Method Article

Élaboration d'un modèle de coiffage pulpaire direct pour l'évaluation des pulpaire Wound Healing et Formation reconstructrice Dentin chez la souris

DOI:

10.3791/54973

⸱

January 12th, 2017

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1The Shapiro Family Laboratory of Viral Oncology and Aging Research, The UCLA School of Dentistry, 2UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, 3David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons une méthode étape par étape de réalisation coiffage pulpaire direct sur les souris des dents pour l'évaluation de la cicatrisation pulpaire et la formation de dentine réparatrices in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La pulpe dentaire est un organe vital d’une dent entièrement protégé par l’émail et la dentine. Lorsque la pulpe est exposée en raison de lésions cariogènes ou iatrogènes, elle est souvent recouverte de matériaux biocompatibles afin d’accélérer la cicatrisation des plaies pulpaires. L’objectif ultime est de régénérer la dentine réparatrice, une barrière physique qui fonctionne comme un « sceau biologique » et protège le tissu pulpaire sous-jacent. Bien que cette procédure directe de coiffage pulpaire soit utilisée depuis longtemps en dentisterie, le mécanisme moléculaire sous-jacent de la cicatrisation des plaies pulpaires et de la formation réparatrice de la dentine est encore mal compris. Pour induire une dentine réparatrice, le coiffage pulpaire a été réalisé expérimentalement chez de grands animaux, mais moins chez la souris, probablement en raison de leur petite taille et des difficultés techniques qui en découlent. Ici, nous présentons une méthode détaillée, étape par étape, pour effectuer une procédure de coiffage pulpaire chez la souris, y compris la préparation d’une cavité de type Classe I, la mise en place de matériaux de coiffage pulpaire et la procédure de restauration à l’aide d’un composite dentaire. Notre modèle de souris à capuchon pulpaire jouera un rôle déterminant dans l’étude des mécanismes moléculaires fondamentaux de la cicatrisation des plaies pulpaires dans le contexte de la dentine réparatrice in vivo en permettant l’utilisation de souris transgéniques ou knock-out qui sont largement disponibles dans la communauté des chercheurs.

Introduction

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Les caries dentaires sont l’une des maladies bucco-dentaires les plus répandues et la principale cause d’interventions chirurgicales sur les dentitions chez presque tous les individus1,2. Le pronostic des interventions chirurgicales et des restaurations d’une dent dépend en grande partie d’une bonne réponse pulpaire et d’une cicatrisation réussie des plaies. En effet, les caries dentaires qui pénètrent profondément à travers l’émail et la dentine entraînent fréquemment l’exposition du tissu pulpaire sous-jacent qui est souvent « coiffé » avec des matériaux dentaires, tels que l’hydroxyde de calcium (Ca(OH)2) ou les ciments hydrauliques calcium-silicate (HCSC), y compris les agrégats de trioxyde minéral (MTA). Le but ultime d’une telle procédure de recouvrement pulpaire est d’accélérer la cicatrisation des plaies pulpaires en régénérant la dentine réparatrice, une barrière physique qui fonctionne comme un « sceau biologique » pour protéger le tissu pulpaire sous-jacent et augmenter l’espérance de vie de la dent et la santé bucco-dentaire globale. Cependant, le mécanisme sous-jacent de la cicatrisation pulpaire et de la formation réparatrice de la dentine n’est pas entièrement compris.

Pour mieux comprendre les mécanismes de cicatrisation des plaies pulpaires et de formation réparatrice de la dentine in vivo, plusieurs animaux ont été précédemment utilisés, notamment des singes, des chiens et des porcs3-5. Parmi eux, les rats sont fréquemment utilisés car ils sont relativement plus petits en taille par rapport aux autres animaux, mais leurs dents sont suffisamment grandes pour effectuer un coiffage direct de la pulpe sans aucune difficulté technique6-10. Ces modèles animaux sont des alternatives idéales aux études humaines pour examiner les réponses pulpaires et la formation réparatrice de la dentine. Cependant, leur utilisation est limitée aux études observationnelles au niveau cellulaire, et ils fournissent à peine des informations mécanistes lors de la formation réparatrice de la dentine au niveau moléculaire.

Les progrès techniques récents en génie génétique ont fourni des outils de recherche inestimables et indispensables - des souris qui hébergent un gène qui est soit surexprimé soit supprimé - qui jouent un rôle déterminant dans l’étude des mécanismes moléculaires des maladies humaines in vivo. Le nombre de souches différentes de souris transgéniques ou knock-out qui sont stratégiquement inductibles d’une manière spécifique à une cellule ne cesse d’augmenter dans la communauté scientifique. Par conséquent, l’examen de la cicatrisation pulpaire et de la régénération réparatrice de la dentine chez ces souris aiderait grandement à accélérer notre compréhension de ces processus au niveau moléculaire. Cependant, l’utilisation de souris est considérablement freinée, car l’exécution d’une procédure de recouvrement de la pulpe sur une dent de souris est techniquement difficile en raison de sa taille miniature. Ici, nous présentons notre méthode reproductible de coiffage pulpaire direct chez la souris pour l’évaluation de la cicatrisation pulpaire et de la formation réparatrice de dentine in vivo.

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Protocol

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Les souris ont été achetées auprès de Jackson Laboratory et conservés dans un vivarium exempt d'agents pathogènes dans la Division UCLA de médecine de laboratoire animale (DLAM). Les expériences ont été effectuées selon les directives institutionnelles approuvées du Comité de la recherche animale du chancelier (ARC N ° 2016-037).

1. Souris Anesthésie

  1. Utilisez huit semaines vieille souris C57 / BL6 femelles (n = 3).
  2. Anesthésier les souris en utilisant de la kétamine (80 à 120 mg / kg de poids de souris) / xylazine solution (5 mg / kg de poids de souris) et à administrer par voie intraperitoneale (ip) à une dose de 10 ml / kg.
  3. Préparer la kétamine (80-120 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg) des solutions et les administrer par voie intrapéritonéale (ip) à une dose de 10 ml / kg.
  4. Vérifiez que les souris sont complètement anesthésiés en effectuant une pincée d'orteil.

2. Procédure de coiffage pulpaire

  1. Placer le porte-embouchure dans la bouche de la souris.
  2. Fixer le porte-bouche sur la table telle que la luiannonce est orientée vers le haut.
  3. Placer le microscope (10X) au-dessus de la bouche de sorte que la première molaire du maxillaire est entièrement visible.
  4. Utilisation du ¼ de tour bur dans une pièce à main haute vitesse à 200 000 rpm, retirer la partie de l'émail de la dent dans le milieu jusqu'à ce que la pâte est visible à travers la dentine transparente. Ne pas exposer la pulpe avec le bur.
  5. L'utilisation d'un endodontique K-fichier # 15 (diamètre de 150 um), perforent par la dentine et d'exposer la pulpe.
    NOTE: Des précautions particulières doivent être prises pour que les débris de dentine ne soit pas poussé dans la pâte. Ceci peut être évité en faisant tourner le K-file trimestrielle, puis en tirant le K-déposer sur.
  6. Mélanger MTA avec H 2 O stérile conformément aux instructions du fabricant. Livrer et placez le MTA sur la pulpe exposée à la pointe de l'explorateur. Utilisez le côté arrière du point de papier (fine) pour emballer le MTA dans la pulpe exposée en tapotant doucement. Le côté le plus épais du point de papier est plat et permet doncpour la bonne condensation du MTA dans la pulpe exposée.
  7. Graver la dent pendant 15 s en plaçant l'agent d'attaque d'acide phosphorique à 35%, où elle couvre juste la dent. Prendre des précautions particulières afin de limiter le placement de l'agent d'attaque, car il peut irriter les tissus gingivaux.
    Remarque: le réactif d'attaque est dans une seringue et est utilisée pour rendre rugueuse la surface des dents de telle sorte que les adhésifs dentaires peuvent circuler pour médier la liaison micromécanique sur la dent. Parce qu'ils sont visqueux, il peut être autonome en appliquant de petites quantités directement sur la dent.
  8. Utilisez aspiration négative sous pression pour enlever le décapant. Utilisez une boulette de coton qui est légèrement imbibé d'H 2 O pour éliminer les résidus de la gravure. Répétez cette étape jusqu'à ce que la gravure est complètement retiré de la dent.
  9. L'utilisation d'un dépoussiéreur à air comprimé, sécher délicatement la dent.
  10. Appliquer les adhésifs dentaires à l'aide de l'arrière du point de papier.
  11. Faire la couche adhésive mince en utilisant l'air comprimé pendant 3 s.
  12. Cure les adhésifs dentaires pour 20 s à l'aide de l'unité de durcissement-lumière.
  13. Placer le composite fluide en petites quantités sur la dent qui a été coiffé avec MTA. Utilisez la pointe de l'explorateur à couler le composite dans les rainures des dents.
  14. Cure le composite pendant 30 s en utilisant une unité de photopolymérisation à polymériser. Vérifiez que le composite est complètement guéri et en utilisant l'explorateur dur.

3. Post-op Soins

  1. Administrer le carprofène (5 mg / kg) par voie sous- cutanée (sc) immédiatement après la procédure de pâte de coiffage.
  2. Placez la souris sur un coussin chauffant à faible puissance pour garder les animaux au chaud avant qu'ils ne se réveillent.
  3. Retour les souris au vivarium pour le logement.

4. Tissue Procurement

  1. Après 5 - 6 semaines euthanasier les souris par dislocation cervicale sous une condition d'anesthésie avec l'isoflurane.
  2. Retirez délicatement le maxillaire hors de la base du crâne et le mettre dans un tube de 50 ml. Fixer le entire maxillaires qui contient à la fois de la dent de la pâte à coiffe et la dent non coiffé controlatérale dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS, pH 7,4, à 4 ° C pendant une nuit, puis la stocker dans une solution d'éthanol à 70%.
    NOTE: Le paraformaldéhyde est toxique et cancérigène. L'utilisation appropriée paraformaldéhyde doit être surveillé comme indiqué dans les procédures d'utilisation normalisées (SOP).
  3. Balayez les maxillaires de souris à l'aide de l'analyse μCT. Pour sécuriser les maxillaires lors de la numérisation, envelopper les échantillons avec de la gaze imbibée d'éthanol à 70% et les placer dans le tube de culture de cellules de 15 ml.

5. μCT Numérisation

  1. Préparer les échantillons pour la numérisation μCT. En bref, envelopper les échantillons avec de la gaze imbibée d'éthanol à 70% et les fixer dans 15 ml de culture cellulaire tube conique générique. Monter le tube sur la scène de balayage μCT, comme indiqué dans les instructions du fabricant.
  2. Réglez la source de rayons X à un courant de 145 uA, une tension de 55 kV, et un temps d'exposition de 200 ms.
  3. Effectuer l'acquisition d'image avec le scanner μCT à une résolution de 20 um et avec un Al filtre de 0,5 mm.
  4. Reconstruire l'image et le visualiser 11.
  5. Une fois l'analyse de μCT est terminé, commencer décalcification avec 5% d'EDTA et 4% de saccharose dans du PBS (pH 7,4) pendant 2 semaines.

6. Traitement des tissus et Coloration

  1. Incluez les tissus décalcifiés dans la paraffine. Avant l'intégration, de l'assiette du maxillaire en faisant une coupe sagittale immédiatement antérieure à la première molaire. Bien que l'insertion, la position de cette surface vers le bas, de telle sorte que la section longitudinale de la première molaire est la surface de coupe.
  2. Utilisation du microtome, préparer 5 lames um d'épaisseur. Les zones de pâte de coiffage coïncident généralement avec la racine distopalatal (DP), qui peut être utilisé comme point de repère. Déterminer la zone précise d'intérêt en examinant l'histologie au microscope optique et en comparant les images μCT.
  3. Pour coloration H & E, Deparaffinize et réhydrater les lames avec du xylène (2 fois) et de l'éthanol dilué en série (EtOH 100% 2 x, 95% de EtOH 2x et 70% de EtOH 1 x).
  4. Rincer les lames avec de l'eau courante du robinet.
  5. Colorer avec une solution hématoxyline pendant 2,5 minutes et rincer à l'eau du robinet.
  6. Plonger les lames dans 95% d'éthanol pendant 1 min.
  7. Colorer avec une solution éosine pendant 1 min et rincer à l'eau du robinet.
  8. Déshydrater avec de l'éthanol dilué en série (70% de EtOH 1x, 2x EtOH à 95% et 100% de EtOH 3x) et du xylene (3 x).
  9. Monter les lames avec une solution de montage.

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Results

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Ici, nous avons montré les procédures étape par étape pour effectuer le coiffage pulpaire sur souris des dents. L'un des aspects clés de coiffage pulpaire chez la souris est d'avoir l'appareil approprié. A cet égard, comportant le microscope avec un grossissement de 10X puissance est essentielle (figure 1A). Pour créer une préparation de classe I comme dans la dent, nous avons utilisé une fraise ¼ tour dans une pièce à main haute vitesse électrique à 200.000 tours par mi...

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Discussion

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À l' heure actuelle, il existe plusieurs modèles expérimentaux disponibles pour valider les effets in vivo des matériaux dentaires, échafauds, ou des facteurs de croissance sur la différenciation odontogène des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) 13. Ces modèles comprennent une transplantation autologue de ectopique DPSC dans un organe tel que la capsule rénale, ou d'une transplantation sous - cutanée dans des souris immunodéprimées DPSC avec échafauds 14,15. Cependant, ce...

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par R01DE023348 (RHK) à partir de NIDCR / NIH et la Subvention Faculté de recherche (RHK) du Conseil de la recherche du Sénat académique de la Division de Los Angeles de l'Université de Californie.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Stéréomicroscope BM-LEDMEIJI TechnoMicroscope  ;
Optima MCX-LED  ;Bien Air Dental1700588-001Moteur électrique
isofluraneHenry schein santé animaleNDC 11695-0500-2
1/4 fraise rondeBrasseler001092T0
Endodontique K-fileRoydent98947
ProRoot MTADentsplyPROROOT5WMTA
Pointe de papierHenry schein100-3941
Ultra-EtchUltradent product Inc.Agent de gravure à l’acide phosphorique
OptiBond SoloPlusKerr29669Adhésifs
Coltolux LEDColtene/whaledent Inc.C7970100115Unité de polymérisation
Teinte de caractérisationBiscoT-14012Composite fluide
SkyscanBreuker1275Scanner uCT
MicromThermoHM355SMicrotome
Hematoxyline-1Thermo Scientific7221
Eosin-YThermo Scientific7111
Cytoseal 60Thermo Scientific8310-16Solution de montage

References

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