Test de la capacité vasculaire invasive des cellules cancéreuses dans Zebrafish (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Résumé

Cette méthode utilise des embryons de poisson zèbre pour tester efficacement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses. les cellules cancéreuses fluorescentes sont injectées dans le sinus précardiaque ou de sac vitellin d'embryons en développement. cellule cancéreuse invasion vasculaire et une extravasation est évaluée par microscopie de fluorescence de la région de la queue 24-96 heures plus tard.

Résumé

L’invasion vasculaire et l’extravasation des cellules cancéreuses sont une caractéristique de la progression métastatique. Les modèles in vitro traditionnels d’invasion cellulaire cancéreuse de l’endothélium n’ont généralement pas la dynamique des fluides à laquelle les cellules envahissantes sont autrement exposées in vivo. Cependant, les systèmes in vivo tels que les modèles murins, bien que plus pertinents sur le plan physiologique, nécessitent des échelles de temps expérimentales plus longues et présentent des défis uniques associés à la surveillance et à l’analyse des données. Nous décrivons ici un test de poisson-zèbre qui cherche à combler cette lacune technique en permettant l’évaluation rapide de l’invasion vasculaire et de l’extravasation des cellules cancéreuses. L’approche consiste à injecter des cellules cancéreuses fluorescentes dans le sinus précardiaque d’embryons transparents de poisson-zèbre âgés de 2 jours dont le système vasculaire est marqué par un rapporteur fluorescent contrasté. Après l’injection, les cellules cancéreuses doivent survivre en circulation et s’extravaser ensuite des vaisseaux vers les tissus de la région caudale de l’embryon. Les cellules cancéreuses extravasées sont efficacement identifiées et notées dans les embryons vivants via l’imagerie par fluorescence à un moment précis. Cette technique peut être modifiée pour étudier l’intravasation et/ou la compétition entre un mélange hétérogène de cellules cancéreuses en changeant le site d’injection en sac vitellin. Ensemble, ces méthodes peuvent évaluer un comportement caractéristique des cellules cancéreuses et aider à découvrir des mécanismes indiquant une progression maligne vers le phénotype métastatique.

Introduction

La maladie métastatique est une cause majeure de mortalité et de nombreux mécanismes qui permettent la diffusion des cellules cancéreuses restent à découvrir ¹ cancer. Pour une cellule cancéreuse à métastaser avec succès, il doit tout d'abord envahir à travers le stroma entourant la tumeur primaire, entrer (intravasate) dans le système circulatoire, à survivre dans le transit, la sortie (extravasation) à partir de la circulation, et enfin d'établir une colonie viable sur le site de l' organe distant ^2. Intravasculaire et extravasation sont donc des étapes cruciales dans la cascade métastatique, mais toutes les cellules du cancer ne s....

Protocole

Déclaration d'éthique: embryons de poisson zèbre ont été générés selon un protocole IACUC approuvé. Ces expériences ont été réalisées en conformité avec les recommandations du Comité sur les soins et l'utilisation des animaux de l'Université de Georgetown.

1. Organiser Embryons pour injection et créer Stock Solutions

1. Générer des larves de poisson zèbre nécessaire pour évaluer la cellule cancéreuse invasion vasculaire.
   1. Mettre en place par paire ou d'un groupe en croix accouplement avec Tg (kdrl: grcfp) ZN1; mitfa ^b692; ednrb1 ^b140 poissons.
      NOTE: No....

Résultats

Ici nous avons testé la capacité invasive vasculaire des lignées cellulaires de cancer du sein couramment utilisés dans un modèle d'embryon de poisson zèbre (figure 1). critères rigoureux ont été utilisés dans la notation extravasation pour ces différentes lignées cellulaires, où les événements positifs ont été seulement comptés si les cellules cancéreuses avaient clairement extravasation, cet être fait surtout de limiter les faux positifs qui pourraient découler de .......

Discussion

Cette technique utilise le modèle zebrafish pour tester efficacement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses (voir Figure 1). Ici , nous avons appliqué la technique à un panel de lignées cellulaires de cancer du sein, afin de fournir une base sur laquelle d' autres chercheurs peuvent alors construire leurs propres études (voir le tableau 1, figures 2 - 3). L'observation que MDA-MB-231 cellules facilement envahi dans la région caudale d'embry.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % Trypsine-EDTA	Life Technologies	25300-054
Plats de 100 mm	Corning Incorporated	3160-100
Pipettes jetables 5 3/4" Pastur, verre borosilicaté	Fisher Brand	13-678-20B
Plat de 60 mm	Corning Incorporated	3160-60
Agarose, à faible point de fusion	Fisher	BP165-25
Agarose, qualité moléculaire	Bioline	BIO-41026
Verre capillaire, standard, 1,2 mm x 0,68 mm, 4"	A-M Systems, Inc	627000
David Kopf 700C Extracteur de pipette vertical Hofstra	Group	3600
DMEM	Life Technologies	11995-065
Pot de stockage d’électrodes, 1,0 mm	World Precision Instruments, Inc	E210
Ethyl 3-aminobenzoate de méthanesulfonate sel (Tricaïne, MS-222)	Fluka	A5040
Brosse à cils	Ted Pella, Inc	113
Sérum fœtal bovin, chaleur inactivée	Omega Scientific	FB-12
Fisherbrand Pipettes de transfert	ThermoFisher Scientific	13-711-7M
Gel Chargement Pipette	Fisher Brand	02-707-181
Plats à fond en verre (12,0 mm)	ThermoFisher Scientific	150680
Lame de dépression en verre	VWR	470005-634
Sel de mer instantané	Pentair	IS50
Ampoules en caoutchouc latex, 2 ml, paquet de 72	Heathrow Scientific	HS20622B
SP8 Microscope confocal	Leica
Micromanipulateur	Narishige
Eclipse E600	Nikon
PBS	Life Technologies	10010-023
Pénicilline-G Potassium	Fisher Biotech	BP914-100
Plaques de Pétri, 100 mm x 15 mm	Fisher Brand	;
Picospritzer II	General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium  ;	Life Technologies	11875-093
Sulfate de streptomycine	Fisher Biotech	BP910-50
Vybrant DiI	ThermoFisher Scientific	V22885
Vybrant DiO	ThermoFisher Scientific	V22886
Zebrafish  ;	Les
lignées cellulaires ont été maintenues en DMEM + 10 % FBS, avec l’attente de cellules BT-474 et HCC18-6, qui ont été maintenues en RPMI + 10 % FBS.

, sel de mer FB0875713