Une méthode efficace pour l'isolement de l'ARN hautement purifiées de semences pour une utilisation dans quantitative transcriptome Analyse

Résumé

Nous avons réussi à établir une méthode d’isolement de l’ARN à partir de graines de plantes contenant de grandes quantités d’huiles, de protéines et de polyphénols, qui ont des effets inhibiteurs sur l’isolement d’ARN de haute pureté. Notre méthode est adaptée au suivi de l’expression de gènes avec des transcrits de faible niveau dans les graines.

Résumé

Les graines de plantes accumulent de grandes quantités de réserves de stockage composées de matière organique biodégradable. Les humains dépendent des réserves de stockage de graines pour se nourrir et comme matériaux industriels. Les profils d’expression génique sont des outils puissants pour étudier la régulation métabolique dans les cellules végétales. Par conséquent, des profils d’expression génique détaillés et précis pendant le développement des semences sont nécessaires pour la sélection des cultures. L’acquisition d’ARN hautement purifié est essentielle à la production de ces profils. Des méthodes efficaces sont nécessaires pour isoler l’ARN hautement purifié des graines. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler l’ARN de graines contenant de grandes quantités d’huiles, de protéines et de polyphénols, qui ont des effets inhibiteurs sur l’isolement d’ARN de haute pureté. Notre méthode permet d’obtenir de l’ARN hautement purifié à partir de graines sans utiliser de phénol, de chloroforme ou de procédés supplémentaires pour la purification de l’ARN. Cette méthode est applicable aux graines d’Arabidopsis, de colza et de soja. Notre méthode sera utile pour suivre les profils d’expression des transcrits de faible niveau dans les graines en développement et matures.

Introduction

Les plantes produisent des graines, qui donnent naissance à la prochaine génération. Graines accumulent de grandes quantités de réserves de stockage, tels que des huiles, des glucides et des protéines, pour la croissance post-germinative. Les humains utilisent les semences des réserves de stockage en tant que sources d'alimentation humaine et animale, et donc des graines de plantes sont l'un des principaux fournisseurs de la matière organique comestible dans le monde entier. L'augmentation des rendements de semences est un défi important dans la science des plantes.

Puisque les réserves de stockage des semences sont des sources de valeur commerciale de nourriture et de matériaux industriels, les mécanismes moléculaires sous - jacents de la régulation du métabolisme de ces réserves ont été largement étudiés ^1-6. élucidant En outre, ces mécanismes seront utiles pour augmenter les rendements de semences dans les cultures. Les graines se développent dans les ovaires de la plante après la fécondation, et ils mûrissent à travers une série de stades de développement ^1,6,7. comprendre en outre le développement de mécanisme moléculaire sous-jacent de semences nécessite détaillée, Les profils d'expression génique précises d'une série de graines en développement à produire. Toutefois, les grandes quantités d'huiles, des protéines, des glucides et des polyphénols dans les graines de la plante, il est difficile d'isoler l'ARN hautement purifié, ce qui empêche le profilage précis de l'expression génique.

Ici, nous présentons un procédé efficace pour l'isolement d'ARN à partir de graines oléagineuses contenant de grandes quantités d'huiles, de protéines et de polyphénols. En utilisant cette méthode, les chercheurs seront en mesure de préparer l'ARN hautement purifié. Un tel ARN sera utile pour le suivi des changements de transcription dans les gènes clés qui contrôlent la régulation métabolique des réserves de stockage des semences dans le développement et les oléagineux matures.

Protocole

1. Extraction de l'ARN total à partir de graines végétales

1. Préparer des ensembles de tampons, des colonnes de spin, 1,5 et 2,0 ml tubes en polypropylène, et des tubes de 1,5 mL polypropylène sans nucléase.
2. Ajouter 1% (p / v) de polyvinylpyrrolidone de grade biologie moléculaire (appelé ci-après PVP) à la cellule tampon de lyse pour extraction d'ARN et vortexer vigoureusement. Incuber pendant 20 min à 25 ° C pour dissoudre complètement. Au bout de 20 minutes d'incubation, mélanger doucement le tampon en faisant tourner le tube à l'envers pour empêcher la formation de bulles. Stocker à température ambiante (15-25 ° C) avant utilisation.
3. Fruits de récolte de plantes d' Arabidopsis thaliana et les placer dans 1,5 ml polypropylène tubes sur la glace. Placer les fruits sur des plaques d'aluminium maintenues à 4 ° C et à isoler les graines des fruits sous un microscope stéréo.
   1. Placez les graines isolées (environ 200 graines) dans 1,5 ml des tubes en polypropylène qui ont été stockés dans un rack d'aluminium sur la glace et placer les tubes dans un liquide n immédiatementitrogen.
4. Retirer les tubes de l'azote liquide et les retourner à la grille d'aluminium sur la glace. Ajouter 100 pi de tampon contenant 1% de PVP et centrifuger pendant 1 min à 1000 x g à 4 ° C.
5. Homogénéiser l'échantillon avec un pilon en acier inoxydable en utilisant un moteur broyeur pendant 60 secondes tout en maintenant le tube dans la grille en aluminium sur la glace.
6. Ajouter 550 pi de tampon contenant 1% de PVP, mélanger le tampon doucement en tournant le tube à l'envers, et incuber pendant 10 min à 25 ° C.
7. Centrifuger pendant 5 min à 8000 x g à 25 ° C et de transfert 550 ul du surnageant dans un nouveau tube de polypropylene de 1,5 ml.
8. Centrifuger pendant 5 min à 10 000 g à 25 ° C et de transfert 450 ul du surnageant dans un nouveau tube de polypropylene de 1,5 ml.
9. En utilisant le surnageant comme le lysat cellulaire pour l'extraction d'ARN. Ci-après, suivre la procédure décrite dans les instructions du fabricant dans le kit disponible dans le commerce.
10. éluerL'ARN en utilisant un volume minimal de tampon d'élution afin d'assurer une concentration suffisamment élevée de l'ARN pour surveiller les profils d'expression des transcrits de bas niveau. Stocker l'ARN dans un congélateur jusqu'à utilisation.

2. Vérification de l'ARN Qualité

1. Décongeler l'ARN total, mélanger en tapotant doucement et placer le tube dans un rack en aluminium sur la glace.
2. Mesurer la concentration d'ARN, le rapport A260 / A280 et le rapport A260 / A230 en utilisant un spectrophotomètre microvolume.
3. Diluer l'ARN total dans l'eau sans RNase à une concentration finale de 70 ng / ul.

3. Transcription inverse de l'ARN total à partir de graines

1. Décongeler les ARN et tampons totaux ensembles à partir du kit commercial. Gardez les enzymes du kit sur la glace après tapotant doucement. Préparer des tubes de 0,2 mL polypropylène sans nucléase.
2. Ajouter 5 ul de l'ARN total, 1 pl de Oligo dT (50 uM), et 1 uM de Random 6-mer (50 uM) à la mL polypropy 0,2tube lene sur la glace.
3. Incuber pendant 15 min à 37 ° C et placer sur la glace.
4. Ci-après, suivre la procédure décrite dans les instructions du fabricant dans le kit de transcription PCR inverse.
5. Placer les produits de transcription inverse sur la glace avant utilisation.

4. Analyse quantitative PCR en temps réel

1. Construire des plasmides hébergeant les séquences du gène cible en utilisant le protocole du fabricant.
2. Ajustez les concentrations de 100-500,000 copies / ul pour les modèles d'ADN pour les courbes standard.
3. La dilution des solutions d'ADNc (1: 100) avec de l'eau distillée.
4. Ajouter 2 ul des solutions d'ADNc dilué et les plasmides pour les courbes standard au mélange maître de la trousse quantitative PCR en temps réel.
5. Mettre en place la PCR en temps réel en utilisant les conditions suivantes à vélo: 95 ° C pendant 30 s, puis 40 cycles à 95 ° C pendant 5 s et 60 ° C pendant 35 s.
6. Analyser les nombres de copies selon l'hommeles instructions données par le fabricant du système de PCR en temps réel.

Résultats

Nous avons d' abord étudié la concentration optimale de PVP à l' aide de graines matures Arabidopsis. L'ARN total a été isolé à partir d'environ 1000 graines selon le protocole décrit ci-dessus en utilisant un tampon de lyse cellulaire contenant 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% ou 2,0% de PVP. Après homogénéisation et centrifugation, le surnageant a été recueilli , tout en évitant la couche d'huile et des débris de graines (figure 1A).

Discussion

les profils d'expression des gènes contribuent à notre compréhension de la physiologie des plantes; Par conséquent, les méthodes d'isolement d'ARN spécifiques ont été développés pour chaque condition échantillon ^9-12. Nous avons étudié les processus qui ont été inhibée lors de l'isolement de l'ARN à partir de graines et ont trouvé que la liaison ARN aux membranes de silice a été sévèrement inhibée. De grandes quantités d'huile, les protéines et les polyphénols inhibent l'isolement ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904
polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P5288-100G
HOMOGÉNÉISATEUR S-303	AS ONE	1-1133-02
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent kit (Perfect Real Time)	TAKARA	RR037A
KAPA SYBR Kit qPCR rapide	Kapa biosystems	KK4601