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Peptide dérivé Méthode du transport des gènes et des protéines Across cellulaire et obstacles organites dans les plantes

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DOI :

10.3791/54972

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16 décembre 2016

 ,  , 
1Enzyme Research Team, RIKEN Center for Sustainable Resource Science

Dans cet article

Résumé

Les méthodes existantes pour la modification des plantes ont une applicabilité limitée. La nouvelle technologie dérivée des peptides proposée ici promet à la fois simplicité et efficacité dans l’introduction de protéines ou de gènes exogènes dans les compartiments intracellulaires souhaités de plantes intactes.

Résumé

La capacité d’introduire des protéines exogènes et d’exprimer (ou de réguler à la baisse) des gènes spécifiques chez les plantes constitue un outil puissant pour la recherche fondamentale ainsi que pour de nouvelles applications dans le domaine de la biotechnologie végétale. Les méthodes viables qui existent actuellement pour le transfert de protéines ou de gènes dans les cellules végétales, à savoir Agrobacterium et le bombardement de microprojectiles, présentent les inconvénients d’une faible fréquence de transformation, d’une gamme d’hôtes limitée ou d’un coût élevé d’équipement et de microvecteurs. Le protocole suivant décrit une méthode simple et polyvalente, qui utilise des peptides conçus rationnellement comme agents d’administration pour une variété de cargaisons à base d’acides nucléiques et de protéines dans les plantes. Les peptides sont sélectionnés comme outils pour le développement du système en raison de leur biodégradabilité, de leur taille réduite, de leurs propriétés diverses et réglables ainsi que de leur capacité à obtenir un accès intracellulaire/organulé. La préparation, la caractérisation et l’application de formulations optimisées pour chaque type de la large gamme de cargaisons livrées (ADN plasmidique, ADN ou ARN double brin et protéines) sont décrites. Les étapes critiques du protocole, les modifications possibles et les limites existantes de la méthode sont également abordées.

Introduction

Le génie génétique végétal est classiquement utilisé pour transférer des caractères bénéfiques aux plantes. Ces dernières années, cette technologie a été appliquée pour convertir des plantes en bio-usines pour la production de protéines pharmaceutiquement importantes et commercialement précieuses, dont beaucoup ne peuvent pas être synthétisées chimiquement et sont très coûteuses à produire à l’aide de systèmes animaux ou microbiens1. Grâce à l’introduction de nouveaux gènes, le métabolisme de la plante peut être manipulé pour la production de divers produits biopharmaceutiques tels que des anticorps, des enzymes métaboliques, des hormones, des antigènes ou un vaccin2.

Les technologies de transfert de gènes établies pour les plantes sont l’administration3 médiée par Agrobacterium, le bombardement avec des microprojectiles enrobés d’ADN (biolistiques)4, et le traitement par électroporation5 ou polyéthylène glycol6 des protoplastes. Les techniques nécessitant des protoplastes sont généralement évitées car elles prennent du temps, sont lourdes et donnent des résultats incohérents7. En conséquence, pratiquement tous les travaux de modification des plantes utilisent actuellement soit Agrobacterium, soit des microprojectiles pour le transfert de gènes. La méthode Agrobacterium est plus largement utilisée, mais ne s’applique pas à de nombreuses espèces végétales économiquement importantes. Pendant ce temps, le bombardement de microprojectiles est plus polyvalent en raison d’un large éventail de plantes sensibles, mais nécessite un équipement spécialisé et cause souvent de graves lésions tissulaires. De plus, ces méthodes impliquent un mécanisme d’administration aléatoire (biolistique) ou complexe (Agrobacterium) et ont des taux de transformation variables8. Par conséquent, une nouvelle technologie de transformation des plantes, simple mais efficace, et applicable à différents types de plantes est nécessaire.

Actuellement, les plantes sont soumises à une modification génétique principalement par l’administration d’ADN exogène codant pour un caractère souhaité, plutôt que par l’administration directe d’une protéine cible. La plus grande stabilité de l’ADN par rapport aux protéines est un avantage primordial ; néanmoins, les problèmes potentiels associés à l’administration de l’ADN comprennent l’insertion aléatoire d’ADN exogène dans le génome de la plante et la transmission involontaire de gènes de résistance aux antibiotiques à des bactéries pathogènes via le transfert horizontal de gènes9. À des fins d’édition du génome, la possibilité de modifier les génomes des plantes sans introduire d’ADN étranger dans les cellules peut contourner les préoccupations réglementaires liées aux plantes génétiquement modifiées. Ainsi, une stratégie alternative sans ADN pour la modification des plantes par livraison directe de protéines pourra répondre à ces besoins.

Ici, nous présentons un système à base de peptides, développé à l’origine pour la thérapie génique humaine10-14, pour l’administration ciblée de gènes ou de protéines exogènes dans des plantes intactes. Les peptides sont capables de protéger l’ADN de la dégradation des nucléases et peuvent médier le transfert de gènes à travers les membranes cellulaires et organellaires15-17. Ils ont également des propriétés diverses et réglables en plus d’être non cytotoxiques18-20. Plus important encore, avec l’utilisation de peptides, les gènes peuvent être ciblés avec précision sur les organites intracellulaires tels que les mitochondries21 ou les plastes (chloroplastes)22 pour l’expression - une tâche qui n’est pas réalisable par transformation biolistique ou médiée par Agrobacterium. Selon le type de cargaison, cette nouvelle technologie de modification de la plante peut être exploitée pour délivrer des protéines23 et exprimer (plasmide21,24 ou ADN double brin25) ou réguler à la baisse (ARN double brin26) des gènes spécifiques au sein de la plante, dans son espace cytosolique24-26 ou dans un compartiment organellaire spécifique21. Les peptides porteurs conçus sont constitués d’un domaine cationique sous la forme de polylysine (K8) ou de polylysine-co-histidine (KH)9 pour la liaison et/ou la condensation de cargaisons chargées négativement, qui est conjugué à des séquences pénétrantes dans les cellules (peptide BP100) ou mitochondriales (peptide Cytcox).

Protocole

1. Préparation de Formulations Peptide-Based

  1. Préparer des solutions mères de chaque peptide comme suit: (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml ou 800 nM), Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml), BP100 (1 mg / ml) et (BP100) 2 K 8 (70 uM). Peser la quantité requise de chaque peptide dans un tube de 1,5 ml et ajouter de l'eau ultra pure autoclavée pour dissoudre le peptide. Bien mélanger par pipetage répété jusqu'à l'obtention d'une solution limpide.
  2. Amplifier et purifier l'ADN plasmidique (ADNp), l'ADN double brin (ADNdb), et l'ARN double brin (ARNdb) selon des méthodes moléculaires standards. Dans 1,5 ml microtubes, faire des solutions d'achat d'actions avec une concentration de 1 mg / ml (ADNp et ADNdb) ou 400 nM (ARNdb).
  3. Préparer la solution de protéine mère avec une concentration de 7 pm, en dissolvant 1 mg de protéine (par ex., L' alcool déshydrogénase, de l' ADH) en poudre dans 1 ml de solution de carbonate de sodium (0,1 M, pH 9). Étiquette de la protéine avec fluorescent sondes telles que la rhodamine B (Rhb) selon des protocoles standards pour permettre la visualisation microscopique de la protéine délivrée dans les cellules.
  4. Combiner les composants respectifs dans un tube de 1,5 ml.
    1. Pour les formulations peptide-ADNp ciblant le cytoplasme, ajouter 6,4 pi de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) à 20 pi de ADNp (1 mg / ml) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 773,6 pi d'eau ultra pure autoclavée pour diluer la solution à un volume final de 800 ul. Utiliser la construction d'ADNp conçu pour l' expression nucléaire (P35S-Rluc-TNOS, tableau 1).
    2. Pour des formulations de peptides ciblant ADNp les mitochondries, ajouter 6,6 ul de Cytcox- (KH) 9 (1 mg / ml) à 20 pi d'ADNp (1 mg / ml) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C, puis on ajoute 2,4 pi de BP100 (1 mg / ml). On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 256; C pendant encore 15 min. Ajouter 771 pl d'eau ultrapure à l'autoclave pour diluer la solution à un volume final de 800 ul. Utiliser la construction d'ADNp conçu pour l' expression mitochondrial (pDONR-COX2: Rluc, tableau 1).
    3. Pour les formulations peptide-ADNdb, ajouter 5,1 pi de (KH) 9 -BP100 (1 mg / ml) à 8 pi de dsDNA (1 mg / ml) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 786,9 pi d'eau ultra pure autoclavée pour diluer la solution à un volume final de 800 ul.
    4. Pour les formulations peptide-ARNdb, ajouter 50 pi de (KH) 9 -BP100 (800 nM) à 50 ul de ARNdb (400 nM) et bien mélanger par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 700 ul d'eau sans RNase pour diluer la solution à un volume final de 800 ul.
    5. Pour les formulations peptide-protéine, ajouter 16 pi de (BP100) 2 K 8 (70 uM) à 16 pi d'ADH (7 uM) et mélangerbien par pipetage. On laisse le mélange se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C. Ajouter 768 pl d'eau ultrapure à l'autoclave pour diluer la solution à un volume final de 800 ul.
  5. Laisser les formulations se stabiliser pendant 15 min à 25 ° C.

2. Caractérisation des Formulations Peptide-Based

  1. Transférer chaque solution (800 pi) dans une cuvette pour la diffusion de la lumière dynamique (DLS) analyse. Déterminer le diamètre et l'indice de polydispersité hydrodynamique des complexes formés avec un nanosizer zêta, en utilisant un 633 nm laser He-Ne à 25 ° C avec un angle de détection de rétrodiffusion de 173 °.
  2. Après les mesures de taille, transférer chaque solution (800 pi) dans une cellule capillaire plié pour les mesures du potentiel zêta à des paramètres par défaut de la constante diélectrique, l'indice de réfraction et de la viscosité de l'eau à 25 ° C.
  3. Observer un petit volume d'une solution complexe, utilisé pour l'analyse DLS, par microscopie à force atomique (AFM). Dépôt de 10 pi de solution complexe sur la surface clivée fraîchement exposée d'une feuille de mica et de laisser le mica à l'air sécher pendant la nuit dans une boîte en plastique de Pétri couverte.
  4. Acquérir une image des complexes dans l' air à 25 ° C en utilisant un cantilever de silicium avec une constante de ressort de 1,3 N / m en mode 27,28 taraudage.

3. Infiltration des feuilles des plantes

  1. Utilisez vieilles plantes de sol cultivé 3 semaine (Arabidopsis thaliana 24, Nicotiana benthamiana 24 ou peuplier 26). Transfecter au moins 3 feuilles pour servir trois exemplaires pour la quantification de l'expression du gène ou de la délivrance de protéines.
  2. Charger une seringue de 1 ml sans aiguille en plastique avec 100 pi de solution complexe pour la transfection d'une feuille. Positionner la pointe de la seringue sur la surface abaxiale de la feuille.
  3. Appuyez sur la pointe de la seringue contre la feuille légèrement et appuyer sur le piston de la seringue lentement tout en exerçant une contre-pression à l'idoigt ndex d'une main de latex gantée du côté opposé. infiltration réussie peut être observé que la diffusion d'une zone imbibée d'eau dans la feuille. Etiqueter les feuilles infiltrées pour faciliter l'identification.
  4. Incuber la feuille transfectée pour des durées optimisées suivant l'infiltration avec un peptide ADNp (12 h), le peptide-ADN natif (12 h), le peptide-ARNdb - formulations (9 48 hr) et le peptide à la protéine (6 heures) dans les conditions suivantes: 16 heures de lumière / 8 h obscurité à 22 ° C pour A. thaliana et le peuplier, ou 24 heures de lumière constante à 29 ° C pour N. benthamiana.

4. Évaluation de l'efficacité de transfection

  1. Exciser la feuille entière transfectée de petites plantes (par ex., A. thaliana) , ou une partie de la zone infiltrée 1 cm 2 pour les installations plus grandes (par ex., N. benthamiana).
  2. Pour les expériences de transfection utilisant la luciférase de Renilla (Rluc) vecteur rapporteur, déterminer le transfection efficacité quantitative à l'aide d'un kit Rluc Assay.
    1. Placez chaque feuille excisée ou de la section de la feuille dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Ajouter 100 pi de 1 × Rluc Assay Lysis Buffer par tube. De la même manière, préparer des lysats des feuilles témoins non transfectées (en triple).
    2. Moudre la feuille à l'aide d'un pilon d'homogénéisation et incuber le lysat résultant à 25 ° C pendant 6 à 10 h.
    3. Centrifuger le lysat à 12 470 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 min. Transférer 20 ul du lysat clarifié à un puits dans une microplaque à 96 puits, et utiliser le volume restant pour la quantification de la concentration en protéine totale en utilisant un kit de dosage BCA Protein selon le protocole du fabricant.
    4. Ajouter 100 pi de 1 × Rluc Assay Substrate (dilué à l'aide du tampon Rluc Assay) dans le puits et mélanger par pipetage lent. Placer la microplaque dans un lecteur de microplaques multimodes et lancer la mesure.
    5. Soustraire la luminescence de fond (moyenne du pasn-transfectées triple) de la luminescence de chaque échantillon expérimental. Calculer le rapport de photoluminescence (unités de lumière relative, RLU) à la quantité de protéine (mg).
  3. Pour les expériences de transfection en utilisant une protéine fluorescente (GFP) vecteur rapporteur vert ou protéine marquée par fluorescence (par exemple., ADH-RhB), observer la fluorescence en utilisant un confocal à balayage laser microscope.
    1. Couper les bords d'une feuille entière (pour faciliter l'élimination des vides d'air), tandis qu'une feuille sectionnée peut être utilisé tel quel. Retirer le piston d'une seringue de 10 ml et placer chaque article de feuille ou une feuille excisée dans la seringue.
    2. Remplacer le piston et le pousser doucement vers le fond de la seringue sans écraser la feuille. Dessinez l'eau dans la seringue jusqu'à ce qu'il soit à peu près la moitié rempli.
    3. Pointez la seringue vers le haut et pousser le piston pour éliminer l'air de la seringue à travers la pointe. Couvrir la pointe de la seringue et tirez doucement le piston pour expulser l'air du IcaF. Répétez cette opération plusieurs fois jusqu'à ce que la feuille apparaît translucide.
    4. Recouvrir la surface d'une lame de microscope avec un ruban adhésif. Couper un carré sur la bande assez grand pour accueillir l'échantillon de feuille en utilisant une lame, et peler la pièce carrée de bande hors avec une pince pour créer une chambre d'échantillon. La bande servira une entretoise entre la lame et lamelle.
    5. Placez la feuille dans la chambre avec la surface abaxiale vers le haut et remplir la zone de la chambre restante avec de l'eau. Sceller la feuille à l'intérieur de la chambre avec une lamelle de verre et fixer les bords de la lamelle couvre-objet avec du ruban adhésif.
    6. Examiner l'échantillon de feuille à l'aide du confocale à balayage laser sous un objectif 40X ou 63X objectif à immersion dans l'eau. GFP ou Rhb fluorescence peuvent être visualisées à des longueurs d'onde d'excitation de 488 nm ou 555 nm, respectivement.

Résultats

Un tableau de protéines et acides nucléiques cargaisons ont été introduits avec succès dans diverses plantes en utilisant les peptides conçus comme vecteurs de délivrance. Des interactions électrostatiques entre les peptides cationiques et les marchandises chargées négativement ont donné lieu à la formation de complexes de transfection qui peuvent être directement infiltrés dans les feuilles des plantes à l' aide d' une seringue sans aiguille (figure 1). Formulations optimisées (empiriquement déterminées dans ces études 21,23-26) pour la transfection de cellules végétales sont répertoriées dans le tableau 1, où chaque type de la vaste gamme de marchandises livrées (ADNp, ADNdb, ARNdb et de protéines) est représenté. Les diamètres moyens de toutes les formulations à base de peptides étaient dans la gamme approximative de 150-300 nm. Sur la base de l'analyse DLS, toutes les formulations affichées polydispersité relativement faible taille, ce qui indique que les agrégats de peptides cargo formés ont une répartition granulométrique uniforme. Les morphologiescomplexes entre le peptide et ADNp (figure 2A) ou de la protéine (figure 2B), le mica, ont été imagées par AFM. des complexes globulaires homogènes ont été observées pour les deux combinaisons de peptides ADNp et du peptide-protéine, en accord avec les données provenant des mesures DLS. En termes de potentiel zêta des complexes (tableau 1), pDNA- et complexes dsDNA dérivés avaient des charges nettes de surface négative tandis que les complexes à base de ARNdb avaient une charge quasi neutre surface. des complexes peptide-protéine, d'autre part, ont été chargés positivement.

Les rendements de peptide-ADNp et formulations peptide-ADNdb dans la médiation de la transfection de A. thaliana ou N. benthamiana en tant que systèmes modèles de plantes ont été évalués quantitativement et qualitativement. Le dosage de l' expression du gène Rluc a été utilisé pour la quantification des niveaux d'expression des gènes (tableau 1), par conséquent, pour cette expérience ADNp ouADN double brin codant pour le gène Rluc doit être utilisé pour la complexation avec les peptides porteurs respectifs. En utilisant le (KH) 9 -BP100 / formulation de l' ADNp, la livraison et l' expression de l' ADNp nucléaire ciblée peut être atteint, après une période d'incubation de 12 h, avec un RLU / mg valeur estimée d'environ 1 × 10 5. Pour la livraison mitochondriale ciblée et l' expression de l' ADNp, une combinaison de peptides, Cytcox- (KH) , et BP100 9, est nécessaire pour la formation du complexe. Avec la même période d'incubation optimale de 12 heures, cependant, un taux beaucoup plus faible de transfection (environ 1 x 10 3 RLU / mg) a été atteint. Pendant ce temps, la même période d'incubation (12 heures) et le niveau d'expression du gène (environ 1 x 10 3 RLU / mg) ont été nécessaires / enregistrées pour les complexes à base d'ADN double brin, a également formulé en utilisant le (KH) 9 -BP100 peptide. Les évaluations qualitatives de l'expression des gènes ont été réalisées par l'observation microscopique directe de feuilles traitées avec des complexes prépared utilisant ADNp ou dsDNA codant pour le gène rapporteur GFP. Dans les cellules transfectées avec des complexes non ciblés peptide ADNp, diffuse la fluorescence verte correspondant à l' expression de la GFP a été clairement observée et on a trouvé localiser dans le cytosol (figure 3A). nettes différences dans le modèle de localisation de la fluorescence de la GFP étaient évidents dans les cellules infiltrées avec des complexes de peptide-ADNp mitochondriales ciblée. Ici, la fluorescence verte punctiformes qui colocalisent avec le colorant mitochondrial était visible, ce qui confirme la spécificité de l' expression du gène exclusivement dans le compartiment mitochondriale des cellules (figure 3B).

Dans le cas de formulations de peptide-protéine, la conjugaison de la cargaison de la protéine (ADH) à un fluorophore (Rhb) permettra la visualisation de la protéine délivrée dans le compartiment intracellulaire. Au sein d'une courte période d'incubation de 6 heures, la protéine ADH-RhB (bleu) a été trouvé pour être distribué dansle cytosol et la vacuole des cellules infiltrées (figure 3C). Pendant ce temps, une régulation rapide et efficace de l'expression génique peut être réalisée dans diverses plantes en utilisant des formulations de peptides ARNdb. Dans la première expérience, A. thaliana feuille a été infiltrée avec le peptide-ARNdb Complexes pour réduire au silence le gène de la chalcone synthase (CHS) responsable de l' anthocyanine (pigment rouge) biosynthèse dans des conditions de sécheresse. La différence dans l' apparence de A. thaliana laisse sous la normale (Figure 3D, a) et des conditions de sécheresse (Figure 3D, b) fourni un moyen facile d'évaluer le SHC silencieux en utilisant la formulation peptide-ARNdb optimisé (flèche 1 indique la région infiltrée). Dans la deuxième expérience, les complexes de peptide-ARNdb ont été infiltrés dans les feuilles d'Arabidopsis thaliana transgénique exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP). Une réduction apparente de l'expression YFP peut être vu dans les cellules de l'épiderme 9 h post-transfection (Figure 3E, F). L'efficacité de la formulation dans l' expression du gène de régulation négative dans un système de plante différente (peuplier, 12 heures après la transfection) a également été vérifiée (figure 3G, H).

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Figure 1: Formulations à base de peptides pour la livraison de l' acide nucléique et des cargaisons de protéines dans les plantes vivantes.
Les peptides porteurs conçus sont constitués de polycations conjugués à pénétrant cellulaire ou des séquences de transit organites. Polycations permettent la liaison et / ou de la condensation des cargaisons chargées négativement, ainsi que l'évasion du compartiment endosomal suivante intériorisation dans les cellules. Livraison des cargaisons dans des cellules et par la suite à des organites spécifiques est médiée par des séquences de pénétration des cellules et des séquences de transit organites, respectivement. Diverses cargaisons qui pourraient être successfully livrés à l'usine comprennent des acides nucléiques tels que l'ADNp, et ADNdb ARNdb, ainsi que des protéines modèles, comme l'albumine de sérum bovin (BSA), l'alcool déshydrogénase (ADH) et citrin (une variante de la protéine fluorescente jaune). Molécules bioactives sont capables de former des complexes de transfection avec des conjugués peptide par l' intermédiaire d' interactions électrostatiques, qui sont introduits dans les feuilles des plantes par une seringue infiltration. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2: Morphologies des formulations à base de peptides.
(A) AFM amplitude image (KH) 9 -BP100 formulation / ADNp à N / P 0,5. (B) de l' image de la hauteur de l' AFM de (BP100) 2 K 8 / formulation ADH à rati molaireo 10. Reproduit avec la permission de sources 23,24 publiées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3: Microscopique Évaluation de Transfection efficacités utilisant Formulations à base de peptides optimisés.
(A) l' expression cytosolique de la GFP (vert), distingue nettement de l' autofluorescence des chloroplastes (rouge), a été observée dans les cellules du mésophylle spongieuses de A. thaliana feuilles infiltrées avec (KH) 9 formulation -BP100 / ADNp (N / P 0,5; 12 h ). (B) expression de la GFP (vert) a été détectée dans les mitochondries (rouge) dans les cellules de l' épiderme de la feuille A. thaliana infiltrée par Cytcox- (KH) 9 / BP100 / formulation ADNp (N / P 0,5 pour chaque peptide; 12 h). images agrandies des mitochondries avec l'expression de la GFP sont présentés dans le panneau extrême droite. (C) La livraison de ADH-RhB (bleu) dans les cellules du mésophylle spongieux de A. thaliana feuilles médiée par (BP100) 2 K 8 à un rapport molaire peptide / protéine de 10, visualisé 6 heures après l'infiltration. (D) feuille A. thaliana avant (a) et après (b) le traitement avec (KH) 9 -BP100 / formulation ARNdb (rapport molaire 2; 48 h), ce qui a entraîné la suppression de la voie de biosynthèse des anthocyanes. Une formulation similaire contenant GFP5 ARNdb a été infiltré dans la feuille comme contrôle négatif (c). Les flèches 1 et 3 indiquent la zone infiltrée tandis que les flèches 2 et 4 indiquent la zone non infiltrée à l'intérieur de la feuille. (E) A. thaliana laisse exprimer la protéine fluorescente jaune (YFP) et (F) la fluorescence YFP diminuée suivant l' infiltration avec (KH) 9 -BP100 / formulation ARNdb (rapport molaire 2; 9 h). (G) des feuilles de peuplier transgéniques exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) et (H) la YFP fluorescence d'infiltration suivante diminuée avec (KH) 9 formulation -BP100 / ARNdb (rapport molaire 2; 12 h). Reproduit avec la permission de sources 21,23,24,26 publiées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4: Variation de Peptide-à-ADN (N / P) Ratio et l'effet sur les propriétés biophysiques des Complexes.
Avec l'augmentation de peptide ratio d'ADN, des formulations à base de peptides diminuent en taille alors que leur potentiel zêta des valeurs de transition du négatif au positif./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Tableau 1: Caractérisation et évaluation des différentes formulations à base de peptides. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

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Tableau 2: Comparaison des technologies existantes ADN de livraison Peptide-base et d' autres pour les plantes intactes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

Discussion

Les étapes critiques au sein du protocole qui ont été identifiées de façon empirique sont discutées. Par infiltration seringue, les formulations à base de peptides sont introduits dans les espaces aériens à l'intérieur de la feuille de la plante à travers les stomates. Pour assurer l' absorption maximale de la solution, le processus d'infiltration doit être effectuée lorsque les plantes sont dans des conditions qui sont propices à l' ouverture stomatique ie., Fournis avec suffisamment d' eau et pendant la période de lumière. En ce qui concerne la préparation des complexes de transfection, pour les formulations qui impliquent une combinaison de deux peptides (pour la délivrance d'ADN mitochondrial ciblée), la séquence d'addition de chaque composant est essentielle et ne doit pas être inversée.

Il existe de nombreuses modifications vraisemblables de la procédure. Une autre option pour l'infiltration des cellules végétales est l'utilisation d'une infiltration sous vide, qui est capable d'introduire la solution du complexe dans des plantes entières et / ou partielles, y compris les tissusméristème apical. Pour cette procédure alternative, les plants sont submergées dans la solution de transfection, et en fonction de la pression générée par le vide, les complexes de peptide-cargo sont contraints par les stomates et dans les cellules végétales (Yoshizumi, T., données non publiées).

L' expression transitoire du gène, basée sur des études utilisant des cellules animales, a été démontré que l'augmentation des concentrations d' ADN plus élevées avec 29-31. Il est important de noter que le rapport du peptide à l' ADN affecte les propriétés biophysiques (taille, la charge de surface) , des complexes (figure 4), qui influe sur l' efficacité de transfection; Par conséquent, le rapport optimal doit être maintenu, même avec une concentration accrue de l'ADN.

L'un des principaux avantages de l'utilisation des peptides comme un agent de prestation gène / protéine est que sa séquence est prête à accorder à remplir une fonction souhaitée. Par exemple, le domaine de ciblage mitochondrial du peptide de support décrit dans ce ploty peuvent être remplacées par des séquences chloroplastiques ou peroxysomaux ciblage pour la localisation de ces organites. Tandis que la transformation de chloroplastes est possible de plusieurs plantes en utilisant la biolistique 32-34, ni Agrobacterium , ni la méthode biolistique pourraient introduire des gènes dans les mitochondries et autres organites en dehors du noyau (tableau 2).

Il n'y a pas de limitations gamme d' hôtes rigides pour la transfection à base de peptides, à la différence de la méthode à base d' Agrobacterium (tableau 2). Jusqu'à présent, les formulations pour la transfection de A. thaliana, N. benthamiana et le peuplier ont été optimisés (tableau 1), mais la méthode peut également être appliquée pour Nicotiana tabacum, cultivar de tomate micro-Tom, le riz (à partir d'expériences préliminaires) et d'autres plantes mono- et dicotylédones.

Jusqu'à présent, il n'y a pas de limitation connue de la taille du transgène lorsque les peptides sont utilisés, undes vecteurs de transfection. En revanche, les grandes molécules d'ADN ont été trouvés pour réduire l'efficacité de transformation médiées par Agrobacterium méthodes 35,36, et une limite de taille supérieure pour les transgènes d'environ 200 kb a été rapportée 37-39. En utilisant la biolistique, d'autre part, de grands fragments d'ADN peuvent être cisaillées lors de la préparation ou de la livraison dans des plantes 38. Bien qu'aucune limite supérieure n'a été déterminée pour une transformation biolistique jusqu'à présent, des contraintes physiques ont été trouvées pour limiter la taille de l' ADN qui peut être transféré à moins de 150 kb 40. Les principaux avantages de l' utilisation du système à base de peptides pour le transfert de gènes par rapport aux approches existantes employant soit Agrobacterium ou le bombardement de microprojectiles, discutées ci - dessus, sont résumés dans le tableau 2.

Quelques limitations existent pour cette méthode telle qu'elle est. En premier lieu, la livraison de l'ADNp ciblé vers des organites spécifiques, tels que la mitochondria, a été prouvée possible par une simple combinaison de séquences de pénétration des cellules et un organite transit liaison à l'ADN, bien que l'efficacité a été faible. L'expression du transgène peut être détectée, par microscopie confocale, seule une petite population de cellules au sein de la mitochondrie. Par conséquent, d'autres modifications sont nécessaires pour: (i) améliorer la translocation des plus complexes à travers la cellule / membrane des organites, et (ii) améliorer la dissociation et le transfert de ADNp du peptide porteur dans l'organite cible pour l'expression. En second lieu, l'utilisation de ce système de délivrance d'ADN, l'expression transitoire des gènes rapporteurs exogènes a été atteint avec succès dans le compartiment cytosolique et mitochondriale des cellules. incorporation stable et l'expression des gènes introduits dans le nucléaire de la plante / génome organites ont pas encore été établie mais, en raison de l'absence de stratégies de sélection appropriés.

Tout en reconnaissant qu'il existe des zones d'amélioration ou encore développement, la stratégie de peptide dérivé décrit ici reste une technique simple et polyvalent qui a ouvert la voie à la livraison de divers cargaisons en types de plantes diverses.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le financement du Japan Science and Technology Agency recherche exploratoire pour la technologie avancée (JST-ERATO), la Nouvelle Energie et Industrial Technology Development Organization (NEDO), et le Programme de promotion de l'innovation stratégique Croix-ministérielle (SIP), le Japon .

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Peptide (KH)9-BP100Synthétisé sur mesure par RIKEN Brain Science InstituteN/ASéquence : KHKHKHKHKHKHKHKH-
KHKKLFKKILKYL
(BP100)2-K8 peptideSynthétisé sur mesure par RIKEN Brain Science InstituteN/ASéquence : KKLFKKILKYLKKLFKKIL-
BP100Synthétisé sur mesure par RIKEN Brain Science InstituteN/ASéquence : KKLFKKILKYL
Cytcox-(KH)9 PeptideSynthétisé sur mesure par RIKEN Brain Science InstituteN/ASéquence : MLSLRQSIRFFKKHKHKH-
KHKHKHKHKHKH
P35S-GFP(S65T)-TNOS et P35S-RLuc-TNOSN/AN/ACode pour les gènes de la protéine fluorescente verte et de la Renilla luciferase, respectivement, sous le contrôle du promoteur constitutif du CaMV 35S (Réf. : Lakshmanan et al. Biomacromolécules 2013, 14, 10)
pDONR-cox2 :gfp et pDONR-cox2 :rlucN/AN/ACodage pour la protéine fluorescente verte et les gènes de la Renilla luciferase, respectivement, sous le contrôle du promoteur spécifique mitochondrial de la cox2 (Réf. : Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)
ADNdb (amplifié par PCR à partir de pBI221-P35S-Rluc-TNOS)N/AN/AEncode la protéine fluorescente verte et des gènes Renilla luciferase, respectivement, sous le contrôle du promoteur constitutif CaMV 35S (Réf : Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)
GFP5 siRNAN/AN/APour le silençage médié par interférence ARN de la protéine fluorescente verte (Réf : Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
CHS siRNAN/AN/APour le silençage médié par interférence ARN de la chalcone synthase (Réf : Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)
Seringues en plastique de 1 ml et 10 mlTERUMO CorporationSS-01T, SS-10ESZ
Tube de microcentrifugation de 1,5 mlAS ONE Corporation151212
plaque à fond plat à 96 puitsAsahi Glass Co., Ltd.3860-096
Ruban adhésifSekisui Chemical Co., Ltd.N° 835
Alcool déshydrogénaseSigma-Aldrich Co., LLC.A-7011
Microscope à force atomiqueSeiko Instruments Inc.SPI3800, Microscope à force atomique SPA 300HV
Hitachi High-Tech Science CorporationAFM5300E
Kit de dosage des protéines BCAThermo Fisher Scientific Inc.23227
K-A102001593porte-à-fauxHitachi High-Tech Science Corporation
Carl ZeissLSM700
Perceuse de liègeSigma-Aldrich Co., LLC.Z165220Pour l’excision des feuilles en disques de 1 cm
de diamètre CoverslipMatsunami Glass Ind., Ltd.C02261
CuvetteSarstedt759116
Cellule capillaire pliéeMalvern Instruments, Ltd.
ForcepsShimizu Akira Inc.Pince en acier inoxydable 150
Homogénéisation PilonIeda Trading Corp.9993
MicaNisshin EM Co., Ltd.LC23Z
Beckman CoulterBKA46472
Lecteur de microplaquesMolecular Devices CorporationSpectra MAX M3
Lame de microscopeMatsunami Glass Ind., Ltd.
PipetteEppendorf Research® ; plus3120000909
Pointes de pipetteAS ONE Corporation2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03
Boîte de Pétri en plastiqueAS ONE Corporation1-7484-01
Renilla Luciferase Kit de dosagePromega corporationE2810
Isothiocyanatede rhodamine BSigma-Aldrich Co., LLC.
Eau sans RNaseQiagen129112
Carbonate de sodiumWako Pure Chemical Industries, Ltd.199-01585
Lame et manche chirurgicauxFEATHER Safety Razor Co., Ltd.Acier inoxydable n° 14 (lame), n° 3L (poignée)
Capuchon d’embout de seringueMusashi Engineering Inc.NC-3E
Balance de pesageSartoriusCPA225D
Potentiomètre ZetaMalvern Instruments, Ltd.Zetasizer Nano-ZS
peptide KYLKKKKKKKK Microscope confocal à balayage laser enDTS1070Microcentrifugeuse S011120283924

Références

  1. Altman, A., Hasegawa, P. M. Plant biotechnology and agriculture: Prospects for the 21st century. , Academic Press. Cambridge, MA. (2011).
  2. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep. 22, 711-720 (2004).
  3. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
  4. Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R., Sanford, J. C. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature. 327, 70-73 (1987).
  5. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 5824-5828 (1985).
  6. Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., Schilperoort, R. A. In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature. 296, 72-74 (1982).
  7. Birch, R. G. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 297-326 (1997).
  8. Newell, C. A. Plant transformation technology. Developments and applications. Mol. Biotechnol. 16, 53-65 (2000).
  9. Nielsen, K. M., Bones, A. M., Smalla, K., van Elsas, J. D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria--a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, 79-103 (1998).
  10. Chuah, J. A., Kaplan, D., Numata, K. Chapter 25, Engineering peptide-based carriers for drug and gene delivery. Engineering in Translational Medicine. Cai, W. , Springer. 667-689 (2014).
  11. Nitta, S., Numata, K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 14, 1629-1654 (2013).
  12. Numata, K. Poly(amino acid)s/polypeptides as potential functional and structural materials. Polym. J. 47, 537-545 (2015).
  13. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based delivery systems of bioactive molecules. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1497-1508 (2010).
  14. Numata, K., Subramanian, B., Currie, H. A., Kaplan, D. L. Bioengineered silk protein-based gene delivery systems. Biomaterials. 30, 5775-5784 (2009).
  15. Chugh, A., Eudes, F., Shim, Y. S. Cell-penetrating peptides: nanocarrier for macromolecule delivery in living cells. IUBMB Life. 62, 183-193 (2010).
  16. Eggenberger, K., Mink, C., Wadhwani, P., Ulrich, A. S., Nick, P. Using the peptide Bp100 as a cell-penetrating tool for the chemical engineering of actin filaments within living plant cells. ChemBioChem. 12, 132-137 (2011).
  17. Numata, K., Kaplan, D. L. Silk-based gene carriers with cell membrane destabilizing peptides. Biomacromolecules. 11, 3189-3195 (2010).
  18. Numata, K., Hamasaki, J., Subramanian, B., Kaplan, D. L. Gene delivery mediated by recombinant silk proteins containing cationic and cell binding motifs. J. Control. Release. 146, 136-143 (2010).
  19. Numata, K., Mieszawska-Czajkowska, A. J., Kvenvold, L. A., Kaplan, D. L. Silk-based nanocomplexes with tumor-homing peptides for tumor-specific gene delivery. Macromol. Biosci. 12, 75-82 (2012).
  20. Numata, K., Reagan, M. R., Goldstein, R. H., Rosenblatt, M., Kaplan, D. L. Spider silk-based gene carriers for tumor cell-specific delivery. Bioconjugate Chem. 22, 1605-1610 (2011).
  21. Chuah, J. A., Yoshizumi, T., Kodama, Y., Numata, K. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers. Sci. Rep. 5, 7751(2015).
  22. Plant transformation method. Patent. , WO2015133652 A1 (2015).
  23. Ng, K. K., et al. Intracellular delivery of proteins in intact plants via fusion peptides. PLoS ONE. 11, e0154081(2016).
  24. Lakshmanan, M., Kodama, Y., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Numata, K. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers. Biomacromolecules. 14, 10-16 (2012).
  25. Lakshmanan, M., Yoshizumi, T., Sudesh, K., Kodama, Y., Numata, K. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes. Plant Biotechnol. 32, 39-45 (2015).
  26. Numata, K., Ohtani, M., Yoshizumi, T., Demura, T., Kodama, Y. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide. Plant Biotechnol. J. 12, 1027-1034 (2014).
  27. Numata, K., et al. Enzymatic degradation processes of poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid-co-(R)-3-hydroxyvaleric acid] single crystals revealed by atomic force microscopy: effects of molecular weight and second-monomer composition on erosion rates. Biomacromolecules. 6, 2008-2016 (2005).
  28. Numata, K., et al. Adsorption of biopolyester depolymerase on silicon wafer and poly[(R)-3-hydroxybutyric acid] single crystal revealed by real-time AFM. Macromol. Biosci. 6, 41-50 (2006).
  29. Kawai, S., Nishizawa, M. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol. Cell. Biol. 4, 1172-1174 (1984).
  30. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Luo, D., Saltzman, W. M. Enhancement of transfection by physical concentration of DNA at the cell surface. Nat. Biotechnol. 18, 893-895 (2000).
  32. Boynton, J. E., et al. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science. 240, 1534-1538 (1988).
  33. Sikdar, R. S., Serino, G., Chaudhuri, S., Maliga, P. Plastid transformation. Arabidopsis thaliana Plant Cell Rep. 18, 20-24 (1998).
  34. Svab, Z., Hajdukiewicz, P., Maliga, P. Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 8526-8530 (1990).
  35. Liu, Y. G., et al. Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6535-6540 (1999).
  36. Park, H. S., Lee, B. M., Salas, G. M., Srivatanakul, M., Smith, H. R. Shorter T-DNA or additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated transformation. Theor. Appl. Genet. 101, 1015-1020 (2000).
  37. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10, 121-132 (2001).
  38. Que, Q., et al. Maize transformation technology development for commercial event generation. Front. Plant Sci. 5, 379(2014).
  39. Miranda, A., Janssen, G., Hodges, L., Peralta, E. G., Ream, W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. J. Bacteriol. 174, 2288-2297 (1992).
  40. Loeb, T. A., Spring, L. M., Steck, T. R., Reynolds, T. L. Transgenic wheat (Triticum spp.). Transgenic Crops I. Bajaj, Y. P. S. , Springer. 14-36 (2000).

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Mots-clés

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