Ici, nous présentons un protocole pour la détermination des événements de signalisation intracellulaire induits dans les cellules viables par l’interaction physique avec des cellules mortes ou mourantes adjacentes. Le protocole se concentre sur les événements de signalisation induits par la reconnaissance des cellules mortes par le biais du récepteur, par opposition à leur absorption phagocytaire ou à la libération de médiateurs solubles.
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Article de méthode
Identification des événements intracellulaires de signalisation induite dans les cellules viables par interaction avec les cellules voisines Subissant la mort cellulaire apoptotique
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Résumé
Résumé
Les cellules meurent par apoptose, également appelé mort cellulaire comme réglementé, acquérir plusieurs nouvelles activités qui leur permettent d'influencer la fonction des cellules vivantes adjacentes. activités vitales, comme la survie, la prolifération, la croissance et la différenciation, sont parmi les nombreuses fonctions cellulaires modulées par les cellules apoptotiques. La capacité de reconnaître et de répondre à des cellules apoptotiques semble être une caractéristique universelle de toutes les cellules, indépendamment de la lignée ou de l'organe d'origine. Toutefois, la diversité et la complexité de la réponse à des cellules apoptotiques mandats qu'un grand soin soit pris en disséquant les événements de signalisation et les voies responsables de tout résultat particulier. En particulier, il faut distinguer entre les multiples mécanismes par lesquels les cellules apoptotiques peuvent influer sur les voies de signalisation intracellulaire dans les cellules répondeuses viables, comprenant: la reconnaissance médiée par le récepteur de la cellule apoptotique, la libération de médiateurs solubles par les cellules apoptotiques et / ou de l'engagement de la phagomachines cytic. Ici, nous fournissons un protocole permettant d'identifier les événements de signalisation intracellulaires qui sont induits dans les cellules répondeuses viables après leur exposition à des cellules apoptotiques. Un avantage majeur du protocole réside dans l'attention qu'il porte à la dissection du mécanisme par lequel les cellules apoptotiques modulent des événements dans les cellules répondant de signalisation. Bien que le protocole est spécifique d'une lignée conditionnellement immortalisée de rein de souris proximale de la cellule tubulaire (cellules BU.MPT), elle est facilement adaptable à des lignées cellulaires qui ne sont pas d'origine épithéliale et / ou dérivés d'organes autres que le rein. L'utilisation de cellules mortes comme un stimulus introduit plusieurs facteurs uniques qui peuvent nuire à la détection d'événements de signalisation intracellulaires. Ces problèmes, ainsi que des stratégies visant à minimiser ou les contourner, sont discutés dans le protocole. L'application de ce protocole devrait aider notre connaissance croissante de la grande influence que les cellules mortes ou mourantes exercent sur leurs voisins en direct, à la fois dans la santé et dans diseÃproprement parler.
Introduction
Apoptose, ou réglementé la mort cellulaire 1, contribue de manière essentielle à l'entretien et le développement des tissus. Vu la plus simple, permet d'apoptose âgés, endommagées, ou les cellules excédentaires à éliminer sans nuire aux tissus environnants 2,3. La contribution de l'apoptose à l'homéostasie tissulaire, cependant, est nettement plus dynamique et varié. Les cellules meurent par apoptose acquièrent plusieurs nouvelles activités, à la fois sécrétée et associée aux cellules, qui leur permettent d'influencer la fonction des cellules vivantes adjacentes 4-10. Des études antérieures ont porté sur la capacité des cellules apoptotiques pour supprimer l' inflammation 11-16, mais les cellules apoptotiques modulent également une large gamme de fonctions cellulaires, y compris des activités vitales comme la survie 4,9,10, la prolifération 4,9,10, la différenciation 17, migration 18, et la croissance 19. De plus, ces effets ne sont pas limités aux phagocytes professionnels, comme macrophages, mais étendre à pratiquement tous les types et les lignées cellulaires, y compris les cellules traditionnellement non phagocytaires, telles que les cellules épithéliales et endothéliales 7,9,10,18-21.
La réponse spécifique des cellules vivantes adjacentes suite à une exposition à des cellules apoptotiques dépend de multiples facteurs qui se rapportent à la fois les cellules répondant viables et les cellules apoptotiques eux-mêmes. Par exemple, bien que l' exposition à des cellules apoptotiques inhibe la prolifération des macrophages murins et les cellules epitheliales tubulaires proximales des reins (PTECs), ces deux types de cellules diffèrent considérablement dans leur réponse à la survie des cellules apoptotiques 4,6,9,10. Les cellules apoptotiques favorisent la survie des macrophages, mais induisent la mort apoptotique de PTECs 4,6,9,10. En particulier, la réponse aux cellules apoptotiques peuvent varier , même parmi les cellules répondant de la même lignée, en fonction de l'organe de la cellule de réponse d'origine 10 (par exemple, PTECs rénaux par rapport à l' épithélium mammairecellules) ou état d'activation 22 (par exemple, les neutrophiles). A l' inverse, les cellules apoptotiques peuvent provoquer des réactions différentes dans la même cellule en fonction de la nature du stimulus apoptotique 10,23 ou au stade de l' apoptose 10,14.
Compte tenu de la diverseness et de la complexité de la réponse à des cellules apoptotiques, un grand soin doit être pris à disséquer les événements de signalisation et les voies responsables de tout résultat particulier. Tout d' abord, les réponses nécessitant une interaction physique directe entre les cellules viables et apoptotiques doivent être différenciés de ceux provoqués par les médiateurs solubles libérés ou générés par la cellule apoptotique 3,6-10. Si une interaction physique est nécessaire, une différenciation supplémentaire doit être effectuée. les événements de signalisation peuvent dépendre de la reconnaissance médiée par le récepteur de la cellule apoptotique, indépendamment de l'engloutissement subséquente ou de l'absorption phagocytaire, indépendamment du récepteur spécifique qui se lie à la cellule apoptotique 3-7,9,10,19. Dans ce dernier cas, la réponse est non spécifique aux cellules apoptotiques, et peut être déclenchée par n'importe quel matériau phagocytaire 4,6.
L'importance de ces différences peut à nouveau être appréciée en comparant les réponses des macrophages et PTECs rénaux. Pour les deux types de cellules, l'exposition à des cellules apoptotiques modifie l'activité de la pro-survie kinase Akt. La modulation dépend de l' interaction physique, étant donné que la séparation des cellules apoptotiques et de répondre par une membrane de polycarbonate de 0,4 um supprime la réponse 4,9,10,19. Cependant, la réponse de PTECs est médiée par un récepteur indépendant de la phagocytose, alors que la réponse des macrophages est entraînée par phagocytose 4,9,10,19. Cette conclusion est renforcée par le fait que l' exposition à des billes de latex, un stimulus phagocytaire neutre, n'a pas d' effet sur l' activité Akt dans PTECs, mais imite l'effet des cellules apoptotiques dans les macrophages 4,9.
"> Bien que moins bien étudié, les cellules meurent par nécrose ou mort accidentelle de la cellule 1, modulent également la fonction des cellules à proximité viables 3-10,19. Comme les cellules apoptotiques, les cellules nécrotiques exercent leurs effets à travers une variété de mécanismes, notamment la fuite du contenu intracellulaire à travers leur membrane cellulaire rupture 3,5,6,9,24. de nombreuses cellules, y compris les PTECs et les macrophages, possèdent des récepteurs distincts non concurrentes pour les cellules meurent par une nécrose de 5,9. l' engagement de ces récepteurs induit des événements de signalisation qui sont souvent opposés à ceux induits par l' engagement des récepteurs des cellules apoptotiques 4-10,19. par exemple, dans PTECs, les cellules nécrotiques augmentent la phosphorylation de Akt, tandis que les cellules apoptotiques diminue la phosphorylation 9,10,19.Ici, nous décrivons un protocole pour identifier les événements de signalisation intracellulaires induits dans PTECs rénaux viables par la reconnaissance médiée par le récepteur des PTECs adjacents apoptotiques 9,10,19. Bien que le protocole est spécifique à une lignée cellulaire immortalisée de manière conditionnelle PTEC appelées cellules BU.MPT 9,10,19,25,26, elle est facilement adaptable à des lignées cellulaires qui ne sont pas d'origine épithéliale et / ou dérivés d'autres organes que le rein. Surtout, l'utilisation de cellules apoptotiques comme un stimulant de cellules pose certaines difficultés expérimentales intrinsèques ne sont pas présents avec des ligands solubles. Le plus important est que les cellules apoptotiques doivent être ajoutés sous forme d'une suspension plutôt que comme une solution. Ces difficultés, ainsi que des stratégies visant à minimiser ou les contourner, sont discutés dans le protocole. Presque toutes les techniques décrites dans le protocole sont simples et standard pour la culture cellulaire. L'avantage de ce protocole réside dans son attention sur les multiples mécanismes par lesquels les cellules apoptotiques modulent la transduction du signal dans les cellules répondantes. Ces mécanismes comprennent la liaison par l'intermédiaire des déterminants de surface ou des molécules de pontage à des récepteurs spécifiques sur la repondant cellulaire, la libération de médiateurs solubles et / ou de l'engagement du mécanisme phagocytaire. Les cellules nécrotiques sont incluses dans toutes les expériences pour faire en sorte que les résultats sont spécifiques au mode de mort cellulaire, et non une réaction généralisée aux cellules mortes. Une approche prudente, comme il est recommandé dans ce protocole, est essentielle à notre compréhension de l'influence toujours croissante que les cellules qui meurent exercent sur leurs voisins en direct, à la fois la santé et de la maladie.
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Protocole
1. Préparatifs
Remarque: Dans ce protocole, deux ou plusieurs lignées cellulaires ou des cultures de cellules primaires, sont préparés indépendamment dans des conditions spécifiques. Ces préparations comprennent des cellules apoptotiques (Protocole 1), les cellules nécrotiques (protocole 2), et les cellules de répondeur en bonne santé (protocole 3). Après la préparation indépendante des cellules apoptotiques ou nécrotiques sont ajoutées aux cellules répondeuses et de la transduction du signal résultant est surveillé (protocoles 4, 5 et 6).
- Préparer les milieux de culture et réactifs
- Préparer 500 ml de milieu de culture A (pour une utilisation lors de la croissance des cellules dans des conditions permissives, voir section 1.2) en combinant les éléments suivants: Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Dulbecco contenant 4,5 g / L de glucose, 584 mg / L ʟ-glutamine, 110 mg / L de pyruvate de sodium, 100 unités / ml de pénicilline-streptomycine, 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin (FBS) et 10 unités / ml d'interféron-γ (IFN-γ).
- Préparer 500 ml de milieu de culture B (pour un usage when cellules de sérum-faim dans des conditions non permissives, voir la section 1.2) en omettant de FBS et IFN-γ de la recette du milieu de culture A. Pour cultiver des cellules dans des conditions non permissives (avant sérum famine), ajouter 10% v / v de FBS à milieu de culture B.
- Préparer 0,4% (v / v) de paraformaldehyde, pH 7,2, dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco 1x (DPBS) à partir de 4% de paraformaldehyde actions pour la fixation des cellules mortes.
Note: paraformaldéhyde est toxique, et la prudence appropriée devrait être exercée dans son utilisation.
- cellules BU.MPT Culture
- Décongeler de l'azote liquide d'un flacon de cellules BU.MPT.
Remarque: BU.MPT est une cellule épithéliale tubulaire (PTEC) ligne proximale de rein de souris provenant d'une souris transgénique portant un (ts) une mutation sensible à la température (tsA58) de l'antigène tumoral grand SV40 (TAG) sous le contrôle de la souris majeur complexe d'histocompatibilité (CMH) H-2K b classe I promoteur 25,26. - cellules de plaques sur polystyr stériletraités boîtes de culture de tissu ène plasma sous vide de gaz (~ 5 x 10 6 cellules par boîte de 100 mm de diamètre).
- Cultiver des cellules dans des conditions permissives dans un humidifiée à 5% (v / v) atmosphère de CO 2.
Remarque: Les conditions permissives, qui sont définies comme la culture à 33-37 ° C en présence d'IFN-γ, permettent une expression stable du transgène TAg tsA58 muté. Contrairement à des cultures primaires de souris rein PTEC, qui ne survivent pas plus d'un seul passage ou deux, BU.MPT cultivée dans des conditions permissives peuvent être repiquées indéfiniment.- cellules Passage au moins trois fois après la décongélation avant de les utiliser dans une expérience.
- Pour les cellules de passage, ajouter 1 ml de trypsine à 0,05% par boîte de 100 mm, et incuber dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2 à 37 ° C pendant 5 min. Neutraliser la trypsine en ajoutant 10 ml de milieu A. Aspirer les cellules individuelles, et de diviser 1: 3 à 1: 5 dans de nouveaux 100 mm de polystyrène stérile SIT plasma sous vide de gaz traitédes boîtes de culture. ue Ajouter le milieu A pour porter le volume jusqu'à un total de 10 ml par boîte de 100 mm.
- cellules Passage au moins trois fois après la décongélation avant de les utiliser dans une expérience.
- En préparation pour une utilisation expérimentale comme répondant cellules, cultiver des cellules jusqu'à la confluence dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2 dans des conditions non permissives (ie à 39 ° C en l'absence d'IFN-γ [milieu B contenant 10% v / v de FBS]).
Remarque: Dans des conditions non permissives, l'expression du transgène TAg tsA58 mutée est inhibée par> 95%, et les cellules BU.MPT se comportent comme des cultures primaires de rein de souris PTEC.
- Décongeler de l'azote liquide d'un flacon de cellules BU.MPT.
2. Préparation des cellules apoptotiques BU.MPT (Protocole 1)
Remarque: Ce protocole est spécifique des cellules BU.MPT en tant que source de cellules apoptotiques et la staurosporine que la méthode de l'induction de l'apoptose. En variante, une autre lignée cellulaire ou une culture de cellules primaires, peuvent être utilisés comme source de cellules apoptotiques, et l'apoptose induite par protoco normaliséls pour ce type particulier de cellules et la méthode d'induction de l'apoptose.
- Après le passage sur un diamètre de 100 mm polystyrène stérile plasma sous vide de gaz traités boîtes de culture de tissu, poussent les cellules BU.MPT jusqu'à la confluence dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2 dans des conditions permissives (ie à 37 ° C en milieu de culture A à 10 ml par boîte de 100 mm), comme décrit dans la section 1.2.3.
- Rincer la monocouche de cellules adhérentes à trois reprises avec un milieu de culture B, en utilisant 10 ml par rinçage.
- Induire l' apoptose par incubation des cellules dans un milieu de culture contenant B staurosporine, un inhibiteur de protéine kinase non sélectif, à 1 pg / ml pendant 3 h dans un humidifiée à 5% (v / v) , une atmosphère de CO2 à 37 ° C.
- Aspirer le milieu contenant staurosporine contenant "flottantes" cellules apoptotiques qui sont détachés de la monocouche. Centrifugeuse ce milieu pendant 10 min à 500 g, éliminer le surnageant, laver le culot trois fois avec un milieu de culture B, etajouter le culot de retour aux cellules recueillies dans l'étape suivante, 2.5.
- Détacher les cellules adhérentes restantes des étapes 2.3 et 2.4 par addition de 5 mM (acide éthylènediaminetétraacétique) EDTA dans 1x Ca 2 + - et Mg 2 + -free DPBS à 1 ml par boîte de 5 min. Aspirer le milieu contenant de l'EDTA contenant des cellules apoptotiques individuelles, et mettre en commun les cellules individuelles avec les "flottantes" cellules apoptotiques de l'étape 2.4 dans un tube de 15 ml de polystyrène à centrifuger stérile.
- Laver les cellules apoptotiques trois fois par centrifugation pendant 10 min à 500 x g et remise en suspension dans 10 ml de 1 x Ca + 2 - et Mg + 2 sans gluten DPBS par lavage.
- Après le dernier lavage, suspendre les cellules apoptotiques dans un milieu de culture frais B à ~ 5 x 10 6 cellules par ml avant utilisation pour stimuler les cellules de répondeur. Alternativement, fixer les cellules apoptotiques lavées dans 0,4% (v / v) paraformaldehyde dans 1x DPBS pendant 30 min, puis laver trois fois avec la culturemilieu B, avant la suspension dans un milieu de culture B.
- Le cas échéant, confirmer induction de l' apoptose par cytométrie de flux en utilisant une préparation séparée des cellules apoptotiques (ou en réservant des cellules à cette fin), comme décrit précédemment 6,9,10,15.
Nota: Les premières cellules apoptotiques ont des membranes cellulaires intactes, et apparaissent comme l'iodure de propidium (PI) cellules séronégatifs et annexine V-positif de la diminution de la taille des cellules (par rapport aux cellules viables). Late cellules apoptotiques ont des membranes cellulaires non-intactes, et apparaissent comme des cellules PI-positives et annexine V-positif de la diminution de la taille des cellules. En utilisant le protocole actuel, les préparations typiques contiennent ~ 85% apoptotique précoce et ~ 15% de cellules apoptotiques tardives. - Ajouter des cellules apoptotiques à BU.MPT cellules répondeuses (protocole 3) à un rapport apoptotique-répondeur à cellule de 1: 1, soit directement, soit après la fixation des cellules apoptotiques pendant 30 min avec 0,4% (v / v) de paraformaldehyde dans 1 x DPBS .
Note: apoptotique fixation des cellules avant la stimulation des intervenants devraitpas d' incidence sur les résultats, à moins que les événements de signalisation observés sont dus à la libération d'un médiateur soluble (tableau 1).
3. Préparation des cellules nécrotiques BU.MPT (protocole n ° 2)
Remarque: Ce protocole est spécifique des cellules BU.MPT comme source de cellules nécrotiques, et de chauffage du procédé de nécrose induction. En variante, une autre lignée cellulaire ou une culture de cellules primaires, peuvent être utilisés comme source de cellules nécrotiques, avec la nécrose induite par des protocoles normalisés pour ce type particulier de cellule et un procédé de nécrose induction.
- Après le passage sur un diamètre de 100 mm polystyrène stérile plasma sous vide de gaz traités boîtes de culture de tissu, poussent les cellules BU.MPT jusqu'à la confluence dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2 dans des conditions permissives (ie à 37 ° C en milieu de culture A à 10 ml par boîte), comme décrit dans la section 1.2.3.
- Rincer la monocouche de cellules adhérentes à trois reprises avec un milieu de culture B, en utilisant10 mL par rinçage.
- Détacher les cellules par addition d'EDTA 5 mM dans 1 x Ca + 2 - et Mg + 2 sans gluten DPBS à 1 ml par boîte pendant 5 min. Aspirer le milieu contenant de l'EDTA contenant des cellules détachées, et ajouter la suspension cellulaire à un tube de 15 ml en polystyrène de centrifugation stérile.
- Laver les cellules trois fois par centrifugation pendant 10 min à 500 x g et remise en suspension dans 10 ml de Ca2 + - et Mg + 2 sans gluten DPBS par lavage.
- Après le dernier lavage, les cellules en suspension dans un milieu de culture frais B à ~ 5 x 10 6 cellules par ml.
- Induire une nécrose des cellules en chauffant à 70 ° C pendant 45 min dans un bain d'eau, tourbillonner doucement la suspension de cellules toutes les 10 min.
- Incuber les cellules pendant 2 h dans un humidifiée à 5% (v / v) une atmosphère de CO2 à 37 ° C. vortex doucement la suspension de cellules toutes les 15 min.
- Le cas échéant, confirmer l'induction de la nécrose par cytométrie en flux en utilisant une préparation séparée de necrotic cellules (ou en réservant des cellules à cette fin), comme précédemment décrit 6,9,10,15.
Remarque: Les cellules nécrotiques ont rompu les membranes cellulaires, et apparaissent comme des cellules PI positif de l'augmentation de la taille des cellules (par rapport aux cellules viables). En utilisant le protocole actuel, les préparations typiques contiennent ≥ 95% de cellules nécrotiques. En variante, l'induction d'une nécrose et une perte d'intégrité de la membrane peut être confirmée par une coloration au bleu Trypan.
4. Préparation des cellules BU.MPT Responder (protocole n ° 3)
Remarque: Ce protocole est spécifique des cellules BU.MPT comme source de cellules répondeuses. En variante, une autre lignée cellulaire ou une culture de cellules primaires, peuvent être utilisés en tant que cellules répondeuses. Avant utilisation expérimentale, quiescence peut être induite par nuit protocoles normalisés au sein du laboratoire.
- Cultiver les cellules BU.MPT à 100 mm boîtes de culture de tissus stériles dans des conditions permissives dans un milieu de culture A à 10 ml par boîte jusqu'à ce qu'ils atteignent ~85% de confluence.
- culture Aspirer milieu A, et rincer les cellules trois fois avec un milieu de culture B à 10 ml par rinçage. Sérum-affamer les cellules pendant la nuit pendant 18 à 24 h dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2 dans des conditions non permissives (ie à 39 ° C en milieu de culture B à 10 ml par boîte), tel que décrit dans la section 1.2 .4, afin d'induire la quiescence. Alternativement, cultiver des cellules dans un milieu de culture B plus de 10% (v / v) de FBS à 39 ° C pendant une journée avant que les cellules de sérum de faim pendant la nuit dans un milieu de culture B sans FBS.
- Etiqueter un plat de cellules BU.MPT confluentes de culture de tissus pour chaque condition expérimentale.
- Inclure les six conditions suivantes: stimulation des répondeurs BU.MPT viables avec le facteur de croissance, soit du véhicule ou de l'épiderme (EGF) pendant 15 min, après leur exposition pendant 30 minutes, soit à aucune cellule, des cellules apoptotiques ou de cellules nécrotiques.
Remarque: L'exposition à des cellules mortes peut stimuler ou inhiber le niveau d'activité d'un giême molécule de signalisation. La stimulation est mieux détecté au- dessus d' un faible niveau de référence (par exemple, absence d'EGF), alors que l' inhibition est mieux détectée à partir d' une base de référence élevée (par exemple, la présence d'EGF). Comme l'effet de la stimulation avec des cellules mortes est a priori inconnu, il est recommandé d'effectuer toutes les études à la fois l'absence et la présence de EGF.
5. Stimulation des cellules Responder avec apoptotique et cellules nécrotiques (protocole n ° 4)
- Aspirer milieu de culture B des plats pré-étiquetés de repos (sérum-faim) BU.MPT cellules répondantes (Protocole 3).
Remarque: Après une nuit de culture dans des conditions non permissives, les cellules BU.MPT devrait se comporter comme des cultures primaires de rein de souris PTEC. - Par boîte de 100 mm, ajouter 2 ml d'une des opérations suivantes: milieu de culture B (pas de cellules); suspension de cellules apoptotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un milieu de culture B (Protocole 1); ou de suspension de cellules nécrotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml in milieu de culture B (protocole n ° 2).
- Distribuer la suspension 2 ml de cellules mortes uniformément sur le plat de 100 mm, et de garder le temps pour eux de régler au minimum. Pour ce faire, distribuer les morts goutte de suspension cellulaire à goutte avec une pipette de pointe large sur toute la surface des plats de cellules de répondeur. Utiliser un volume de 2 ml en tant que compromis entre la réduction du temps de stabilisation et d'éviter l'agglutination des cellules mortes.
Note: L'utilisation d'une suspension de cellules mortes comme un stimulus entraîne un certain nombre de considérations spéciales, qui sont décrits ci - dessous plus en détail (tableau 2 et discussion). - Atteindre un ratio de 1 ~ mort à répondeur cellule: 1 en ajoutant 2 mL de cellules mortes à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un plat confluentes de 100 mm, qui contient ~ 10 x 10 6 cellules. En variante, afin d'établir la relation dose-dépendance de tous les événements de signalisation observés, faire varier le rapport de la mort des cellules répondeuses en continu par dilution progressive cileure milieu B des suspensions de cellules mortes préparées dans les protocoles 1 et 2.
- Distribuer la suspension 2 ml de cellules mortes uniformément sur le plat de 100 mm, et de garder le temps pour eux de régler au minimum. Pour ce faire, distribuer les morts goutte de suspension cellulaire à goutte avec une pipette de pointe large sur toute la surface des plats de cellules de répondeur. Utiliser un volume de 2 ml en tant que compromis entre la réduction du temps de stabilisation et d'éviter l'agglutination des cellules mortes.
- Remuer doucement les plats, puis incuber à 37 ° C dans un humidifié à 5% (v / v) atmosphère de CO 2.
- Après 30 min, stimuler les cellules répondantes avec un véhicule ou 50 nM d'EGF, d'après le pré-marquage de la boîte de culture.
- Incuber pendant 15 min à 37 ° C dans un humidifiée à 5% (v / v) , une atmosphère de CO2.
- Laver les cellules mortes en ajoutant 5 ml de glace-froid 1x DPBS, tourbillonnant le plat, et aspirer le liquide de lavage. Répétez trois fois.
- Immédiatement placer les plats de cellules de répondeur sur la glace pour un traitement ultérieur.
- Préparer des lysats cellulaires
- Préparer un tampon de lyse cellulaire contenant ce qui suit: 1 x tampon Tris salin (TBS), le pyrophosphate de sodium 10 mM, 0,5% p / v de désoxycholate, 0,1% p / v de SDS, 10% de glycerol, et le fluorure de sodium 25 mM.
- Immédiatement avant la lyse cellulaire, ajouter ce qui suit dans l'ordre exact donné à l'indLes concentrations icated: inhibiteur de protéase de mini-cocktail d'EDTA (1 comprimé par 10 ml de tampon de lyse), 10% (v / v) de Triton X-100, 1 mM de dithiothréitol (DTT), le fluorure de phénylméthanesulfonyle 1 mM (PMSF), et 10 orthovanadate de sodium mM.
- Ajouter 700 pi de tampon de lyse cellulaire glacée par boîte de 100 mm de cellules répondeuses fraîchement stimulées sur la glace de l'étape 5.7. Racler les cellules avec un grattoir à cellules et transférer le lysat pré-refroidie de 1,5 ml microtubes. Maintenir les tubes sur la glace pendant 15 min.
- lysats Soniquer sur la glace avec 10 impulsions de 20 Hz, moins d'une seconde chacun dans la durée. Eviter la formation de mousse à l'interface gaz / liquide, car cela peut surchauffer les échantillons. immerger complètement la sonde sonicateur dans les microtubes contenant lysats avant de mettre l'appareil à ultrasons sur, et mettez le sonicateur avant de retirer la sonde à partir des lysats.
- Centrifugeuse à 20.000 xg pendant 10 min à 4 ° C, transférer les surnageants dans des microtubes pré-réfrigérés frais, Et conserver à -70 ° C.
- Effectuer une électrophorèse sur gel et immunotransfert de lysats sur des surnageants, comme décrit précédemment 6,9,10,15.
- Préparer un tampon de lyse cellulaire contenant ce qui suit: 1 x tampon Tris salin (TBS), le pyrophosphate de sodium 10 mM, 0,5% p / v de désoxycholate, 0,1% p / v de SDS, 10% de glycerol, et le fluorure de sodium 25 mM.
6. Prévention de contact direct physique entre les cibles et les intervenants L'utilisation d'un semi-perméable Polycarbonate Membrane (Protocole 5)
- Préparer les cellules répondeurs BU.MPT selon le protocole 3, à une exception; faire croître des cellules dans une culture tissulaire en polystyrène stérile traité grappes de 12 puits.
- Dans les puits sélectionnés, placer un système de support perméable contenant une membrane de polycarbonate de 0,4 um pour empêcher une interaction physique entre les cellules mortes et répondeurs. Inclure les puits témoins sans membrane dans la même expérience.
- Aspirer milieu de culture B à partir de puits expérimentaux de cellules BU.MPT répondeurs privées de sérum.
- Suivre le protocole 4 pour la stimulation des cellules répondeuses avec des cellules apoptotiques ou nécrotiques, avec les modifications suivantes:
- Par puits de 1groupe 2 puits, ajouter 0,1 mL d'une des opérations suivantes: milieu de culture B (pas de cellules); suspension de cellules apoptotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un milieu de culture B (Protocole 1); ou d'une suspension de cellules nécrotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un milieu de culture B (protocole 2).
Remarque: Comme bien agglomérée d'un groupe de 12 puits contenant 0,5 x 10 ~ 6 cellules, l'addition de 0,1 ml de cellules mortes à ~ 5 x 10 6 cellules par ml donne un rapport de point mort à répondeur cellule d'environ 1: 1. - Aux puits contenant le système de support perméable, ajouter les cellules mortes au-dessus de la membrane de polycarbonate de 0,4 um dans le système de support perméable, de sorte qu'il n'y a aucune interaction physique directe entre les cellules mortes et répondeurs.
- Par puits de 1groupe 2 puits, ajouter 0,1 mL d'une des opérations suivantes: milieu de culture B (pas de cellules); suspension de cellules apoptotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un milieu de culture B (Protocole 1); ou d'une suspension de cellules nécrotiques à ~ 5 x 10 6 cellules par ml dans un milieu de culture B (protocole 2).
7. L'inhibition de la phagocytose par la cytochalasine D (protocole n ° 6)
- Préparer les cellules répondeurs BU.MPT conformément au protocole 3.
- Préparer le cytosquelette inhibiteur cytochalasine D dans dimethyl sulfoxyde (DMSO) à 4 mg / ml (1000 fois). Ajouter des plats pré-marqués de cellules répondeuses BU.MPT soit 10 pl de véhicule (DMSO) ou 10 ul de cytochalasine D pour obtenir une concentration finale de 4 pg / mL dans 10 mL de milieu de culture B.
Note: A cette concentration , la cytochalasine D, la phagocytose par les cellules BU.MPT et une lignée de cellules macrophages est inhibée par ≥90% 9,10. - Incuber pendant 2 heures à 37 ° C dans un humidifiée à 5% (v / v) atmosphère de CO 2.
- Suivre le protocole 4 pour la stimulation des cellules répondeuses avec des cellules apoptotiques ou nécrotiques.
- Le cas échéant, confirmer l' inhibition de la phagocytose des cellules mortes par cytométrie en flux en utilisant une préparation séparée des cellules mortes et répondeur (ou cellules réservées à cet effet), comme décrit précédemment 9,10.
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Résultats
Dans la figure 1, nous fournissons un schéma représentant les timing et critiques étapes impliquées dans la préparation de cellules apoptotiques (Protocole 1) et les cellules nécrotiques (protocole 2) et la stimulation des cellules de répondeur avec des suspensions de cellules apoptotiques et nécrotiques (protocole n ° 4).
Sur la figure 2, nous fournissons des résultats représentatifs montrant...
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Discussion
Nous fournissons ici un protocole permettant de caractériser les événements de signalisation intracellulaires induits dans les cellules viables suite à leur exposition à des cellules subissant une apoptose ou d'autres formes de mort cellulaire. Le protocole met l'accent sur les multiples mécanismes par lesquels l'exposition à des cellules apoptotiques peuvent moduler les voies de signalisation intracellulaire dans les cellules répondeuses viables. Ces mécanismes sont les suivants: l'interaction (par l...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu, en tout ou en partie, par des fonds institutionnels du Dr José A. Arruda et de la Section de néphrologie de l’Université de l’Illinois à Chicago (à J. S. L.) ; et par le financement du Département de médecine de l’Université McGill et de l’Institut de recherche du Centre universitaire de santé McGill (à J. R.)
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Matériaux de culture cellulaire | |||
| DMEM, 1x avec [4,5 g/L] de glucose, ʟ ;-glutamine et sodium-pyruvate | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, sérum fœtal bovin | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | ajouter 10 % (v/v) ; au milieu de culture A |
| Pénicilline-Streptomycine-Glutamine, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | Ajouter 100 unités/mL aux milieux de culture A et B |
| &gamma ;-Interféron, recombinant de souris, à partir de Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | ajouter 10 unités/mL au milieu de culture Plats traités pour culture tissulaire en |
| polystyrène Falcon, non pyrogènes | Corning (Durham, NC) | 353003 | stériles, Tubes |
| à centrifuger en polystyrène Falcon | Corning (Durham, Caroline du Nord) | 352095 | stérile, 15 mL |
| Trypsine-EDTA, 0,05 %, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | stérile, 100 mL< |
| strong>Nom | > | /strong> | Comments |
| Produits chimiques et inhibiteurs | |||
| Staurosporine, de Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | utilisation à [1 &mu ; g/mL] pendant 3 h pour induire l’apoptose |
| Facteur de croissance épidermique (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | à utiliser à 50 nM pour stimuler les cellules répondeuses |
| UltraPure, 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | utiliser 5 mM pour détacher les cellules adhérentes |
| Solution de bleu de trypan, 0,4 % | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | pour la coloration des cellules mortes |
| Solution de paraformaldéhyde, 4 % dans le DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | utiliser 0,4 % (v/v) dans 1x DPBS pour la fixation cellulaire |
| saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | solution mère |
| Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), Ca2+ et Mg2+, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | solution mère |
| de cytochalasine D, 4 mM dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO), à partir de Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | utilisation à [4 &mu ; g/mL] pour inhiber la phagocytose |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | Solvant D2650 | pour cytochalasine D |
| [en-tête] | |||
| Ingrédients du tampon de lyse cellulaire | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | pour tampon de lyse cellulaire |
| Pyrophosphate | de sodiumSigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM pour tampon de lyse cellulaire |
| Désoxycholate | de sodium Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0,5 % p/v pour tampon de lyse cellulaire |
| Dodécylsulfate de sodium (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 ; | 0,1 % p/v pour le tampon de lyse cellulaire |
| Glycérol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10 % pour tampon de lyse cellulaire |
| Fluorure de sodium | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM pour tampon de lyse cellulaire |
| Mini comprimé cocktail complet d’inhibiteur de protéase sans EDTA | Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) | 4693159001 | pour tampon de lyse cellulaire, 1 comprimé pour 10 mL de tampon Triton |
| X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10 % pour tampon de lyse cellulaire |
| Dithiothréitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM pour tampon de lyse cellulaire |
| Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM pour tampon de lyse cellulaire |
| Orthovandate de sodium | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM pour tampon |
| de lyse cellulaireName | Company | Catalog | Comments |
| Equipment | |||
| Sorvall T6000B | centrifugeuse Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, bain-marie | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Démembrateur sonique (sonicateur), modèle 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Miscellaneous | |||
| Chambre de comptage cellulaire, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, Royaume-Uni) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | pour la coloration PI et Annexine V pour déterminer le stade de l’apoptose |
| Tubes microcntrifuges Eppendorf, 1,5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Support perméable Transwell, 0,4 &mu ; membrane en polycarbonate Corning | (Corning, NY) | 3413 | stérile, polystyrène, traité par culture tissulaire |
| Nom | Entreprise | Catalog | Comments |
| Antibodies | |||
| Phospho-glycogène synthase kinase-3&alpha ;/&beta ; (GSK-3&alpha ;/&beta ;) (Ser21/9), anticorps polyclonal | Technologie de signalisation cellulaire | 9331 | Anticorps polyclonal de lapin |
| Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) antocorps monoclonal ( (14C10) ) | Technologie de signalisation cellulaire | 2118 | Anticorps monoclonal de lapin |
Références
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Réimpressions et autorisations
