérique (PBL), est également nécessaire, effectuer le lavage et le comptage des étapes similaires à ttuyau de la fraction positive (étapes 3.1-3.5).
  5. Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10 6 / ml avec un milieu de culture préchauffé (milieu RPMI 1640 complété avec une solution à 10% de L-Glutamine inactivé à la chaleur et SBF à 1%) et de la pipette 3 ml / puits dans des plaques à 6 puits.
    NOTE: Si vous utilisez du plasma autologue inactivé à la chaleur, remplacer le FCS avec 1-5% de plasma autologue à 10%, selon le montage expérimental.
  6. Stimuler les monocytes avec IL-4 humaine recombinante (250 U / ml) et GM-CSF humain recombinant (1000 U / ml) par pipetage des cytokines directement dans le milieu de culture. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
  7. Re-stimuler les cellules avec l'IL-4 (250 U / ml) et GM-CSF (1000 U / ml) après 48 heures par pipetage des cytokines directement dans le milieu de culture.
    NOTE: S'il y a des signes d'acidification indiqués par l'indicateur de pH dans le milieu, remplacer la moitié du milieu avec un milieu de culture préchauffé.
  8. Récolte des cellules dendritiques immatures au jour 5 pouren aval des expériences de pipetage des cellules cultivées sur la plaque de 6 puits et dans un tube centrifuge de 50 ml après pipetage le milieu de culture et à quelques reprises.
  9. Compter les cellules et colorer un échantillon de monocytes isolés avec des anticorps anti-CD11b humain contre, CD11c et DC-SIGN / CD209, conjointement avec un colorant de viabilité cellulaire. Afin d'éviter une liaison non spécifique des anticorps lors de la coloration de surface, l'utilisation du récepteur Fc de réactifs de blocage ou d'albumine de sérum bovin (BSA) tampons est fortement recommandée.
  10. Analyser l'échantillon en utilisant le colorant de viabilité des cellules, selon le protocole du fabricant, en effectuant une cytométrie de flux pour évaluer la pureté et la viabilité des iDC générés.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Après centrifugation du sang anticoagulé à l' aide d' un coussin de saccharose, les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) sont enrichis en une interphase au - dessus du milieu de gradient de densité (figure 1). Une fois que les PBMC sont soutirés, l' analyse FACS est effectuée pour caractériser les différentes populations de cellules dans les PBMC en utilisant des marqueurs de la lignée (par exemple, CD3 pour les lymphocytes T, les monocytes CD14 p...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Ce protocole décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes (MDDC) l'isolement des monocytes humains du sang anticoagulé à l'aide d'un dosage à base de nanoparticules magnétiques. Dans ce protocole, les étapes de centrifugation sont effectuées en amont de la procédure d'isolement des cellules, ce qui conduit à un enrichissement de la fraction des CMSP. Bien que les cellules sont perdues au cours de la centrifugation, pour recouvrir le contenu de tout un paquet de sang sur un milieu à...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier notre technicienne Karolin Thurnes, Division de l’hygiène et de la microbiologie médicale, ainsi que le Dr Annelies Mühlbacher et le Dr Paul Hörtnagl, de l’Institut central de transfusion sanguine et du département d’immunologie, pour leur aide et leur soutien précieux concernant ce manuscrit. Nous remercions le Fonds autrichien pour la science de soutenir ce travail (P24598 à DW, P25389 à WP).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souris APC Clone CD19 Anti-Humain HIB19BD Biosciences555415
Souris APC Clone CD83 Anti-Humain HB15eBD Biosciences551073
BD Imag Particules magnétiques CD14 Anti-HumainBD Biosciences557769
BD ImagnetBD Biosciences552311
BSA (Albumine Fraction V)Carl RothEG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear Multiple Well Treated TC-TreatedMultiple Well Costar3506
Density gradient media : Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare Bio-Sciences17-5442-03
Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (D-PBS)Sigma-AldrichD8537
Falcon 10  ; ml Pipette sérologiqueCorning357551
Falcon 25  ; ml Pipette sérologiqueCorning357525
Falcon 50  ; ml Tube à centrifuger PP haute clartéCorning352070
Falcon Tubes à fond rondCorning352054
FITC Souris Anti-Humain CD3 Clone HIT3aBD Biosciences555339
Ghost Dye Violet 510 (Réactif de viabilité cellulaire)Tonbo biosciences13-0870
GM-CSFMACS Miltenyi Biotec130-093-862
FBS (sérum de veau fœtal) inactivé par la chaleur, origine approuvée par l’UE (Amérique du Sud)Gibco10500-064
Hettich Rotanta 460RHettich---
IL-4CC PromoKineC-61401
Tampon d’isolement : BD IMag Buffer (10x)BD Biosciences552362
L-Glutamine solutionSigma-AldrichG7513
Tubes de microcentrifugation, 1,5 ml, SuperSpinVWR211-0015
Souris PE Anti-Humain CD14 Clone M5E2BD Biosciences555398
PE Souris Anti-Humaine CD209 Clone DCN46BD Biosciences551265
RPMI-1640 moyenSigma-AldrichR0883
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020

Références

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  2. Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
  3. Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
  4. Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
  5. Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
  6. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
  7. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  8. Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
  9. Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
  10. McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
  11. Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
  12. Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
  13. Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
  14. Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
  15. Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891(2010).
  16. Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
  17. Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).
  18. Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
  19. Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Isolation des monocytesDifférenciation des cellules dendritiquesBilles magnétiques CD14Centrifugation sur gradient de densitéEnrichissement des PBMCCytométrie en fluxInterleukine 4Stimulation au GM-CSFCellules dendritiques immaturesPrésentation de l'antigène
Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.