Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)

Jing Men; Jason Jerwick; Penghe Wu; Mingming Chen; Aneesh Alex; Yutao Ma; Rudolph E. Tanzi; Airong Li; Chao Zhou

doi:10.3791/55002

Article de méthode

Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)

DOI :

10.3791/55002

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12 décembre 2016

Jing Men¹^,² , Jason Jerwick²^,³ , Penghe Wu¹^,² , Mingming Chen³^,⁴ , Aneesh Alex²^,³ , Yutao Ma⁴ , Rudolph E. Tanzi⁵ , Airong Li⁵ , Chao Zhou¹^,²^,³

¹Bioengineering Program, Lehigh University, ²Center for Photonics and Nanoelectronics, Lehigh University, ³Department of Electrical and Computer Engineering, Lehigh University, ⁴State Key Laboratory of Software Engineering, Wuhan University, ⁵Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

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Ici, les protocoles expérimentaux sont décrits pour préparer la drosophile à différents stades de développement et effectuer une imagerie optique longitudinale des battements cardiaques de la drosophile à l’aide d’un système de microscopie à cohérence optique (OCM) personnalisé. Les changements morphologiques et dynamiques cardiaques peuvent être caractérisés quantitativement en analysant les paramètres structurels et fonctionnels du cœur à partir d’images OCM.

Résumé

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L’étude longitudinale du rythme cardiaque chez les petits animaux contribue à comprendre les changements structurels et fonctionnels au cours du développement cardiaque. Il a été démontré que la microscopie à cohérence optique (MCO) est capable d’imager des cœurs de petits animaux avec une résolution spatiale élevée et une vitesse d’imagerie ultra-élevée. Le contraste d’image élevé et les propriétés non invasives rendent l’OCM idéal pour effectuer des études longitudinales sans nécessiter de dissections ou de coloration des tissus. La drosophile a été largement utilisée comme organisme modèle dans les études sur le développement cardiaque en raison de son grand nombre de gènes de maladies humaines orthologues, de la similitude de ses mécanismes moléculaires et de ses voies génétiques avec les vertébrés, de son cycle de vie court et de son faible coût de culture. Ici, les protocoles expérimentaux sont décrits pour la préparation de la drosophile et l’imagerie optique du rythme cardiaque avec un système OCM personnalisé tout au long du cycle de vie de l’échantillon. En suivant les étapes fournies dans ce rapport, des images transverses en mode M et en 3D OCM peuvent être acquises pour mener des études longitudinales de la morphologie et de la fonction cardiaques de la drosophile. Les images OCM en coupe frontale et axiale ainsi que les histogrammes de fréquence cardiaque (FC) et de période d’activité cardiaque (CAP) ont également permis d’analyser les changements structurels cardiaques et de quantifier la dynamique cardiaque pendant la métamorphose de la drosophile, combinés aux vidéos construites avec des images en mode M pour suivre intuitivement l’activité cardiaque. En raison de la similitude génétique entre la drosophile et les vertébrés, l’étude longitudinale de la morphologie et de la dynamique cardiaques chez les mouches des fruits pourrait aider à révéler les origines des maladies cardiaques humaines. Le protocole ici fournirait une méthode efficace pour effectuer un large éventail d’études afin de comprendre les mécanismes des maladies cardiaques chez l’homme.

Introduction

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Étude longitudinale du cœur chez les petits animaux contribue à la compréhension d' une variété de maladies cardiovasculaires liées humaines, comme gènes liés à des malformations cardiaques congénitales ^1,2. Au cours des dernières décennies, divers modèles animaux, tels que le ^3,4 de la souris, Xenopus ^5,6, ^7,8 zebrafish, aviaire ^9, et Drosophila ^10-16, ont été utilisées pour mener le cœur du développement humain recherche liée. Le modèle de souris a été largement utilisé pour étudier le développement cardiaque normal et anormal et phénotypes de défauts cardiaques en raison de ses similitu....

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Protocole

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1. Préparation du système d'imagerie optique OCM de la drosophile ¹⁶

Sélectionnez un spectromètre et d' une caméra de balayage ligne à grande vitesse qui fournit un débit d'au moins 80 images / sec cadre de sorte que le système d'OCM sera en mesure de résoudre le battement de coeur de la drosophile.
Utiliser une source de lumière à large bande afin d' assurer la résolution axiale de 2 um pour identifier la structure du coeur de la drosophile.
Utilisez un objectif 10X pour obtenir une résolution transversale élevée.
Utilisez un miroir à 45 ° de la tige pour réfléchir le faisceau de lumière ....

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Résultats

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L'imagerie cardiaque longitudinale a été réalisée en utilisant les mouches des fruits avec le 24B-GAL4 / + déformation à température ambiante avec OCM. Les mesures ont été effectuées à L2, L3, et à des intervalles de 8 h de PD1 à PD4 et jour pour adultes 1 (AD1) pour suivre le processus de métamorphose (tableau 1). Larve, pupe tôt, fin pupe et les mouches adultes ont été montés sur les lames de verre comme on le voit sur la figure 1A. Les caractéristiques des segments du cœur pour les m.......

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Discussion

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L'accélération du rythme cardiaque de la drosophile, avec un HR maximum autour de 400 bpm à des stades larvaires et adultes, exige de la vitesse élevée d'imagerie pour résoudre les diastole cardiaques et systole (pas moins de 80 images / s basé sur les expériences). En raison de la faible épaisseur de la taille de la chambre cardiaque et micron échelle paroi cardiaque (5-10 um), une résolution spatiale élevée (supérieure à 2 pm) est nécessaire pour résoudre les structures tubulaires de coeur. Dans cette.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts lié à la présente étude.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le Lehigh University Start-Up Fund, le NIH (R00EB010071 à C.Z., R15EB019704 à C.Z. et A.L., R03AR063271 à A.L., et R01AG014713 et R01MH060009 à R.E.T.), la NSF (1455613 à C.Z. et A.L.), le Cure Alzheimer’s Fund (à R.E.T.) et le Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award à A.L.). M.C. et Y.M. a été soutenu par le National Key Basic Research Program de la Chine (programme 973) au titre de la subvention n° 2014CB340404.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système d’imagerie OCM personnalisé	Développé dans notre laboratoire
my Temp Mini Digital Incubator	Benchmark	H2200-HC
Verre de couverture	AmScope	200PCS
Cotton Ball	RITE AID
Instant Drosophila Formula	CAROLINA	formula 4-24
Yeast	ActiveDry
Microscope	SONY	WILD M420
Pinceau	Loew-Cornell	245B	utilisé pour déplacer des échantillons
Logiciel Labview	National Instruments
ImageJ	National Institutes of Health
Matlab	Mathworks
Pince à épiler	Wiha	AA SA	pour fixer le fruit ailes de mouche
FlyNap	Carolina Biological Supply Company	4 224 898
Scotch Permanent Double Face Tape, 3 M	Scotch
	Pipette Fisherbrand	MU18837
Organic Extra Coconut Oil	Spring Valley	13183
Microscope Slide	CapitolBrand	M3504-E
Drosophile Flacons	SEOH	8401SS
All-trans-retinal	Sigma-Aldrich Co.	R2500

Références

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Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. ....

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Mots-clés

C ur de Drosophila Imagerie de la fonction cardiaque Mode M transversal Imagerie OCM 3D Quantification de la fr quence cardiaque P riode d activit cardiaque M tamorphose de Drosophila Imagerie non invasive tude longitudinale

Drosophila Préparation et imagerie longitudinale de la fonction cardiaque in vivo en utilisant cohérence optique Microscopie (OCM)

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