Ce protocole démontre l'isolation des îlots murins et le semis sur un échafaud décellularisé. Les îlots soutenus par des échafaudages ont été transplantés dans la pate épididymique des souris diabétiques induites par la streptozotocine (STZ). Les îlots ont survécu au site de transplantation et ont inversé l'état hyperglycémique.
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Article de méthode
Transplantation soutenue d'échafaudage d'îlots dans la pate épididimale de souris diabétiques
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La transplantation d'islet a été cliniquement prouvée pour être efficace dans le traitement du diabète de type 1. Cependant, la stratégie actuelle de transplantation intra-hépatique peut entraîner des réactions aigues du sang total et entraîner une mauvaise greffe d'îlot. Ici, nous signalons un protocole robuste pour la transplantation d'îlots sur le site de transplantation extrahépatique - le tampon gras épididymal (EFP) - sur un modèle de souris diabétique. Un protocole d'isolement et de purification des îlots aux rendements élevés de souris C57BL / 6J est décrit, ainsi qu'une méthode de transplantation réalisée par ensemencement d'îlots sur un échafaud décellularisé (DCS) et l'implantation au site EFP dans des souris C57BL / 6J syngéniques rendues diabétiques Par streptozotocine. Le greffon DCS contenant 500 îlots a inversé l'état hyperglycémiant dans les 10 jours, alors que les îlots libres sans DCS nécessitaient au moins 30 jours. La normoglycémie a été maintenue jusqu'à 3 mois jusqu'à ce que le greffon soit explanté. En conclusion, DCS a amélioré la greffe d'îlots en tLe site extrahépatique de l'EFP, qui pourrait facilement être récupéré et pourrait fournir une plate-forme reproductible et utile pour l'étude des matériaux d'échafaudage, ainsi que d'autres paramètres de transplantation requis pour une greffe d'îlot réussie.
Introduction
Le diabète mellitus de type 1 (T1D) est un trouble endocrinien auto-immune dans lequel les cellules d'îlot sont éliminées par le système immunitaire, ce qui rend les patients dépendants de l'injection d'insuline exogène pendant toute leur vie. Le protocole d'Edmonton représente un jalon dans les études cliniques de transplantation d'îlots; Les îlots ont été infusés à travers la veine porte et ont été transplantés au site intra-hépatique 1 . Cependant, deux principaux obstacles - sources insuffisantes d'îlots de donneurs et de greffe d'islet pauvres - empêchent le grand succès de la transplantation d'îlots
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Protocole
Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université de Pékin (IACUC, numéro IACUC, COE-LuoY-1).
1. Isolation des îlots
- Préparation de réactifs et d'équipements.
- Reconstituer la poudre de colagénase P (2 U / mg) dans HBSS pour obtenir une solution de 5 mg / ml et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les bactéries. Préparer des solutions aliquotes de 0,6 ml de collagénase P dans des tubes coniques de 15 ml et conserver à -20 ° C.
REMARQUE: Pendant l'utilisation, chaque portion aliquote est diluée avec HBSS p....
- Reconstituer la poudre de colagénase P (2 U / mg) dans HBSS pour obtenir une solution de 5 mg / ml et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm pour éliminer les bactéries. Préparer des solutions aliquotes de 0,6 ml de collagénase P dans des tubes coniques de 15 ml et conserver à -20 ° C.
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Résultats
Notre méthode de serrage, réalisée à l'aide d'une pince microscopique hémostatique, est simple et économique en comparaison de la technique de ligature de suture. Il a fallu environ 4 h pour isoler et purifier environ 1 200 îlots de 6 souris. Les îlots fraîchement isolés avaient généralement une périphérie rugueuse sous un microscope optique ( figure 3A ). Une fois que les îlots ont récupéré du processus d'isolement, ils ont l'air brillants e.......
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Discussion
La perfusion de pancréas et le temps de digestion sont deux paramètres clés qui affectent le rendement et la qualité des îlots. Moskalewski a d'abord signalé l'utilisation d'un mélange brut de collagénase pour digérer le pancréas haché du cobaye 11 . Lacy et al. A signalé l'injection d'enzymes dans le système de conduits pour perfuser le pancréas, ce qui a considérablement augmenté le rendement en îlot 12 . La perfusion ductal de l'enzyme p.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Les auteurs souhaitent remercier Wei Zhang de Guanhao Biotech pour la fourniture des échafaudages décellularisés. Nous remercions Xiao-hong Peng pour les discussions utiles. Cette recherche a été soutenue financièrement par la National Natural Science Foundation of China (Projet n ° 331322021).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Ciseaux de dissection | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0,5 mm de diamètre treillis métallique | Ningbo Medical | ||
| 70 &mu ; crépine à cellules m | Falcon | 352350 | |
| Pince hémostatique artère | Ningbo Medical | ||
| Pince hémostatique microscopique | Ningbo Medical | ||
| Pince hémostatique | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures ; | JINHUAN | Avec pince à l’aiguille | |
| Ningbo Medical | |||
| Coton-tige | Ningbo Medical Gaze Ningbo | ||
| Medical | |||
| Champs stériles | Ningbo Medical | ||
| Seringue de 10 ml | JINGHUAN | ||
| Seringue de 1 mL | JINGHUAN | ||
| Aiguille intraveineuse 27G | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 mL Tube Eppendorf | Axygen | ||
| 15mL tube conique | Corning | 430791 | |
| 50mL Tube conique | Corning | 430829 | |
| 35mm Non traité ; Péri-plats | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 &mu ; m filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL pipette sérologique | Corning | 4488 | |
| Remplisseuse de pipette S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20&mu ; L) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Microscope de dissection | Olympus | SZ61 | |
| Centrifugeuse | Eppendorf | 5810R | |
| Hank' solution saline équilibrée | Gibco | C14175500CP | |
| Collagénase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucomètre | Roche | ACCU-CHEK | |
| Pénicilline-streptomycine | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocine | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Hydrate de chloral | J& K | C0073 | |
| Citrate de sodium | Sigma | 71497 | |
| Acide citrique | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 semaines | VitalRiver | Beijing, Chine | |
| Échafaudage décellularisé | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, Chine |
Références
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al.
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Réimpressions et autorisations
